Name: Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a monitorar dinâmica de glicossomos em Trypanosoma africano usando proteínas fluorescentes e citometria de fluxo. Este método permite análise em tempo real de milhares de células vivas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo Creative Inquiry Program for Undergraduate Research e pelo Calhoun Honors College da Clemson University.

1.-Geral Trypanosoma Pecuária <ol><li> Pesar sólidos para a preparação dos meios SDM79 (Tabela 1). </li><li> Armazenar a 4 ° C em 50 mL cónico ou um saco plástico. NOTA: Os reagentes são estáveis ​​durante pelo menos 6 meses. </li><li> Descongelar soro fetal bovino (FBS) em um banho de água a 37 ° C, e misturar periodicamente por inversão. NOTA: FBS é recebida do fornecedor, como uma solução estéril. Filtro de esterilização FBS reduz a sua capacidade para suportar o crescimento do parasita. </li><li> Uma vez que toda a garrafa é descongelada, calor inactivar soro durante 30 minutos num banho de água a 56 ° C, a mistura periodicamente para minimizar a precipitação de componentes do soro. </li><li> Descongelar a penicilina / estreptomicina (pen / strep), hemina (2 mg / ml em NaOH a 50 mM), e solução basal águia vitamina meio à temperatura ambiente. </li><li> Para uma proveta graduada de 1000 ml, adicionar 20,2 g de sólidos SDM79 (Tabela 1) para os componentes líquidos (Tabela 2) e misture bem com uma placa de agitação. </li><li> Ajustar o pH a 7,35, e perfazer o volume de 850 ml com água. </li><li> Filtrar esterilizar mídia ligando uma mangueira de vácuo para o fundo de uma garrafa de filtro. Aplicar vácuo até que a solução é filtrada. </li><li> Remover top filtro no gabinete de biossegurança e adicione 150 ml de inactivado pelo calor FBS. Remover cobertura plástica de tampa estéril e garrafa mídia selo. </li><li> Prepare mídia SDM80 da mesma maneira como SDM79 com as seguintes excepções; não adicione açúcar ou glucosamina e usar MEM sem glutamina. Em lugar de 150 ml de FBS inactivado pelo calor, adicionar 135 ml de dialisado, FBS inactivado pelo calor, e 15 mL de FBS inactivado pelo calor. </li><li> Cultura parasitas PCF em cada 25 cm2 frasco com 10 ml de meio apropriado a 27 ° C e 5% de CO 2. NOTA: As células devem ser contadas diariamente utilizando um hemocitômetro ou um citômetro de fluxo (ver secção 6) e culturas devem ser mantidas em densidades entre 1 x 10 5 e 5 x 10 6 células / ml. </li></ol> 2 Transfection de PCF Parasitas com a construção repórter fluorescente NOTA: Para seguir glicossomo dinâmica, uma proteína repórter, contendo a sequência de direccionamento de peroxissomas (PTS2) de aldolase fundido reforçado a proteína fluorescente amarela é expresso nos parasitas. A sequência que codifica a proteína de fusão foi clonado no pXS2bla 12, que contém o promotor procyclin e as regiões intergénicas de tubulina, que a recombinação homóloga no genoma directa e o gene de resistência à blasticidina para selecção. Linhas celulares de pró-cíclicos, contendo os genes que codificam a polimerase de T7 e tetraciclina repressor (PF29-13) são transformadas com a construção de direccionamento, pXS2: PTS2eYFP. <ol><li> Prepare cytomix misturando os componentes listados na Tabela 3. Filtre esterilizar e armazenar a RT. </li><li> DNA de plasmídeo linearizado com Mlu I, pipetando 10 mL de ADN (1 mg / mL), tampão de enzima de restrição de 5 ul, 33 ul de água, e 2 μ; L de enzima Mlu I para um tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Purifica-se a digestão de restrição por adição de um volume de tampão de ligação com a enzima de restrição digest. Misturar tampão de ligação