Name: Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a quantificar a adesão celular de linfócitos T humanos usando o ensaio de adesão estática com marcação por fluorescência CFSE. Este método fornece dados quantitativos sobre interações celulares em imunologia.

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Hirschil Trust, Michael Saperstein médicos Scholars Fundos de Pesquisa, ea comunhão NYU Whitehead apoiaram este trabalho.

1. O revestimento das microplacas Poços Nota: O objectivo deste passo é o de revestir as superfícies de poliestireno com ICAM-1 e servem como ligandos para as células T LFA-1. <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ol><li> Preparar a solução de revestimento por ressuspensão recombinante de ICAM-1 com a solução (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) tampão fosfato salino enriquecido com cálcio (1 mM CaCl2) e magnésio (2 nM de MgCl 2). Certifique-se de que a concentração final de ICAM-1 é de 10 ug / ml, feito a partir de uma solução de estoque de 0,7 mg / ml e mantidas em um congelador a -80 ° C. </li><li> Preparar a solução de adesão, através do enriquecimento de PBS com 0,5% de humano (ou de bovino) de albumina sérica humana (HSA / BSA), MgCl2 2 mM, e 1 mM de CaCl2. </li><li> Preparar a solução de lavagem através da adição de 2 mM de MgCl2 e 1 mM de CaCl2 a PBS. Aqueça todas as soluções para 37° C antes do uso. </li></ol></li><li> Lavar as placas com 24 poços com 50 mL de solução de lavagem. Isso irá incluir poços não lavados, (PMA) trataram células positivas e (poços não revestidos) negativos controles. Para cada condição de definir pelo menos três poços (triplas). </li><li> Adicionar 50 ul de solução de revestimento, para cada poço. Não adicione aos poços de controlo não revestidos. Incubar durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora. </li><li> Aspirar suavemente a solução de revestimento, sem que a ponta para tocar no fundo dos poços. Lavar uma vez com 50 ul de solução de lavagem. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de adesão e incubar a microplaca durante uma hora a 37 ° C no interior da incubadora. </li><li> Aspirar suavemente e lave uma vez com 50 mL de solução de lavagem. Usar a placa no mesmo dia, no entanto, é possível manter a 4 ° C durante a noite, e usá-lo no dia seguinte. </li></ol> 2. T o isolamento de células a partir de sangue <ol><li> Adicionar humano T enriquecimento célula coquetel em 50 ul / ml of sangue inteiro (por exemplo por 3 ml de anticoagulante (heparina, EDTA, ou citrato) de sangue total, adicionar 150 mL de cocktail). Misture bem. </li><li> Incubar 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Para um tubo de centrífuga de 50 ml adicionar 3 ml de sangue tratado e um volume igual de PBS (sem cálcio e magnésio) enriquecido com 1% de D-glucose, à temperatura ambiente. Misture delicadamente com uma pipeta Pasteur. </li><li> Adicionar 15 ml de Ficoll-Paque PLUS para o tubo de centrífuga. </li><li> Camada cuidadosamente os 6 ml diluído amostra de sangue no meio de isolamento de linfócitos. </li><li> Centrifugar a 400 xg por 20 min a 20 ° C, com pausa fora. </li><li> Decantar a camada superior com uma pipeta de Pasteur limpa, deixando a camada de linfócitos não perturbada na interface. Se a camada superior de plasma pode ser guardado para uso posterior. Utilizando uma pipeta de Pasteur limpa transferir a camada de linfócitos para um tubo de centrífuga limpo. </li><li> Adicionar 3 volumes (9 ml) de PBS para os linfócitos. Suspender as células suavemente draala-los dentro e para fora de uma pipeta de Pasteur. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 20 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante. Os linfócitos deve agora ser suspensos no meio apropriado para a aplicação. Transferência das células para um balão de cultura T-75, em 20 ml de RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina. </li></ol> 3. Preparação das Células Nota: Um pré-requisito é de que as células a ser marcado com um reagente fluorescente. Neste protocolo usar carboxi éster succinimidyl fluoresceína (CFSE), proteína fluorescente no entanto verde (GFP) são células que expressam uma alternativa aceitável. <ol><li> Contagem de 2,4 x 10 6 células T (1 x 10 5 para cada poço) usando um hemocitômetro. </li><li> Ressuspender as células em meio de cultura sem soro (privação de soro). Incubar as células durante 2 horas na incubadora