Name: Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda um método modificado de CLARITY para visualizar a degeneração biliar em lampreia-do-mar (Petromyzon marinus) durante a metamorfose hepática. Esta técnica de microscopia confocal auxilia pesquisadores a analisar alterações estruturais e celulares em desenvolvimento.

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Os autores reconhecem a contribuição da Estação Biológica Hammond Bay, Great Lakes Science Center, EUA Geological Survey. Agradecemos também a Dr. Melinda quadro do Centro de Microscopia Avançada na Universidade Estadual de Michigan pelo apoio técnico em microscopia confocal de varredura a laser. Este estudo é suportado por concessões do Great Lakes Comissão das Pescas para YWCD e WML.

1. Solução Preparação <ol><li> Adicione 1 L de 10x de 0,1 M de solução salina de tampão fosfato (PBS, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sódio (monobásico), fosfato de sódio a 115 g (dibásico), e 87,66 g de NaCl. Dissolver em cerca de 800 ml de H2O destilada, ajustar o pH, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada <ol><li> Adicione uma solução salina L 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4): Tome 100 ml 10x PBS, e adicionar 900 mL de H2O destilada </li><li> Adicione 1 L de 0,1 M de tampão fosfato salino (pH 7,4) com 0,1% de Triton X-100: Tome 100 ml 10x PBS, adicionar 1 ml de Triton X-100, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada </li></ol></li><li> Adicione 1 L de tampão de fosfato 0,1 M de 10x (PB, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sódio (monobásico) e fosfato de sódio a 115 g (dibásico). Dissolver em cerca de 800 ml de H2O destilada, ajustar o pH, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada <ol><li> Faça 1 L de 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4): Tomar 100 ml 10x PB,e adicionar 900 mL de água destilada H 2 O. </li><li> Adicione 1 L de 0,1 M de tampão fosfato (pH 7,4) com 0,1% de Triton X-100: Tome 10x 100 ml de PB, adicionar 1 ml de Triton X-100, e trazer o volume até 1 litro com H2O destilada </li></ol></li><li> Adicione 400 ml de solução de monómeros de hidrogel (4% de acrilamida, 0,25% de bis-acrilamida, paraformaldeído a 4%, 0,0075% de persulfato de amónio, 0,0005% de saponina em PBS a 0,1 M): Pesar 0,3 g de persulfato de amónio e 0,2 g de saponina. Adicionar 210 ml de H2O destilada, 40 ml de 40% de acrilamida, 10 ml de 2% de bis-acrilamida, 40 ml de 10x de PBS (pH 7,4), 100 ml de 16% de paraformaldeído, e misturar bem. </li><li> Faça solução compensação 4 L (4% SDS em ácido bórico 0,2 M): Pesar 49,464 g de ácido bórico e 160 g SDS. Dissolve-se em cerca de 3,5 L de H2O destilada, ajustar o pH para 8,5 com NaOH, e perfazer o volume até 4 L. </li><li> Faça 1 L solução de glicerol 80%: Medir 800 ml de glicerol, adicionar 200 ml de H 2 O destilada, e misture bem. </li></ol> 2. Preparação de Tecidos <ol><li> Preparar a solução de monómeros de hidrogel e uma alíquota de 10 ml a cada tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Dissecar todo o tecido e fixar no hidrogel durante 2 dias a 4 ° C. Certifique-se de que a solução de hidrogel é, pelo menos, 10 vezes o volume do tecido. </li><li> Traga o tecido fixado hidrogel (no tubo de centrífuga de 15 ml) para um extractor de fumo. </li><li> Polimerizar o tecido fixado hidrogel por adição de 5 ul de TEMED, misturar bem, e deixar assentar, na hotte, à temperatura ambiente durante 2-3 horas. </li><li> Remover o excesso de gel completamente. Nota: gel extra irá dificultar o processo de compensação ea penetração de anticorpos durante a coloração. </li><li> Incubar o tecido fixado em 10 ml de solução de compensação num agitador de incubador ajustado a 70 rpm e 50 ° C durante vários dias até que o tecido torna-se transparente. Alterar solução limpar pelo menos uma vez por dia e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução de compensação. </li><li> Lavar o tecido em 10 ml de 0,1 M PB, com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão. </li><li> Incubar o tecido clarificado na solução de anticorpo primário em PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante 2 dias. Nota: Certifique-suficiente solução de anticorpo primário para submergir todo o tecido. </li><li> Lavar o tecido em 10 ml de PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão. </li><li> Execute as seguintes etapas em um quarto escuro ou sob luz fraca. Cubra as amostras com papel alumínio para evitar o branqueamento foto. </li><li> Incubar o tecido clarificado com a solução de anticorpo secundário fluorescente nas PB com 0,1% de Triton X-100 e soro de bloqueio, a 70 rpm e 37 ° C durante 1 dia. </li><li> Lavar o tecido em 10 ml de PB com 0,1% de Triton X-100 a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repita este passo 3 vezes e remover o excesso de gel from o tecido quando se muda a solução tampão. </li><li> Lavar o tecido em 10 ml de PBS, a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. Repetir esta etapa 3 vezes e remover o excesso de gel a partir do tecido quando se muda a solução tampão. </li><li> Incubar o tecido clarificada em 80% de glicerol, a 70 rpm e 37 ° C durante a noite. </li><li> Armazenar o tecido manchado fluorescente, a 4 ° C antes de microscopia confocal. </li></ol>