e DNA digerido com vórtex. Resumidamente, centrifugar para recolher a amostra no fundo do tubo. </li><li> Inserir uma coluna de ADN de ligação para um tubo de recolha de 2 ml, e a transferência de ADN digerido / ligante solução tampão à coluna. </li><li> Centrifugar por 10.000 xg por 1 min. Após a centrifugação, descartar filtrado do tubo de coleta e retornar a coluna para o tubo de coleta. </li><li> Adicionar 700 ul de tampão de lavagem SPW e centrifugar a 10000 xg durante 1 min. </li><li> Filtrado Descarte de tubo de coleta, retornar a coluna de tubo de coleta e repetir SPW etapa de lavagem e centrifugação. </li><li> Descartar filtrado, coluna de retorno ao tubo de recolha, e centrifugar coluna vazio durante 3 minutos a 10000 xg para remover o etanol residual. </li><li> Em uma cabine de segurança biológica, jogue fora collection tubo e lugar da coluna em um tubo de microcentrífuga estéril. </li><li> Para eluir o ADN, adicionar 25 ul de água estéril para coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min. Centrifuga-se a 10000 xg durante 1 min. </li><li> Adicionar mais 25 ul de água estéril na capa de biossegurança coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Centrifugar a 10.000 velocidade xg por 1 min. </li><li> Numa câmara de biossegurança transferir todo o volume de ADN para um novo tubo de microcentrifuga estéril. Nota: Esta etapa evita a contaminação da tampa aberta durante a centrifugação. </li><li> Adicionar o ADN purificada estéril,, linearizado (10 ng) a 400 ul de cytomix esterilizada por filtração. </li><li> Contagem de células, como descrito na seção 6 e colher 5 x10 7 a 10 8 células por centrifugação a 800 xg por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 450 ul de ADN + cytomix usando uma pipeta de 1 ml serológico. </li><li> Solução de transferência contendo ce<html> lls, ADN, e cytomix para uma cuvete estéril 4 milímetros lacuna e lugar da cuvete na câmara de electroporação. </li><li> Selecione &quot;decaimento exponencial&quot; e digitar manualmente as seguintes configurações: Tensão: 1,5 kV, capacitância: 25 mF, Resistance: Ω, e Cuvette: 4 mm. Pressione pulso. Uma vez que o impulso está completa, remover cuvete da câmara de electroporação e retornar para o armário de biossegurança. </li><li> Para um novo frasco estéril, pipeta 10 ml de SDM79. Transferência das células transformadas para o balão com 10 ml de SDM79. </li><li> Incubar SEM selecção de drogas durante 24 horas a 27 ° C, 5% de CO 2. Após 24 horas, adicionar G418 (15 mg / mL), higromicina (50 ug / ml), e blasticidina (10 ug / ml). Passar 1 ml de células transformadas com droga em 9 ml de SDM79 com droga. </li><li> Analise as células diariamente conforme descrito nas seções 6 e 7 Quando as células são fluorescentes, e chegaram a uma densidade celular de 1 x 10 7 / ml, fazer stabilates para armazenamento de longo prazo (3,1-3,3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Fazer Stabilates <ol><li> Para fazer com que meios de congelação, adicionar um volume igual de glicerol a 100% e para cytomix filtro de esterilização. </li><li> Adicionar 200 ul de meio de congelação a 800 ul de células (1 x 10 7) em um frasco de congelação, misturar suavemente por inversão e lugar entre duas prateleiras de esferovite e congelar a -80 ° C. </li><li> Uma vez congelado (~ 24 horas), as células de transferência para nitrogênio líquido. NOTA: É importante mover em células LN 2, após 24 h, como um armazenamento mais longo à temperatura de -80 ° C, leva a uma diminuição da viabilidade celular. </li></ol> 4. Stocks descongelamento congelados <ol><li> Remover o frasco congelado