Name: Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P F) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Aprenda a medir o coeficiente de permeabilidade osmótica da água (P f ) em protoplastos vegetais isolados para estudar a função das aquaporinas. Este método permite analisar mudanças de volume celular sob estresse osmótico.

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Este trabalho foi financiado por doações do Fundo Nacional Belga para fi Scienti c Research (FNRS), o Interuniversitário atração poloneses Programa-belga política científica e os &quot;Communauté Française de Belgique-ações de Recherches Concertées&quot; a FC, a partir do Israel Science Foundation Jerusalém ( ISF) para MM (Grant # 1311-1312) e NM (Grant # 1312-1312).

1 Preparação das Soluções <ol><li> Prepare isotónica (600 mOsm) e hipotónico (500 mOsm) soluções contendo 10 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, e 8 H 2 (N-morfolino) Ácido -etanossulfónico (MES), pH 5,7 e ajustar a osmolaridade com as quantidades apropriadas de D-sorbitol: 540 mm para o isotônico e 440 mm para a solução hipotônica. Verificar a osmolaridade da solução (dentro de 3% do valor alvo), utilizando um osmómetro. </li><li> Prepara-se uma pasta seca de &#39;mistura enzimática &quot;contendo as enzimas seguintes: 0,55 g de celulase, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (ver Tabela 1 abaixo), a mistura de pó seco por vórtice, fazer alíquotas de 5,7 mg e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2 Isolamento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo <ol><li> Prepara-se uma placa de Petri (10 cm) com cerca de 6 gotas (aproximadamente. 30 ul cada) de solução isotónica. </li><li> Descasque as abaxial epiderme (inferior) de folhas de Arabidopsis, cut a folha desenrolada em quadrados de cerca de 4 x 4 mm 2, em seguida, coloque os quadrados sobre a solução isotônica cai com o lado abaxial exposta para baixo, tocando a solução. </li><li> Dissolve-se 5,7 mg da mistura de enzima em 165 ul solução isotónica (3,3% w / w) em um tubo de 1,5 mL, misturar suavemente por pipetagem de um minuto ou então até se dissolver, e colocar várias gotas semelhantes da solução enzimática na mesma Petri prato. </li><li> Transferir os pedaços de folhas para a solução enzimática gotas, fechar o prato de vedação com a tampa rodada de um parafilme e incubar durante 20 min, o prato flutuante em um banho de água regulado para 28 ° C. </li><li> Adicionar algumas gotas de mais a solução isotónica com o prato (2 gotas por cada gota solução de enzima). Transferir cada pedaço de folha de uma nova gota solução isotónica e, em seguida, sequencialmente, a um segundo ponto (para lavar a solução enzimática de distância). Levante a peça pelas bordas usando uma pinça, agite-o na segunda queda (como um saquinho de chá) para liberar os protoplastos.Recolher as gotas com os protoplastos (usando uma pipeta de ponta de 100 ul cortado) para um tubo de 1,5 ml. </li></ol> 3. O hipotônico Desafio Ensaio: Inchaço celular Arabidopsis mesofilo <ol><li> Prepare o sistema de perfusão (Figura 1A), enchendo uma coluna com a solução isotónica e outra coluna com a solução hipotónica. Abra a válvula, deixe algum fluxo de solução (primeiro a hipotônica, em seguida, o isotônico) para encher o tubo todo o caminho para o colector de admissão (Figura 1B). Verifique se não há bolhas de ar, e em seguida, fechar a válvula. </li><li> Selar uma lamela, utilizando massa de silicone (Tabela 1), para fazer uma parte inferior para a câmara no interior da corrediça de plexiglass (Figura 1B, ver também o esquema da câmara na Figura 1C). Para fazer com que a parte inferior da câmara (a superfície voltada para cima da lamela exposto dentro do anel de gordura) &quot;pegajoso&quot; para protoplastos, revesti-la-com carga positiva-rolamento de sulfato de protamina (1% em água; Tabela 1) ou poli-L-lisina (0,1% em água, Tabela 1). Espalhe esta &quot;cola&quot; sobre a