Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

O objetivo geral do experimento a seguir é observar mudanças em tempo real na composição da glico em células vivas. Isso é conseguido expressando uma proteína fluorescente fundida a uma sequência de direcionamento Pero Somal PTs dois. A proteína de fusão é importada para zonas de glico maduras, que se tornam organelas fluorescentes.

A degradação e a reciclagem levam a uma perda de fluorescência que pode ser monitorada por citometria de fluxo As células são expostas a diferentes condições ambientais para identificar fatores que desencadeiam a remodelação da glico. Os resultados mostram que a composição da glico varia em resposta a mudanças ambientais com base em mudanças na fluorescência celular após a passagem de células de meios pobres em nutrientes para ricos em nutrientes. Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como microscopia eletrônica e de fluorescência, é que ela permite a análise em tempo real de milhares de células.

Demonstrando o procedimento estarão Sarah Bauer, uma estudante de pós-graduação, e Megan Conlan, uma estudante de graduação do meu laboratório. A forma pró-cíclica do inseto ou parasitas PCF para este procedimento é cultivada em um frasco de cultura de células quadradas de 25 centímetros com 10 mililitros de meio apropriado a 27 graus Celsius e 5% de CO2. A preparação do DNA plasmático não será mostrada neste vídeo, mas o protocolo está disponível no manuscrito anexo.

Para iniciar este procedimento, adicione 10 microlitros de DNA linearizado purificado estéril a 400 microlitros de células de contagem de citomixes esterilizadas por filtro usando um citômetro de fluxo e colha de 50 a cem milhões de células por centrifugação a 800 Gs por 15 minutos. À temperatura ambiente, despeje o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de um mililitro ressuspenda o pellet celular em 450 microlitros de DNA e mistura de Cyt. Transfira a solução contendo a mistura de DNA e cito das células para uma lacuna estéril de quatro mililitros.

Qve e coloque o qve na câmara de eletroporação. Selecione o decaimento exponencial e insira manualmente as configurações a seguir. Tensão 1,5 quilovolts capacitância 25 mili resistência, ômega infinito e vet quatro milímetros.

Pressione o pulso assim que o pulso estiver completo. Retire o veterinário da câmara de eletroporação e retorne ao gabinete de biossegurança. Pipetar 10 mililitros de meio SDM 79 para um novo balão estéril.

Transferir as células transformadas para o balão com o SDM 79. Incubar as células sem seleção de medicamentos por 24 horas. A 27 graus Celsius, 5% de CO2.

Após 24 horas, uma higromicina G 4 1 8 e uma passagem de blastin. Um mililitro de células transformadas com droga em nove mililitros de SDM 79 com droga devolve as células à incubadora. Posteriormente, as células são analisadas diariamente por citometria de fluxo, que será demonstrada mais adiante neste vídeo.

S para armazenamento de longo prazo são feitos quando as células são fluorescentes e atingiram a densidade celular de 10 milhões de células por mililitro. Primeiro, faça o meio de congelamento adicionando um volume igual de 100% de glicerol à mistura de cito e filtre a esterilização da solução. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de congelamento a 800 microlitros de células em um frasco criogênico e misture suavemente por inversão.

Coloque o frasco criogênico entre duas prateleiras de isopor e congele a 80 graus Celsius negativos por cerca de 24 horas. Uma vez congeladas, transfira as células para nitrogênio líquido, é importante mover as células para nitrogênio líquido Após 24 horas, pois um armazenamento mais longo a menos 80 graus Celsius leva a uma diminuição na viabilidade celular Para descongelar o estoque congelado. Remova o frasco congelado do freezer de 80 graus Celsius negativos e descongele a temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos.

Pipetar nove mililitros de meio SDM 79 com medicamento em um novo frasco estéril. Adicione as células descongeladas a este frasco, passe para as células de um a 10 adicionando um mililitro desta cultura a nove mililitros de SDM 79 em um novo frasco para preparar a cultura para uma passagem de ensaio de diluição para células a uma densidade de 100.000 células por mililitro em três mililitros de SDM 79. Em um frasco de cultura de 25 mililitros, a fluorescência é medida imediatamente após a passagem e, em seguida, às três horas e às 24 horas Apenas passar as células de volta uma vez antes do início do ensaio de diluição é essencial para observar a remodelação glicossomal.

