Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P _F) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

O objetivo geral do experimento a seguir é aprender sobre a função das aquaporinas determinando o coeficiente de permeabilidade osmótica à água, ou PF de protoplastos vegetais. Corte um pedaço de uma folha sem epiderme axial e coloque-o em uma solução isotônica. Transferir as peças para uma solução enzimática e incubar durante 20 minutos a 28 graus Celsius, depois para uma solução isotónica fresca.

Em seguida, colete os protoplastos contendo solução com uma ponta cortada. Como segundo passo, prepare uma câmara experimental. Prenda uma lamínula na parte inferior da corrediça usando graxa de silicone.

Em seguida, cubra o fundo da câmara com uma cola de carga positiva e encha a câmara com uma solução isotônica. Protoplastos isolados são então adicionados à câmara, e a câmara é colocada delicadamente na platina do microscópio. Posteriormente, os protoplastos são expostos a uma solução hipotônica enquanto os vídeos são gravados para capturar seu curso de tempo de inchaço.

Em seguida, o curso do tempo de inchamento é analisado numericamente por software, incluindo procedimentos de ajuste de precisão, a fim de determinar o PF de cada protoplasto, com base nos resultados da análise numérica são obtidos que mostram diferenças no PF induzidas, por exemplo, pela expressão de diferentes genes de aquaporina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia da membrana celular, como a regulação da função da aquaporina. Embora este método possa fornecer informações sobre a água mática, a permeabilidade das plantas aquáticas são nativas ou geneticamente modificadas.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como origem de interesse exposta a ide. Antes de iniciar este procedimento, prepare as soluções isotônicas e hipertônicas necessárias e verifique sua osmolaridade. Usando um filtro OSM, a osmolaridade de cada solução deve estar dentro de 3% do valor alvo.

Encha uma placa de Petri de 10 centímetros com cerca de seis gotas de solução isotônica. Descasque o selo ABBA ou abaixe a epiderme da folha de uma esponja de coelho e corte a folha descascada em quadrados de cerca de quatro por quatro milímetros. Coloque os pequenos pedaços sobre as gotas de solução isotônica com o lado axial exposto voltado para baixo e tocando a solução.

Em seguida, dissolva 5,7 miligramas da mistura enzimática em 165 microlitros de solução isotônica em um tubo de 1,5 mililitro e misture delicadamente pipetando por um minuto ou mais até dissolver. Coloque várias gotas semelhantes da solução enzimática na mesma placa de Petri. Transfira os pedaços de folhas para a solução enzimática. Gotas.

Feche o prato e feche a tampa com uma rodada de perfil. Flutue o prato em banho-maria a 28 graus Celsius por 20 minutos. Após 20 minutos, adicione mais algumas gotas da solução isotônica ao prato usando uma pinça.

Levante cada pedaço de folha por sua borda para transferi-lo para uma nova solução isotônica Gota e, em seguida, sequencialmente para uma segunda gota. Agite o pedaço de folha na segunda gota para liberar os protoplastos usando uma ponta de pipeta de 100 microlitros cortada. Colete as gotas com os protoplastos em um tubo de 1,5 mililitro.

Preparar o sistema de profusão preenchendo uma coluna com a solução isotónica e outra coluna com a solução hipotónica. Abra a válvula para deixar um pouco de solução hipotônica fluir para encher a tubulação até o coletor de admissão. Depois de garantir que não haja bolhas de ar presas, feche a válvula.

Repetir para a solução isotónica. Sele uma lamínula usando graxa de silicone para fazer um fundo para a câmara dentro da lâmina de plexiglass para tornar o fundo da câmara pegajoso para protoplastos, cubra-o com sulfato de protamina com carga positiva ou poli L lisina. Use uma ponta de pipeta para espalhar essa cola sobre a lamínula.

Aguarde de um a dois minutos. Enxágüe três a quatro vezes com a solução isotônica e sacuda a solução restante. Encher a câmara com a solução isotónica.

Em seguida, use uma ponta de pipeta cortada para adicionar uma gota de protoplastos contendo solução à câmara. E espere de três a quatro minutos para que os protoplastos se assentem. Cubra a câmara com uma tampa transparente tocando a superfície da solução.

Evite prender bolhas de ar por baixo. Coloque uma lâmina suavemente em uma mesa de microscópio invertida e conecte-a conectada ao sistema de perfusão e à bomba protegendo contra bolhas de ar na tubulação. Ligue o fluxo de solução isotônica para perfusão constante a um mililitro por minuto.

Para registrar as alterações de volume, escolha um campo de exibição com o maior número possível de células de formato esférico e com um contorno de célula bem focado em seu maior perímetro. Grave um 62º vídeo de protoplastos imóveis selecionados a uma taxa de uma imagem por segundo ou um hertz. Inicie a gravação com uma lavagem de 15 segundos da solução isotônica e mude para a solução hipertônica por 45 segundos.

Salve o filme no formato Tiff em Para analisar uma série de imagens de uma célula inchada, use os plug-ins Image Explorer e protoplasts analyzer no software image J. Iniciar imagem J.To abrir o filme, clique em arquivo no painel Imagem J e, em seguida, consecutivamente nos menus suspensos à medida que eles desdobram a importação. Em seguida, o explorador de imagens.