de -80 ° C e descongelamento à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. </li><li> Pipetar 9 ml de SDM79 com droga para um novo frasco estéril. Adicionar células descongeladas para este balão. Passa células 1:10, adicionando 1 ml desta cultura a 9 ml de SDM79 em um novo frasco (concentração final de 1 x 10 5 / ml). </li><li> Antes de as células atingirem uma densidade de 10 7 / ml, começam citómetro definire ensaios de diluição. </li></ol> 5. Setup Cytometer <ol><li> Ligue o citômetro de fluxo e abrir o programa cflow Plus. NOTA: Antes de executar quaisquer amostras, os fluidos devem ser backflushed e enxaguado acordo com os passos 5,2-5,7. </li><li> Substitua o tubo de água nanopura em que o gole é armazenado com um tubo vazio. </li><li> Selecione o botão &quot;fluxo reverso&quot;. </li><li> Depois de retrolavagem é completa, remova o tubo de microcentrífuga de gole e descarte. </li><li> Colocar um novo tubo de microcentrifuga contendo 1 ml de água nova nanopura na sorvo. </li><li> Selecione um novo poço no programa cflow. Em &quot;Limites Run&quot; definir o tempo de 2 min. Em &quot;Fluidics&quot;, selecione &quot;rápido&quot; e &quot;Run&quot;. </li><li> Uma vez que o limite de tempo de 2 min é completa, clique no botão &quot;Apagar dados de exemplo&quot;. </li></ol> 6. contagem celular usando citômetro de fluxo <ol><li> Substituir a água com a amostra a ser contadas. Defina &quot;Limites Executar &quot;para 30 segundos,&quot; Fluidics &quot;para&quot; rápida &quot;e selecione&quot; Executar &quot;. </li><li> Após o prazo de 30 seg é completa, cflow mais irá fornecer os eventos / l em &quot;Last Run&quot;. Contagem Repita para cada cultura. NOTA: Antes de células chegar a 1 x 10 7 células / ml, prossiga com ensaio de diluição. As células devem ser interrompido após um ensaio de diluição for concluída. Células cultivadas por períodos mais longos perdem a capacidade de responder às condições ambientais. </li></ol> 7 Fluorescência de medição usando citômetro de fluxo <ol><li> Para avaliar a fluorescência, definir &quot;limites Run&quot; para 10 mil eventos e &quot;Fluidos&quot; para &quot;lento&quot;. Selecione &quot;Definir limite&quot;. Em &quot;Threshold Primária&quot;, selecione &quot;permanentemente eliminar eventos do&quot;, &quot;FSC-H&quot; (na caixa drop-down) e entre menos de 30.000. Clique em &quot;Aplicar&quot; e depois em &quot;fechar&quot;. </li><li> Selecione o220; &quot;botão em uma das novas janelas de plotagem e selecione&quot; Histograma FSC-A &quot;A partir da lista drop-down, selecione&quot; FL1-A &quot;. NOTA: medidas FL1-A fluorescência no comprimento de onda de 530 nm. </li><li> Selecione &quot;Run&quot; e repita para todas as culturas. </li><li> Executar a solução de limpeza através da linha de fluidos durante 2 min e água durante 2 min. </li></ol> 8. Diluição Ensaios <ol><li> Passar as células a uma densidade de 1 x 10 5 células / ml em 3 ml de SDM79 num balão de cultura de 2 25 cm e medir a fluorescência imediatamente após a passagem e, em seguida, em 3 horas e 24 horas. </li></ol> Análise dos dados do 9 <ol><li> Selecione &quot;Analisar&quot; guia sobre cflow Plus. </li><li> Clique no botão &quot;Histograma&quot; em &quot;Fazer uma nova trama.&quot; Selecionar &quot;FSC-A&quot; e uma lista drop-down aparecerá. Selecione o canal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Realce um bem para analisar. Selecione o botão &quot;Gate&quot;, e desenhar manualmente uma portapara a população de interesse. </li><li> Fluxo Plus fornecerá celular &quot;Contagem&quot; dentro desse portão e &quot;% dessa trama&quot;. </li></ol>

