Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a adesão celular. Isso é feito primeiro revestindo uma microplaca de 96 poços com moléculas de adesão na segunda etapa. As células T humanas primárias são isoladas do sangue e marcadas com CFSE.

Em seguida, as células T são estimuladas com tratamentos para afetar sua adesividade. Na etapa final, as células tratadas são adicionadas à microplaca e a adesão é permitida. Em última análise, a quantidade de fluorescência por poço pode ser medida para determinar a porcentagem de células aderentes por condição de tratamento.

A principal vantagem desta técnica sobre o método existente, como adição de células T ao modelo e anterium, é que a cocultura de células T e células erl não é necessária. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como como medicamentos específicos afetam a adesão dos linfócitos? Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia do pé de linha, ele também pode ser aplicado a outras células maie, como neutrófilos.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas são difíceis de dominar e exigem precisão e habilidade Para codificar uma microplaca com as moléculas de adesão, comece lavando 24 poços de uma placa de 96 poços com 50 microlitros de solução de lavagem e, em seguida, incube cada poço, exceto os poços de controle não revestidos, com 50 microlitros de solução de revestimento por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire suavemente a solução de revestimento sem permitir que a ponta da pipeta toque o fundo dos poços. Em seguida, depois de lavar os poços com mais 50 microlitros de solução de lavagem, incube a microplaca com 50 microlitros de solução de adesão por poço.

Novamente, a 37 graus Celsius. Após uma hora, aspire suavemente a solução de adesão e lave os poços mais uma vez com 50 microlitros de solução de lavagem Para isolar as células T, primeiro misture completamente 50 microlitros de coquetel de enriquecimento de células T humanas por cada mililitro de sangue total e, em seguida, incube o sangue tratado por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione seis mililitros do sangue tratado e um volume igual de PBS livre de cálcio e magnésio enriquecido com glicose 1%D a um tubo cônico de 50 mililitros em temperatura ambiente e misture a solução suavemente.

Em seguida, adicione 15 mililitros de preparação de linfoma a um tubo cônico fresco de 50 mililitros e coloque cuidadosamente a amostra de sangue diluída no meio de isolamento de linfócitos. Separe as camadas celulares por 20 minutos a 400 vezes G e 20 graus Celsius com a interrupção. Em seguida, use uma pipeta de paster fresca para remover a camada superior, deixando a camada de linfócitos intacta na interface.

Transfira a camada de linfócitos para um novo tubo cônico com uma nova pipeta de pester. Adicione nove mililitros de PBS aos linfócitos e, em seguida, distribua uniformemente as células por toda a suspensão, puxando-as suavemente para dentro e para fora. Gire as células para baixo e, em seguida, ressuspenda o pellet no meio.

Em seguida, distribuir as células para um balão de cultura T 75. 20 mililitros de meios de cultura para estimular as células após o período de cultura adequado. Primeiro, adicione meio livre de soro a 2,4 vezes 10 às seis células T e, em seguida, o soro deixe as células morrerem de fome em uma incubadora de 37 graus Celsius.

Após duas horas, gire as células e ressuspenda o pellet. Em um mililitro de PBS, rotule as células com um marcador fluorescente no escuro por oito minutos à temperatura ambiente e, em seguida, interrompa a reação adicionando 10 mililitros de PBS a 37 graus Celsius. Em seguida, depois de girar as células, ressuspenda o pellet em 1,2 mililitros de solução de adesão pré-quente.

Aqueça a microplaca revestida a 37 graus Celsius e, em seguida, divida as células em oito alíquotas de 150 microlitros em 1,5. Os tubos de mililitro estimulam um tubo com PMA a 10 nanogramas por mililitro para servir como controle positivo. Deixe três tubos sem tratamento para atender ao controle de estimulação, ao controle de carga não lavado e ao controle de ICAM um revestimento e estimule quatro tubos com diferentes concentrações de anticorpos anti-CD três.

Em seguida, alíquota imediata de 50 microlitros de uma vez 10 elevado à quinta célula por poço das misturas de células estimuladas nos poços apropriados na microplaca e incube a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Para determinar a porcentagem de células aderentes primeiro, lave cada poço com 150 microlitros de solução de adesão quente. Agite a placa suavemente por alguns segundos e, em seguida, aspire cuidadosamente o meio de cada poço sem tocar no fundo dos poços com as pontas da pipeta.

Repita a lavagem três vezes, alterando o ângulo da pipeta a cada aspiração. Em seguida, ligue o leitor de placas e abra o software de leitura de placas no menu de tarefas. Clique em novo para configurar um novo protocolo.

Em seguida, no menu de ações, selecione a opção de leitura. Clique em intensidade fluorescente e clique em OK. Insira o comprimento de onda de excitação como 485 e o comprimento de onda de emissão como 528.

Em seguida, no menu de opções ópticas, selecione a parte inferior e clique em OK. Em seguida, volte ao menu de ações e defina a temperatura para 37 graus Celsius e clique em ok. Por fim, carregue a microplaca e clique em executar.

Depois de exportar os resultados para uma planilha, use a fórmula para calcular a porcentagem de células de adesão nessas imagens. Um exemplo de um ensaio de adesão usando células T primárias, estimuladas com várias concentrações de anticorpos anti CD três é mostrado. As células não estimuladas servem como controle negativo.

As células tratadas com PMA servem como controle positivo Para os anticorpos anti CD três, a tabela exibe as intensidades relativas de fluorescência da CFSE. Células T primárias marcadas estimuladas com diferentes doses de anticorpos anti CD três solúveis e plaqueadas em poços revestidos com IAM one. Para cada condição, a intensidade média dos poços triplicados pode ser calculada e convertida na porcentagem relativa do total de células carregadas.

Em um experimento típico, a porcentagem de células aderentes tratadas com PMA está entre 40 a 50%, enquanto a porcentagem de células não estimuladas está entre cinco a 10% Observe que a porcentagem de células de adesão aumenta à medida que aumenta a concentração de anticorpos anti-CD três usados para estimulação. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em menos de três horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de medir a fluorescência de um poço não lavado para determinar a entrada de fluorescência.

Um valor crítico na análise de dados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a adesão celular estática. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de sangue humano pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar jaleco e luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.