lamela utilizando uma ponteira, esperar por 1-2 min, lavar 3-4 vezes com a solução isotônica e sacudir para longe a solução restante. </li><li> Encher a câmara com a solução isotónica. Em seguida, adicione uma gota de protoplastos contendo solução para a câmara, usando uma ponteira cortado e esperar 3-4 minutos para os protoplastos para resolver. Cubra a câmara com uma tampa transparente (Figuras 1D, 1E) tocar a superfície da solução (evitar bolhas de interceptação abaixo). </li><li> Coloque o slide (suavemente!) Em uma mesa de microscópio invertido, conectá-lo ao sistema de perfusão ea bomba (proteção contra bolhas de ar na tubulação!) E ligar o fluxo de solução isotônica para perfusão constante de 1 mL / min (taxas mais rápidas pode ser utilizado, até 4 ml / min). </li><li> Para a gravaçãoas mudanças de volume, um microscópio invertido é usado, com um objectivo de 20X e com uma câmara de vídeo CCD ligada a um computador PC. Use o plugin &#39;CMU 1394 Camera Driver&#39; do software ImageJ (veja a tabela de materiais específicos para os endereços de download destes dois pedaços de software) para gravar um filme de vídeo de 60 segundos de protoplastos imóveis selecionados (presumivelmente, aqueles que estão presos ao fundo) a uma taxa de uma imagem / segundo (1 Hz). Iniciar a gravação com uma lavagem de 15 seg de a solução isotónica (isto constitui a linha de base), para comutar a uma solução hipotónica para 45 segundos (para completar um total de 60 segundos a partir do início da perfusão). Salve o filme em formato TIF. NOTA: Escolha um campo de visão com o maior número de células possível, cumprindo os seguintes critérios: esféricas e com um contorno de células bem focada em seu maior perímetro (Figura 2A). </li></ol> 4. análise do volume celular mudar usando ImageJ NOTA: Para analisar asérie de imagens de uma célula inchaço, use o campo &#39;Imagem Explorer&#39; e &#39;plugins protoplastos Analyzer&#39; no software ImageJ (escrito por Xavier Draye) 14. Começando com os protoplastos escolhidos em seu primeiro ponto de tempo, o plug-in &#39;protoplastos Analyzer&#39; irá detectar automaticamente as bordas protoplastos (contornos) e calcular a evolução temporal de suas áreas durante o experimento (os plugins estão disponíveis com o programa de análise de PfFit, abaixo) . <ol><li> Comece ImageJ. Para abrir o filme, clique em &quot;Arquivo&quot; no painel de ImageJ, então, consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: &#39;Importar&#39; então &#39;Imagem Explorer&#39;. Realce o filme escolhido, em seguida, clique com o botão direito sobre ele, então clique em &quot;protoplastos Analyzer &#39;. Percorra o filme (usando um controle deslizante na parte inferior da imagem de protoplastos) para identificar protoplastos que permanecem em grande parte imóveis durante o experimento - estes serão analisados. De volta à primeira image, usando o mouse, desenhe círculos (escolhidos a partir das ferramentas de desenho ImageJ) em torno dos protoplastos selecionados (Figura 2B) e clique em &#39;OK&#39; na tabela de &quot;Parâmetros de detecção&quot; que apareceram. </li><li> Para iniciar o algoritmo de detecção de protoplastos, clique em &#39;Local&#39; na imagem do painel superior protoplastos, em seguida, &quot;processo&quot; no menu suspenso. Examine os círculos verdes em torno das protoplastos selecionados (Figura 2C) durante todo o filme. Salve o &#39;resultado&#39; em um arquivo do Excel. Saia do ImageJ. NOTA: No caso de um ponto vermelho aparece (para indicar um mau contorno apto - geralmente devido a um pobre contraste da imagem), execute novamente com parâmetros diferentes. </li><li> Para separar as linhas pertencentes a cada célula (que - se duas ou mais células foram analisadas simultaneamente - serão interligados, porque a análise é feita quadro a quadro), em Excel, classificar os dados salvos pela coluna número de células (&#39;objeto&#39; ). </li><li> Para Determine o fator de