<ol><li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetoplastids%3A+related+protozoan+pathogens%2C+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li>
<li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li>
<li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids%3A+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li>
<li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes%2C+glyoxysomes+and+glycosomes+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li>
<li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes%3A+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li>
<li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li>
<li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+function%2C+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li>
<li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li>
<li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li>
<li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li>
<li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%3A+RNA+interference+studies+of+PEX14%2C+hexokinase%2C+and+phosphofructokinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li>
<li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li>
<li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li>
<li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li>
<li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li>
<li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+medical+bulletin%22%5BJournal%5D)">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li>
<li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li>
<li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li>
<li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+trypanosomatid+PEX19%3A+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li>
<li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi%27s+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li>
<li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells%3A+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li>
<li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li>
<li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li>
<li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Glicossomos são, dinâmico, organelas essenciais específicos do parasita. Os processos que regulam a biogênese, manutenção, proliferação e remodelação dessas organelas provavelmente incluem alvos de medicamentos que poderiam ser exploradas para fins terapêuticos. Apesar do elevado potencial de abundância de tais alvos de drogas, o campo de glicossomo biogênese ficou para trás o estudo de processos similares em outros organismos, predominantemente, devido à falta de um sistema tratável, de alto rendimento para o acompanha...

Trypanosoma brucei causa a doença do sono Africano em seres humanos e uma doença debilitante, nagana, em bovinos. As drogas utilizadas no tratamento das referidas doenças são antiquado e extremamente tóxico, as vacinas não estão disponíveis, e o potencial para o desenvolvimento de resistência às drogas necessita da busca de novos alvos de medicamentos 1. Durante seu ciclo de vida, T. brucei, alterna entre um inseto vetor e hospedeiro mamífero; dois hosts que se apresentam muito diferentes ambientes em que o parasita deve sobreviver. Uma série de alterações metabólicas e morfológicas ocorrer como o parasita está exposta a diferentes condições ambientais. Algumas das mudanças mais dramáticas são observadas em microcorpos específicas do parasita único delimitado por membrana, denominado glicossomos 13. Os níveis de glicose são relativamente elevados (~ 5 mm) na corrente sanguínea e parasitas na corrente sanguínea (BSF) gerar ATP exclusivamente através wh glicólisemetabolismo mitocondrial ile é reprimida 14. Ao contrário de outros eucariotas, em que a glicólise ocorre no citoplasma, T. brucei compartimenta a maioria das enzimas glicolíticas em glicossomos 14,15. Os parasitas são absorvidos pela mosca tsé-tsé durante a farinha de sangue e experimentar uma queda em glicose, que cai para níveis indetectáveis ​​dentro de 15 min de ser ingerido pela mosca. O metabolismo de inseto, forma procíclicos (PCF), parasitas é mais flexível e glicose, bem como aminoácidos, tais como prolina, pode ser usado na síntese de ATP 16-18. Estudos proteômicos comparativos revelam mudanças de ciclo de vida dependentes em glicosomal e proteínas mitocondriais com proteínas glicolíticas aumentou em parasitas na corrente sanguínea e proteínas mitocondriais envolvidos no ciclo TCA e cadeia respiratória 13,19. Enquanto muitos estudos têm-se centrado sobre as diferenças entre BSF e glicossomos PCF, pouco se sabe sobre as mudanças no glicossomos PCF que ocorrem em resposta aos envmudanças ironmental. No intestino posterior da mosca, os níveis de glicose estão baixos com aumentos transitórios durante uma alimentação 20. Na maioria dos estudos in vitro, parasitas PCF são cultivadas em meios contendo glicose. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que mudanças no metabolismo PCF significativamente em resposta à glicose disponibilidade 17. Na ausência da glucose, a absorção de prolina e prolina aumento da actividade de desidrogenase 18. Esta mudança no metabolismo mitocondrial é provavelmente acompanhada por uma alteração na morfologia e composição glicossomo, no entanto, isto não foi avaliado directamente. Electron e microscopia de fluorescência são técnicas comuns usadas para estudar a dinâmica glicossomo em T. brucei 2,21-24. Estes protocolos são o tempo e trabalho intensivo, caro e difícil de adaptar-se a estudos em tempo real e os protocolos de alto rendimento. Para superar esta limitação, um sistema repórter fluorescente organelo-used para estudar organelos em sistemas de mamífero e de levedura foi modificada para utilização em T. brucei 12. Sistemas repórter fluorescente-organelas têm sido amplamente utilizados em eucariotos superiores, tais como fungos, plantas e células de mamíferos 25-27. Em tais sistemas, uma proteína fluorescente é fundido com uma sequência de aminoácidos que tem como alvo a proteína de organelos específicos. A degradação ou a síntese das proteínas-alvo é medida por meio de fluorescência e as mudanças na composição do organelo são reflectidas pelas alterações na fluorescência celular. Quando a grelha de leitura aberta de maior proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento peroxissomal tipo II (PTS2) 12, a proteína é importado para PTS2eYFP, glicossomos maduros importação-competente e fluorescência podem ser monitorizadas por meio de citometria de fluxo. As variações na composição glicossomo são refletidas por mudanças na fluorescência celular. Este sistema pode auxiliar no resolVing os mecanismos que regulam as mudanças induzidas pelo ambiente em glicossomo composição. Este manuscrito descreve a geração de um sistema repórter em glicossomo PCF parasitas em conjunção com citometria de fluxo para controlar a dinâmica glicossomo em tempo real em parasitas vivos e fornece um exemplo de como ele foi usado para seguir alterações na composição glicossomo em resposta a diferentes ambientes. Em resumo, glicossomo composição é influenciada pela concentração de glucose extracelular e a passagem de culturas em fase logarítmica em meio fresco provoca mudanças na composição glicossomo. Este sistema pode ser modificado para estudar o comportamento dinâmico de outros organelos nos tripanossomas e outros parasitas.