a 37 ° C. </li><li> Centrifugar as células durante 5 min (400 xg). Aspirar a mídia eressuspender em 1 ml de PBS. </li><li> Adicionar CFSE em 1:1.000 diluição (estoque feito para 5 mM). Cubra de luz e incubar durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Parar a reacção por adição de 10 ml de 37 ° C, PBS e girar a 400 xg durante 5 min. </li><li> Re-suspender a pelete de células com 1,2 ml de solução de adesão pré-aquecido (1 x 10 5 células por 50 pi). </li></ol> 4. Estimulação das células Nota: Para iniciar a adesão, as células devem ser estimuladas. Na experiência seguinte, as células são estimuladas através do TCR utilizando anticorpos anti-CD3 de reticulação, no entanto, solúveis SDF-1 pode servir como uma alternativa. Dependendo do objetivo dos experimentos, vários reagentes farmacológicos pode ser adicionado antes ou durante a estimulação para estudar o impacto na adesão celular. Forbol miristato acetato de forbol (PMA) é um éster de forbol que é estruturalmente semelhante ao do segundo mensageiro diacil glicerol (DAG) e, por conseguinte, activa quinase múltiplas a jusante do TCR (principalmente proteína cinase C); aqui é usado como um controlo positivo. <ol><li> Aquece-se a microplaca a 37 ° C. </li><li> Dividir as células em 8 vazios tubos de 1,5 ml (150 ul em cada tubo), um tubo para cada condição. </li><li> Tratar as células em conformidade: <ol><li> Estimular um tubo com PMA a 10 ng / ml para servir como controlo positivo. Mantenha três tubos sem tratamento, para servir como controle de estímulo (&quot;nenhum estímulo&quot;), controle de carga sujo (&quot;sem lavagem&quot;), e controle para ICAM-1 revestimento (&quot;sem revestimento&quot;). </li><li> Estimular quatro tubos com diferentes concentrações de anticorpos anti-CD3 (0,1, 1, 5, e 10 ug / ml). Continue para a próxima etapa, sem atrasos. </li></ol></li><li> Alíquota de 50 mL de mistura de células estimuladas em cada poço vazio. O número final de células por cavidade é de 1 x 10 5. </li><li> Coloque a microplaca na incubadora 37 ° C por 15 min. Nota: Algumas linhas de células T requerem menor estimulação<html> tempo ção. Durante este tempo, as células vão estabelecer-se para o fundo dos poços e aderir aos ligandos-alvo. </li></ol> 5. Lavar células não aderentes Nota: O objetivo deste passo é remover as células que não foram capazes de formar contactos estreitos com as superfícies recobertas pelo ligante. Usar uma pipeta de canais múltiplos para este passo, a fim de assegurar que as mesmas forças físicas são aplicados a todos os poços. É importante manter os poços de controlo indicados unwashed para auxiliar no cálculo da percentagem de células aderentes. <ol><li> Adicione 150 ml de solução de aderência quente para cada poços. Agitar a placa suavemente durante alguns segundos antes de remover o meio dos poços. Não toque no fundo dos poços com as pontas. </li><li> Repita este passo três vezes. Mude a direção da pipeta ao pipetar o buffer de entrada e saída. </li></ol> 6. Determinação da percentagem de células aderentes _content &quot;&gt; Nota: Neste passo um leitor de placas de fluorescência é usado para medir a intensidade de fluorescência dentro de cada poço a intensidade está em correlação directa com o número de células aderentes.. <ol><li> Ligue o leitor de placas. Abra o software leitor de placas, clicando no ícone de atalho na área de trabalho. <ol><li> No menu &quot;Tarefas&quot;, clique em &quot;Novo&quot; para criar um novo protocolo. </li><li> A partir do menu &quot;Ações&quot;, escolha a opção &quot;Read&quot;. Clique em &quot;A intensidade de fluorescência&quot; e clique na aba &quot;Ok&quot;. </li><li> A partir do menu drop-down selecione &quot;comprimento de onda de excitação 485&quot; e &quot;Emissão de comprimento de onda 528&quot;. Hit na guia &quot;Ok&quot;. </li><li> No menu de opções &quot;Óptica&quot;, selecione &quot;Bottom&quot; e clique na aba &quot;Ok&quot;. Volte ao menu &quot;Ações&quot; e definir a temperatura a 37 ° C e clique em &quot;Ok&quot;. </li><li> Insira a microplaca no leitor de placa eclique em &quot;Executar&quot;. O resultado será exportado para planilha excel. </li></ol></li><li> Calcula-se a percentagem de células aderentes utilizando a seguinte fórmula: Percentagem de células aderentes = (média intensidade de fluorescência lida em poços lavados) / (média intensidade de fluorescência lida em células não lavadas) x 100%. </li></ol>