Quando as células são cultivadas além de duas passagens, a remodelação lisossômica torna-se imprevisível. Antes de executar qualquer amostra, os fluidos devem ser lavados e enxaguados conforme demonstrado. Aqui, ligue o citômetro de fluxo e abra o programa C Flow plus.

Substitua o tubo de água nano pura no qual o SIP está armazenado por um tubo vazio. Selecione o botão de retrocesso. Assim que a retrolavagem estiver concluída.

Remova o tubo da microcentrífuga do gole e descarte-o. Coloque um novo tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de água nano pura nova no gole. Selecione o novo poço no programa C Flow em limites de execução.

Defina o tempo para dois minutos. Em fluidics, selecione rápido e execute. Quando um limite de tempo de dois minutos for concluído, clique no botão excluir dados de amostra.

Após a configuração do citômetro de fluxo, as células podem ser contadas. Substitua a água no SIP pela amostra a ser contada. Defina os limites de execução para 30 segundos, fluidos para rápido e selecione executar após a conclusão do 32º limite de tempo.

O C Flow plus fornecerá os eventos por microlitro na última execução. Para medir a fluorescência, defina os limites de execução para 10.000 eventos e fluidos. Para desacelerar, selecione o limite definido.

Em limite primário, selecione eliminar permanentemente eventos no FSCH e insira menos de 30.000. Clique em aplicar seguido de fechar, selecione o botão histograma em uma das novas janelas de plotagem e selecione FSCA Na lista suspensa, selecione FL one A, que mede a fluorescência. No comprimento de onda de 530 nanômetros, selecione a execução.

Depois que todas as culturas tiverem sido avaliadas quanto à fluorescência, passe a solução de limpeza pela linha fluídica por dois minutos e regue por dois minutos. Para iniciar a análise de dados, selecione a guia de análise no C Flow plus. Clique no botão do histograma abaixo, faça um novo gráfico.

Selecione FSEA. Uma lista suspensa aparecerá. Selecione o canal FFL um a.

Destaque um poço para analisar, selecione o botão do portão e desenhe manualmente um portão para a população de interesse. O C Flow plus fornecerá uma contagem de células dentro desta porta e porcentagem desta análise de citometria de fluxo de plotagem de células PCF cultivadas em meios contendo glicose. SDM 79 revelou duas populações, uma brilhante e outra fraca.

As células fracas abrigam zonas de glico imaturas, que não importaram o repórter fluorescente. Embora as células brilhantes abriguem zonas de glico mais maduras, quando a glicose está presente no meio, a má localização das proteínas glicosílicas é letal e a expressão e importação de proteínas gly devem ser rigidamente controladas. Isso se reflete na ausência de células com intensidades de fluorescência intermediárias.

Em meio SDM 80 Sem glicose, a má localização das proteínas glicícolas é tolerada. A distribuição populacional bimodal é perdida e células de fluorescência intermediária são observadas. Este sistema pode ser usado para identificar condições que desencadeiam a remodelação do glico.

Quando culturas de alta densidade contendo aproximadamente 10% de células escuras ou passagem para meios frescos, há um aumento na porcentagem de células escuras com zonas glicosas imaturas caindo dentro da porta esquerda. Em 24 horas, a distribuição original da população é restabelecida. Como as espumas de glico imaturas agora contêm as proteínas peroxissomas necessárias para importar a proteína fluorescente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar culturas extensas. Após duas passagens, as culturas devem ser descartadas e novos oitos estáveis usados. Este protocolo permite a identificação de reagentes e condições que desencadeiam a modelagem de glico.

Após este procedimento, outros medicamentos como análise ocidental e fluorescência e microscopia eletrônica podem ser realizados. A fim de responder com mais precisão as mudanças na expressão, localização e morfologia da glicoproteína.