<table><tbody><tr><td>Adenosina</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>ácido p-aminobenzóico</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Solução de Vitamina de Águia Média Basal (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Ingrediente Cytomix</td></tr><tr><td>EZNA Gel Kit de extração</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>Soro de grau de pesquisa</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Glucosamina HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Mídia de congelamento</td></tr><tr><td>Graces pó de mídia de célula de inseto</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de magnésioFisher</td><td>BP214-500</td><td>Ingrediente Cytomix</td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Aminoácidos MEM (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79</td></tr><tr><td>Ingrediente Mistura NEAA (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo (1x) com L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Biocarbonato de sódio</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr> Solução <tr><td>de penicilina-estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix ingrediente</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico anidro</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Ingrediente</td></tr><tr><td>Cytomix L-Prolina</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-Serina</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>Ácido pirúvico, sal de sódio</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-Taurina</td><td>TCI América</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingrediente</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>Tampão de ligação</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>SPW tampão de lavagem</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Transformação de tripanossomas</td></tr><tr><td>4 mm Cubetas de eletroporação</td><td>VWR</td><td></td><td>Transformação de tripanossomas</td></tr></tbody></table>

utilizando proteínas fluorescentes para monitorar glicossomo dynamics do trypanosoma africano

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei é um parasita que causa cinetoplastida tripanossomíase humana Africano (HAT), ou doença do sono, e uma doença debilitante, nagana, em bovinos 1. Os suplentes do parasita entre na corrente sanguínea do hospedeiro mamífero eo vetor mosca tsé-tsé. A composição de muitas organelas celulares muda em resposta a essas condições extracelulares diferentes 2-5. Glicossomos peroxissomas são altamente especializados, em que muitas das enzimas envolvidas na glicólise estão compartimentados. Mudanças na composição glicossomo de uma forma de desenvolvimento e regulamentada ambientalmente 4-11. Atualmente, as técnicas mais comuns usadas para estudar glicossomo dinâmicas são microscopia eletrônica e de fluorescência; técnicas que são caros, tempo e mão de obra intensiva, e não é facilmente adaptada para análises de elevado rendimento. Para superar essas limitações, um sistema repórter fluorescente glicossomo emo que aumentou a proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento de peroxissoma (PTS2), que dirige a proteína de fusão para glicossomos 12, foi estabelecido. Após a importação da proteína de fusão PTS2eYFP, glicossomos se tornar fluorescente. Degradação organelo e reciclagem resulta na perda de fluorescência que pode ser medido por citometria de fluxo. Um grande número de células (5000 células / seg) podem ser analisados ​​em tempo real, sem grande preparação de amostras, tais como a fixação e montagem. Este método oferece uma maneira rápida de detectar mudanças na composição de organelas em resposta às variações das condições ambientais.