<ol><li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+in+Michigan%5BTitle%5D)+AND+%22US+Fish+and+Wildlife+Service+Special+Science+Report+on+Fishery+Service%22%5BJournal%5D)">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li>
<li>Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardisty%2C+MW+%22The+biology+of+lampreys%22">The biology of lampreys</a>. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).</li>
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<li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li>
<li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li>
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<li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L.%2C+during+metamorphosis%3A+I.+Atresia+of+the+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li>
<li>Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+before+and+after+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li>
<li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li>
<li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey%2C+Lethenteron+reissneri%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo modificado a partir de um novo método denominado &quot;clareza&quot; 12, que reticula tecido intacto com poliacrilamida para formar um hidrogel nanoporoso, e depois tira da membrana plasmática de tecidos para alcançar a transparência óptica e a permeabilidade de macromoléculas. &quot;Clareza&quot; permite imagens de tecidos intactos de projeção de longo alcance e fiação do circuito local no sistema nervoso. Este novo método pode ser usado para visualizar todo o sistema biliar no fígado lampreia...

Lampreia Mar desenvolver-se através de três fases distintas de vida 1,2. Lampreia mar larval (L) passam a maior parte do tempo em tocas como filtradores bentónicos. Depois de passar por sete estágios metamórficos de mudanças dramáticas na morfologia externa e reorganização em órgãos internos 3, os juvenis resultantes (JV) entrar numa fase parasitária durante o qual eles se alimentam de sangue e fluidos de tecido de peixe hospedeiro, aumentando a massa corporal mais de 100 vezes . Depois de 1,0 a 1,5 anos se alimentando no peixe hospedeiro no mar ou grandes lagos, os adultos deixam alimentação durante o início da primavera e migram para os rios para desovar e morrer 1,2. Durante a metamorfose, o fígado lampreia mar perde a vesícula biliar e toda a árvore biliar, um fenótipo mutante evolutivo que imita a doença bebê humano atresia biliar. Atresia biliar infantil é uma doença hepática pediátrica rara, com graves complicações médicas 4,5,6,7, 8,9,10, no entanto, a patogênese e etiologia da atresia de vias biliares são em grande parte desconhecida 4. Os pacientes com atresia biliar morrer dentro de dois anos após o nascimento, a menos que a intervenção cirúrgica (cirurgia de Kasai) é realizada 5. Posteriormente, estes pacientes necessitam de extensa gestão clínica e muitas vezes o transplante de fígado 6. Muitas teorias de etiopatogenia atresia biliar têm sido propostas, como infecção viral, malformação congênita, doença auto-imune, e insulto tóxico. No entanto, a contribuição de cada um para o desenvolvimento de atresia biliar permanece inconclusiva 7,8,9,10. Ao contrário de crianças que sofrem atresia biliar patológico, lampreia de mar sofrem programada pelo desenvolvimento atresia biliar sem necroinflammation extensa, fibrose ou cirrose 10. Os animais podem sofrer colestase transitória durante este processo de 10, mas se adaptar a esta condição de desenvolvimentoVia de síntese de novo e secreção de sais biliares no intestino, após a atresia biliar de desenvolvimento, para além de mecanismos conhecidos, tais como a redução da síntese de sais biliares no fígado 11. Este processo de maturação na lampreia mar oferece a oportunidade única conhecida para analisar a progressão da atresia biliar. Um método recém-desenvolvido chamado &quot;clareza&quot; permite imagens de alta resolução no sistema nervoso de mamíferos complexos, transformando tecido intacto em um hidrogel nanoporous opticamente transparente 12. Usando lampreia fígado mar e um protocolo CLAREZA modificado, de imagem de tecido intacto de degeneração biliar pode ser documentada em toda metamorfose fígado.

