Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus)

O objetivo geral deste procedimento é esclarecer todo o fígado e a junção com o intestino para análises globais, estruturais e celulares da degeneração biliar em lampreias C metamórficas. Isso é realizado fixando primeiro os tecidos na solução monomérica de hidrogel.

Em seguida, o hidrogel é polimerizado com os tecidos fixados. Então, a membrana plasmática do tecido fixado é removida e o tecido torna-se transparente. Por fim, é realizada a coloração por imunofluorescência e, ultimateamente, utiliza-se microscopia a laser e microscopia confocal para demonstrar as alterações estruturais e celulares globais durante a degeneração biliar em c Lampry metamórfico.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área biomédica, como os conectomas no sistema nervoso central e, em nosso caso, a degeneração biliar durante a metamorfose no ponto sérico. As implicações dessa técnica estendem-se para o tratamento ou diagnóstico da fibrose biliar ou atresia em humanos, pois esta doença congênita rara em lactentes apresenta características semelhantes à degeneração biliar durante a metamorfose no ponto sérico. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao encontrarmos um artigo científico na revista Nature e apresentarmos o vídeo online durante nossa reunião de laboratório, demonstrando o procedimento que será realizado por Ann Scott, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório, após preparar a solução salina tamponada com fosfato e o tampão fosfato, ou pb, de acordo com o protocolo descrito.

Em uma capela de exaustão, prepare 400 mililitros de hidrogel combinando água destilada, acrilamida a 40%, bis-acrilamida a 2%, PBS 10X, paraformaldeído a 16%, aldeído, saponina e persulfato de amônio. Prepare um litro de solução de clareamento composta por SDS a 4% e ácido bórico 0,2 molar, e prepare 500 mililitros de glicerol a 80% para tratar o tecido na capela de exaustão. Aliquote 10 mililitros da solução monomérica de hidrogel em tubos cónicos de 15 mililitros.

Disseque a amostra de tecido e coloque o tecido em cada tubo com fixador de hidrogel a quatro graus Celsius por dois dias. Após a incubação sob capela, polimerize o tecido fixado adicionando cinco microlitros de temid. Em seguida, homogeneíze bem e deixe as amostras incubarem à temperatura ambiente por duas a três horas.

Após a incubação, remova completamente o excesso de gel para clarear as amostras de tecido. Coloque cada uma em 15 mililitros de solução de clareamento e incube a 50 graus Celsius e 70 RPM por vários dias até que fiquem transparentes. Troque a solução de clareamento pelo menos uma vez por dia e remova qualquer excesso de gel.

Transfira as amostras em 15 mililitros de PB 0,1 molar com 0,1% de Triton X-100 a 37 graus Celsius e 70 RPM durante a noite. Repita a incubação mais duas vezes com tampão fresco. Agora que o tecido está transparente e livre de qualquer gel em excesso, submerja as amostras no anticorpo primário em PB com Triton X-100 e incube a 37 graus Celsius e 70 RPM por dois dias. Após a incubação, utilize 15 mililitros de PB com 0,1% de Triton X-100 para lavar as amostras de tecido a 37 graus Celsius e 70 RPM durante a noite.

Repita a lavagem três vezes após a remoção do último tampão de lavagem, adicione a solução de anticorpo secundário fluorescente em PB com 0,1% de Triton X-100 e soro bloqueador e incube no escuro a 37 graus Celsius e 70 rpm por um dia. Após lavar as amostras três vezes em 10 mililitros de PB com Triton X-100 a 37 graus Celsius e 70 rpm durante a noite, realize três lavagens noturnas em PBS. Por fim, incube o tecido clarificado em glicerol a 80% coberto com papel alumínio durante a noite.

A imagem por microscopia confocal é então realizada em ambiente escuro ou com pouca luz, embora as luzes estejam acesas neste vídeo para fins de visualização. Vários eventos de desenvolvimento importantes ocorrem no sistema biliar HEPA durante a metamorfose da lampreia, por exemplo, como mostrado aqui, os ductos biliares e a vesícula biliar sofrem apoptose e se degeneram. Após o uso do método de clareamento modificado e coloração com o marcador de células hepáticas citoceratina 19 e o marcador antiapoptótico BCL 2, foi utilizada microscopia confocal a laser para realizar seccionamento óptico através do fígado intacto.

A coloração revelou que o processo degenerativo ocorre nas fases metamórficas dois a quatro. Os painéis superiores são da região anterior e os painéis inferiores são da extremidade posterior. É mostrada aqui a árvore biliar e aqui estão células apoptóticas escuras com aparência dendrítica e os canalículos e ductos circundantes no fígado.

Esta figura representa imagens tridimensionais reconstruídas a partir da série Z confocal de três fígados entre os estágios metamórficos dois e três, marcados com anticorpos contra citoceratina 19 e BCL dois, na qual a árvore biliar e as células apoptóticas escuras com aparência dendrítica e os canalículos e ductos circundantes são indicados por setas brancas e pretas, respectivamente. É mostrada aqui uma seção óptica confocal dos ductos biliares de um espécime entre os estágios metamórficos dois e três, com gotículas biliares na luz. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como clarear todo o tecido para análises de imagem adicionais.

Não se esqueça de que trabalhar com soluções de paraform, aldeído e poliacrilamida pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas e a utilização de capela de exaustão devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.