Neste sistema, uma alteração dependente de glucose em glicossomo composição foi observado. Quando as células são cultivadas em meios contendo glucose, duas populações são observados; um brilhante e uma fraca (Figura 2A). Células Dim abrigar glicossomos imaturas, que não tenham importado a PTS2eYFP enquanto as células vivas abrigam uma mistura de maduros e imaturos glicossomos 12. Quando a glicose está presente na mídia, mislocalization de glicossomo proteínas é letal 15,28 e glicos...

A dinâmica dos glicossomos em tripanossomas africanos é difícil de estudar por técnicas tradicionais de biologia celular, como microscopia eletrônica e fluorescência. Como meio de observar o comportamento dinâmico das organelas, um sistema repórter de organelas fluorescentes tem sido usado em conjunto com a citometria de fluxo para monitorar a dinâmica dos glicossomos em tempo real em parasitas vivos.

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

O objetivo geral do experimento a seguir é observar alterações em tempo real na composição de glicozonos em células vivas. Isso é conseguido pela expressão de uma proteína fluorescente fundida a uma sequência de direcionamento peroxissomal PTs dois. A proteína de fusão é importada para glicozonos maduros, que se tornam organelas fluorescentes.A degradação e a reciclagem levam à perda de fluorescência que pode ser monitorada por citometria de fluxo; as células são expostas a diferentes condições ambientais para identificar fatores que desencadeiam a remodelação glicídica. Os resultados mostram que a composição glicídica varia em resposta a alterações ambientais, com base nas mudanças na fluorescência celular após a transferência das células de um meio pobre em nutrientes para um meio rico em nutrientes. Assim, a principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia eletrônica e de fluorescência, é que ela permite a análise em tempo real de milhares de células.Quem demonstrará o procedimento será Sarah Bauer, aluna de pós-graduação, e Megan Conlan, aluna de graduação do meu laboratório. As formas prociclícas de insetos ou parasitas PCF para este procedime

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

A translocação efetora para as células hospedeiras por meio de um sistema de secreção tipo III é uma estratégia de virulência comum entre bactérias gram-negativas. Um ensaio baseado em fusão efetora beta-lactamase para análise quantitativa da translocação foi aplicado. Em células infectadas por Yersinia, a conversão de um repórter FRET pela beta-lactamase é monitorada usando microscopia de varredura a laser.

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Este manuscrito descreve o uso de uma cepa bioluminescente de tripanossomas africanos para permitir o rastreamento de infecções em estágio avançado e demonstra como imagens ao vivo in vivo podem ser usadas para visualizar infecções no sistema nervoso central em tempo real.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

A adição de uma etiqueta a uma proteína é uma maneira poderosa de obter informações sobre sua função. Aqui, descrevemos um protocolo para marcar endogenamente centenas de proteínas de Trypanosoma brucei em paralelo, de modo que a marcação em escala de genoma seja alcançável.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Interações da proteína-proteína são essenciais para sistemas biológicos, e estudos sobre a cinética de ligação fornecem insights sobre a dinâmica e a função dos complexos da proteína. Nós descrevemos um método que quantifica os parâmetros cinéticos de uma proteína complexa usando transferência de energia de ressonância de fluorescência e a técnica de fluxo parou.

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Descrevemos um método para estudar como o pH responde a pistas ambientais nos glicossomas da forma sanguínea de tripanossomas africanos. Essa abordagem envolve um sensor de proteína hereditária sensível ao pH em combinação com citometria de fluxo para medir a dinâmica do pH, tanto como um ensaio de curso de tempo quanto em um formato de tela de alto rendimento.

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Aprenda a monitorar dinâmica de glicossomos em Trypanosoma africano usando proteínas fluorescentes e citometria de fluxo. Este método permite análise em tempo real de milhares de células vivas.

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Explorar mais vídeos