<ol><li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+in+motion%3A+migrating+toward+improved+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li>
<li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li>
<li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li>
<li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem diversos ensaios para estudar os sinais de LFA-1 a activação e a adesão de células T 12. A citometria de fluxo é utilizada para medir a LFA-1 estados de afinidade em células vivas, utilizando anticorpos monoclonais que se ligam selectivamente, quer dobrado ou estendido a LFA-1. Uma das limitações deste método é que ele não leva em conta a avidez dos integrinas. Ensaios de migração são ferramentas úteis, mas eles medem a migração, e não adesão desprezível em um ponto de tempo específico. Modelos de rat...

Linfócitos T aderência é um processo fundamental para a resposta imune 1. É necessário para a interacção das células T com as células endoteliais decoração nas paredes dos capilares, para o antigénio de células apresentadoras de varrimento (APC) dentro de nódulos linfáticos, e para a formação de sinapses imunológicas (IS), com células-alvo 2. Estes requisitos são funcionalmente e cineticamente distintas. O processo de linfócitos extravasamento consiste quimioatração, rolamento, adesão firme e transmigração. A transição a partir de rolamento para firmar aderência requer as células T de responder a um sinal de receptor acoplado a proteína G rapidamente. Esta resposta produz uma interação ligante integrina que retarda e prisões da célula de rolamento 3. Uma mudança imediata na avidez integrina medeia este processo. A migração requer interacções betweenTcells dinâmicos e células endoteliais com a formação de aderências no &#39;front end &quot;e quebra de aderências no&#39; extremidade traseira &#39;com um intervalo de cerca de um minuto entre a formação e quebra 4. O IS constitui inminutes, mas precisa permanecer intacta por horas 6. Curiosamente, uma molécula de adesão, a função de membro da família de linfócitos integrina antígeno associado (LFA) - 1, é essencial para todos estes processos 5. LFA-1 medeia a adesão através de interacções com vários membros da superfamília das imunoglobulinas. O ligando mais extensivamente estudado com a mais elevada afinidade para o LFA-1 é a molécula de adesão intercelular (ICAM) -1. Linfócitos circulantes não-activadas expressam baixa afinidade de LFA-1 na superfície das células, e, por conseguinte, não são capazes de aderir a superfícies revestidas de ICAM-1. LFA-1 é de afinidade variável e regulada por vários eventos de sinalização, tais como a proteína G acoplado a activação do receptor, estimulação de citoquinas, e os sinais mediados pelos receptores das células T (TCR). A forma de afinidade elevada, resultante da LFA-1 transmite activação intracelular para o espaço extracelular tinteracções hrough com ICAM-1. Este caminho é chamado de dentro para fora sinalização 7. Do mesmo modo, a sinalização através de LFA-1 a partir do espaço extracelular é chamado de fora para dentro de sinalização. O cascatas de sinalização intracelular envolvidas na de dentro para fora e de fora para dentro de sinalização são um grande foco de pesquisa atual. A pequena GTPase Rap1 surgiu recentemente como o componente chave de dentro