Destaque o filme escolhido. Clique com o botão direito sobre ele e depois para a esquerda. Clique em analisador de protoplastos.

Na primeira imagem, use o mouse para desenhar círculos ao redor dos protoplastos selecionados. Em seguida, clique em OK. Na tabela de parâmetros de detecção que aparece para iniciar o algoritmo de detecção de protoplastos, clique em local no painel superior da imagem de protoplastos.

Em seguida, processe. No menu suspenso, examine os círculos verdes ao redor dos protoplastos selecionados ao longo do filme. Usando o controle deslizante inferior, salve os resultados em um arquivo do Excel.

A análise é feita quadro a quadro. Portanto, no caso de mais de uma célula, a classificação é necessária para separar as linhas pertencentes a cada célula Aqui. Os três cursos de tempo são mostrados em uma planilha do Excel antes e depois da classificação com os valores de área convertidos de pixels para micrômetros quadrados.

Cada curso de tempo é exportado para um arquivo de texto separado. Para iniciar este procedimento, conecte a câmara ao sistema de perfusão e à bomba e ligue o indicador de fluxo da matriz para uma taxa de perfusão constante de um mililitro por minuto, grave um 62º vídeo à taxa de um hertz. Inicie a gravação com 15 segundos de matriz indicadora e, em seguida, mude para a solução hipertônica Por 45 segundos, pare a gravação.

Nivelado com o indicador. Morra novamente por pelo menos 30 segundos. Antes de iniciar um novo filme, grave e salve de cinco a seis filmes para analisar os filmes.

Para obter um curso de tempo médio da transmitância da matriz indicadora de mudança, inicie a imagem J clique no arquivo. Em seguida, abra e procure o filme. Para cada filme, desenhe um retângulo vertical de 10 pixels de largura em qualquer lugar na primeira imagem do filme, clique na imagem no painel principal da Imagem J.

Em seguida, clique em cortar no menu suspenso. Para alinhar os 60 quadros em uma linha, clique em imagem e, em seguida, clique consecutivamente nos menus suspensos à medida que desdobram as pilhas e fazem a montagem. Desenhe um retângulo horizontal de um pixel de altura em qualquer lugar ao longo de toda a linha de imagens e clique em analisar no painel principal da Imagem J.

Em seguida, clique em Perfil de plotagem. No menu suspenso, copie as listas dos dados de transmitância para um arquivo do Excel. Calcule a média dos cursos de tempo de transmitância obtidos dos filmes Sero das descargas de matrizes indicadoras.

Gere uma base em tempo real multiplicando o número sequencial da imagem por 0,1. Salve o curso de tempo médio em um arquivo de texto para calcular os vários parâmetros do curso de tempo de osmolaridade. Use o programa de adaptação MATLAB PF fit, que está disponível para uso.

Gratuito. Detalhes sobre como baixar e usar este programa estão disponíveis no texto do protocolo. No painel de ajuste do indicador.

Importe os dados do curso de tempo médio da transmitância do corante indicador. Insira manualmente os parâmetros do experimento atual, as suposições iniciais dos parâmetros com formiga H. Descrevendo o curso de tempo da concentração do corante indicador também podem ser alterados. Clique em executar para visualizar o gráfico dos cursos de tempo da concentração do indicador DAI e da osmolaridade do banho modelada.

Um bom ajuste aos dados é essencial para determinar o coeficiente de permeabilidade à água. Alterne para o painel de ajuste de volume. Escolha para importar o arquivo de dados da área.

Escolha o último ajuste do indicador como a fonte do parâmetro. Escolha a classe de modelo. Comece com dois.

Os parâmetros PF pf slow PF e delay precisam ser inicializados, por exemplo, como mostrado, mas outros valores também são possíveis. Mark verifica se todos os três parâmetros devem ser ajustados. Clique em executar.

Em seguida, observe a figura provisória e ajuste o parâmetro de atraso e o comprimento do registro, se necessário. Examine o gráfico de resultados para avaliar o ajuste, a qualidade e registrar o erro de ajuste. Altere os parâmetros de inicialização algumas vezes cada e execute novamente.

Repita este procedimento várias vezes, começando com diferentes combinações de parâmetros de inicialização, visando o menor valor do erro de ajuste para determinar o coeficiente de permeabilidade à água ou pf, e comparar a atividade de diferentes aquaporinas Mesil Protoplasts de uma folha de opsys de coelho foram isolados e transformados separadamente com três construções gênicas com genes de aquaporina de um coelho, opsys e labirinto. Os protoplastos foram marcados por co-ran com um vetor que codifica a proteína fluorescente verde aprimorada. Os cursos de tempo das mudanças de volume celular após a exposição ao desafio hipotônico foram obtidos para cada célula, bem como o curso de tempo da mudança de osmolaridade do banho durante o desafio hipotônico, os valores de PF foram derivados para cada célula.

Utilizando o programa PF FIT, observou-se que os valores de PF dos PROTOPLASTS transformados com cada uma das três aquaporinas foram significativamente maiores do que o PF da célula controle transformada apenas com GFP. Uma vez dominada, essa técnica pode fornecer análise de algumas dezenas de células em alguns dias experimentais, se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a permeabilidade à água do SMO em protoplastos isolados ou outras células focais submetidas a um ensaio hipotônico.

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