<table><tbody><tr><td>40% de acrilamida&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% bis-acrilamida&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>persulfato de amônio&nbsp;</td>Ácido bórico <td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr> Saponina <tr><td></td><td>Sigma</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sódio (monobásico)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sódio (dibásico)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeído&nbsp;</td>Pellets de NaOH da <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Tubos de centrífuga <td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr> de <tr><td>15 ml</td><td>Ferramentas</td> de dissecação de qualquer marca<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método de esclarecimento novo para visualize biliar degeneração durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( petromyzon marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

A atresia biliar é uma doença rara da infância, com uma estimativa de 1 em 15.000 freqüência no sudeste dos Estados Unidos, mas é mais comum em países do leste asiático, com uma freqüência relatada de 1 em 5000 em Taiwan. Embora muito se sabe sobre a gestão da atresia biliar, sua patogênese ainda é indescritível. A lampreia mar (Petromyzon marinus) oferece uma oportunidade única para examinar o mecanismo e progressão da degeneração biliar. Mar lampreia desenvolver através de três fases da vida distintas: larval, parasitárias e adultos. Durante a transição de larva para juvenil parasitária, lampreia de mar sofrem metamorfose com reorganização dramática e remodelação na morfologia externa e órgãos internos. No fígado, a totalidade do sistema biliar é perdida, incluindo a vesícula biliar e das vias biliares. Um método recém-desenvolvido chamado &quot;clareza&quot; foi modificado para esclarecer todo o fígado e na junção com o intestino em lampreia mar metamórfica. Oprocesso de degeneração das vias biliares foi visualizado e discernir durante lampreia metamorfose mar por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de atresia biliar em um modelo animal único.

Vários eventos importantes do desenvolvimento ocorrem no sistema hepatobiliar durante lampreia metamorfose mar. O ducto biliar e da vesícula biliar em apoptose e degenerado (Figura 1). Combinando o método de clarificação modificado e coloração com marcador de células de fígado de citoqueratina 19 (CK19, presente em ambas as cholangiocytes e hepatócitos, antes e após a metamorfose 13) e Bcl2 marcador anti-apoptótica utilizando microscopia confocal, todo o sistema biliar foi capturado ao longo ...

Mar lampreia perder a vesícula e canais biliares durante a metamorfose, um processo semelhante à atresia biliar humano. Um novo método de fixação e esclarecimento (clareza) foi modificado para visualizar toda a árvore biliar através de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo degeneração biliar.

Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

O objetivo geral deste procedimento é esclarecer todo o fígado e a junção com o intestino para análises globais, estruturais e celulares da degeneração biliar em lampreias C metamórficas. Isso é realizado fixando primeiro os tecidos na solução monomérica de hidrogel.Em seguida, o hidrogel é polimerizado com os tecidos fixados. Então, a membrana plasmática do tecido fixado é removida e o tecido torna-se transparente. Por fim, é realizada a coloração por imunofluorescência e, ultimateamente, utiliza-se microscopia a laser e microscopia confocal para demonstrar as alterações estruturais e celulares globais durante a degeneração biliar em c Lampry metamórfico.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área biomédica, como os conectomas no sistema nervoso central e, em nosso caso, a degeneração biliar durante a metamorfose no ponto sérico. As implicações dessa técnica estendem-se para o tratamento ou diagnóstico da fibrose biliar ou atresia em humanos, pois esta doença congênita rara em lactentes apresenta características semelhantes à degeneração biliar durante a metamorfose no ponto sérico. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao encontrarmos um artigo cie

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Biologia

As lampreias recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinhal. No entanto, alguns neurônios espinhais de projeção são bons regeneradores e outros não. Este artigo ilustra as técnicas para larvas de lampreia mar habitação (e adultos recém-transformados), produzindo completos transecções medulares e preparar cérebros wholemount e medulas espinhais de hibridização in situ.

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Para ajudar a avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração hepática impulsionada pela via biliar do peixe-zebra, estabelecemos um modelo de lesão hepática no qual os hepatócitos que expressam nitroredutase são geneticamente ablacionados após o tratamento com metronidazol.  Neste protocolo, descrevemos como manipular, monitorar e analisar habilmente a ablação de hepatócitos e a regeneração hepática conduzida por vias biliares.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

O esqueleto branquial, incluindo rastros branquiais, dentes faríngeos e ossos branquiais, serve como o principal local de processamento de alimentos na maioria dos peixes. Aqui descrevemos um protocolo para dissecar e montar esse esqueleto interno em esgana-gata de três espinhas. Este método também é aplicável a uma variedade de outras espécies de peixes.

Dissecção e pay-per-montagem do Threespine Stickleback branquial Skeleton

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e caracterizar a estrutura, potência olfativa e resposta comportamental de compostos putativos feromônio de lampreias do mar.

A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.

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Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

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Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.

Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

Aqui, apresentamos como gerar um modelo de peixe-zebra associado ao Carcinoma Hepatocelular (CHC) associado à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) para estudar o impacto do excedente de colesterol no microambiente hepático e na paisagem das células imunes.

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

Este protocolo descreve a coleta e visualização de escamas elasmoides de zebrafish durante a regeneração in vivo . Além disso, é apresentado o cultivo ex vivo dessas cochonilhas por até 7 dias após a colheita.

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Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus)

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