para fora sinalizando que é comum a ambos ligadura TCR e citocina sinalização 8. O papel crítico da Rap1 na activação de integrina é realçada pela descoberta de que a sobre-expressão de Rap1 estimula a adesão dependente de integrina de células T, enquanto que a adesão de células T é bloqueada através da expressão de Rap1 dominante negativa 9. Esses avanços em nossa compreensão da regulação integrina por Rap1 ter sido realizado utilizando em ferramentas vitro. Entre elas, está o ensaio de adesão estático descrito aqui. O objetivo geral deste método é estudar Tadesividade de células a ICAM-1 as superfícies revestidas. Mais especificamente, é utilizado para medir e quantificar objectivamente LFA-1 de afinidade para com os seus ligandos de contador em células vivas em tempo real, sob diferentes condições. Esta técnica utiliza poços de poliestireno revestidas com ICAM-1, para imitar as superfícies celulares que as células T interagem com. Muitos ensaios de adesão de células T estático anteriormente descritos foram experimentalmente complexo. Estes ensaios frequentemente requeridos para as células T a ser marcado radioactivamente, utilizado células da córnea de bovino em cultura para criar uma matriz extracelular como o substrato para a aderência das células T, ou chamados para a estimulação não-fisiológico de células T durante um período prolongado para promover a adesão de células T 10. A utilização de medição fluorométrico para quantificar as células T após a incubação de adesão é um método mais sensível e precisa de quantificação, em comparação com a citometria de fluxo e microscopia, que são utilizados em muitos outros sistemas de ensaio 11. Além disso, uma única célula microscopic análise de integrina localização não permite a ampla, a análise da população com base na mesma maneira como a medição f luorométrica. Enquanto que os anticorpos específicos do Estado de LFA-1 de activação estão comercialmente disponíveis, estes anticorpos oferecer uma baixa sensibilidade em relação com o método descrito aqui. A principal vantagem sobre as técnicas alternativas é a sua simplicidade e a capacidade de analisar múltiplas condições experimentais simultaneamente. Ao considerar este método para uma aplicação específica, deve-se levar em conta que as células T devem ser selecionados de forma negativa, recentemente isolado, e marcadas com um marcador fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Leitor de placas</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Pipeta</td> multicanal híbrida <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 poços com fundo óptico</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1 recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-CD3</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS contendo cálcio e magnésio</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>Linfócitos periféricos</td><td>por exemplo camundongo ou humano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 software</td><td>BioTek</td><td>Versão 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 e 50 ml</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de plástico descartáveis Pasteur Frascos</td> de cultura <td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Kit de enricment de células T</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

estática adesão ensaio para o estudo da integrina ativação em linfócitos t

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Adesão de linfócitos T é necessária para várias funções das células T, incluindo a migração para os locais de inflamação e formação de sinapses imunológicas com células apresentadoras de antigénios. As células T realizar adesão regulada através do controlo das propriedades adesivas de integrinas, uma classe de moléculas de adesão celular que consistem de pares heterodiméricas de proteínas transmembranares que interagem com moléculas-alvo de células parceiras ou matriz extracelular. O mais proeminente a integrina da célula T é a função dos linfócitos antigénio associado (LFA) -1, composta por subunidades aL e β2, cujo alvo é a molécula de adesão intracelular (ICAM) -1. A capacidade de uma célula T para controlar a aderência deriva da capacidade para regular os estados de afinidade de integrinas individuais. Sinalização dentro para fora descreve o processo pelo qual os sinais dentro de uma célula com que os domínios externos de integrinas para assumir um estado activado. Muito do nosso conhecimento destes fenómenos complexos é baseada na mecânicaEstudos realizados em simplificada em sistemas de modelo in vitro. O ensaio de adesão de linfócitos T descrito aqui é uma excelente ferramenta que permite que as células T para aderir a moléculas alvo, sob condições estáticas, e, em seguida, utiliza um leitor de placas fluorescente para quantificar a adesividade. Este ensaio tem sido útil na definição de substâncias de adesão-estimulador ou inibidor que actuam sobre os linfócitos, assim como a caracterização dos eventos de sinalização envolvidos. Embora descrito aqui para LFA-1 - ICAM-1 de adesão mediada; este ensaio pode ser facilmente adaptada para permitir o estudo de outras interacções adesivas (por exemplo, VLA-4 - fibronectina).

Abaixo está um exemplo de ensaio de adesão usando células T primárias estimuladas com várias concentrações de anticorpos anti-CD3. É útil saber a fluorescência das células não lavadas (isto é, a carga total). As células não estimuladas servir como um controle negativo e células tratadas com PMA são o controlo positivo para anticorpos anti-CD3. As células plaqueadas em poços não-revestidos servir como um controlo para a ICAM-1. Numa experiência típica, a percentagem de células tratadas com PMA aderentes é entre ...

Ensaio de adesão estático é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para modelar as interacções entre linfócitos T e de outros tipos de células. Interacções são geradas por injecção de células T marcadas em poços revestidos com moléculas de adesão, enquanto que um leitor de placa é utilizada para quantificar o número de células aderentes a seguir lavagens em série.

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a adesão celular. Isso é realizado primeiramente revestindo uma microplaca de 96 poços com moléculas de adesão no segundo passo. Linfócitos T humanos primários são isolados do sangue e marcados com CFSE.Em seguida, os linfócitos T são estimulados com tratamentos para afetar sua adesividade. Na etapa final, as células tratadas são adicionadas à microplaca e permite-se que a adesão ocorra. Por fim, a quantidade de fluorescência por poço pode ser medida para determinar a porcentagem de células aderentes por condição de tratamento.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a adição de linfócitos T para modelar anterium, é que não é necessária a cocultura de linfócitos T e células erl. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como, por exemplo, como fármacos específicos afetam a adesão de linfócitos? Embora este método possa fornecer informações sobre a biologia de linhas de pé, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células, como neutrófilos.A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos são difíceis de dominar e exigem precisão e habilidade.

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Imunologia e Infecção

Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos...

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Aqui apresentamos um método simples e rápido para caracterizar as propriedades adesivas intrínsecas de moléculas putativas de adesão celular.  O ectodomínio secretado e marcado com epítopos de uma molécula de adesão celular é capturado do meio de cultura em grânulos funcionalizados pequenos e uniformes.  Esses grânulos podem então ser usados imediatamente em ensaios simples de agregação de grânulos.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Tensão de integrina tem um papel importante em várias funções da célula. Com um sensor de tensão Integrativa, integrina tensão é calibrado com sensibilidade de picoNewton (pN) e cuja imagem em resolução de submicron.

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

A superfície TGT é uma plataforma inovadora para estudar o crosstalk fator de crescimento integrin. O design flexível da sonda, a especificidade do ligante de adesão e a modulação precisa das condições de estimulação permitem avaliações quantitativas robustas da interação EGFR-integrin. Os resultados destacam a EGFR como uma mecânica integrin de ajuste 'mecano-organizador', influenciando a montagem de adesão focal e a disseminação celular.

Sondas de tether medidor de tensão para quantificar fator de crescimento mediado mecânica integrin e adesão

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

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