conversão pixel-a-mm para obter o valor real de P f, tirar uma imagem de uma régua micrométrica via o mesmo objetivo 20X microscópio. Arraste uma linha (escolhidos entre as ferramentas de desenho ImageJ) a imagem régua ao longo e ler o número de pixels equivalente ao comprimento da régua na parte inferior do painel principal do ImageJ. Converta os valores de área de pixel arbitrários no arquivo Excel em mM 2. Salve o curso áreas hora (para cada célula separadamente) como um arquivo de texto (duas colunas de números únicos). NOTA: Esta será uma entrada para o programa &#39;PfFit&#39; de ajuste de volume. </li></ol> 5 Modelagem da Taxa de osmolaridade Mudança na Câmara Experimental Usando ImageJ eo f Fit Matlab Programa P <ol><li> Adicionar 2 mg de xilenocianol (Tabela 1, abaixo) a 100 ml de solução isotónica (para produzir o &#39;Indicador Dye&#39;). </li><li> Prepare o sistema de perfusão (como em 3.1) com o Indicador Dye eo h não tingidosolução ypotonic. </li><li> Selar a lamela utilizando graxa de silicone para o fundo da câmara de acrílico, em seguida, preencher com cuidado a câmara com o Indicador Dye, cobri-lo com uma lamela (como acontece com os protoplastos antes) e colocá-lo no palco microscópio. </li><li> Ligue a câmara para o sistema de perfusão e a bomba, e ligar o corante indicador de fluxo para uma perfusão constante em l ml / min. </li><li> Gravar um filme de 60 segundos, à taxa de 1 Hz. Inicie a gravação com 15 segundos de Indicador Dye, mudar para a solução hipotônica para 45 seg. Parar de filmar. Lave com o Indicador Dye (pelo menos durante 30 segundos), em seguida, começar um novo filme. Repita cerca de 5-6 vezes e salvar todos os filmes </li><li> Use o software ImageJ para analisar as imagens de vídeo da transmitância Indicador Dye para obter um curso da mudança transmitância tempo em média. <ol><li> Comece ImageJ, clique em &quot;Arquivo&quot; e, em seguida, &quot;Open&quot;, e navegar para o filme. Para cada filme, desenhar a 10 pixels de largura verticaisretângulo em qualquer lugar na 1 ª imagem do filme. Clique em &#39;Imagem&#39; no painel principal do ImageJ, clique em &#39;Cortar&#39; no menu suspenso. </li><li> Para alinhar os 60 quadros (do filme de 60 segundos) em uma linha, clique novamente &#39;Imagem&#39;, em seguida, clique consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: &#39;Pilhas&#39; e &#39;Fazer Montagem &quot;(colunas 60, linhas 1). Desenhe um 1 pixel alta retângulo horizontal em qualquer lugar ao longo de toda a linha de imagens e clique em &quot;Analisar&quot; no painel principal do ImageJ, em seguida, clique em &quot;perfil enredo&quot; no menu suspenso. NOTA: A &#39;Lote de Montagem de&#39; janela aparecerá (não mostrado), e uma lista de dados de transmitância pode ser aberta a partir do seu menu. Cada imagem do filme é representado nesta lista de 10 valores de transmitância originadas na sua 10 pixels de largura retângulo e, conseqüentemente, a &quot;base de tempo&quot; (o número seqüencial de imagem) é 10 vezes mais. </li><li> Copie as listas da dat transmitânciaum (uma lista por vídeo) para um arquivo Excel. Calcular a média dos cursos de tempo de transmitância obtidas a partir dos vários filmes dos resplendores Indicador Dye. Gerar uma base de tempo real através da multiplicação do número sequencial de imagem por 0,1. Salve o curso de tempo média (duas colunas) para um arquivo de texto. NOTA: Antes de média, se desejar, traçar os períodos individuais, para rejeitar quaisquer irregularidades. Certifique-se de que o filme inclui, pelo menos, 5 segundos finais de transmitância em estado estacionário do corante indicador. </li></ol></li><li> Inicie o programa de encaixe P f Fit Matlab (painel de &#39;Indicador Fit &quot;, Figura 3) para calcular os vários parâmetros do curso de tempo da osmolaridade. NOTA: com base nas concentrações iniciais e finais conhecidos da solução no banho, o curso do tempo da concentração osmótica mudança da solução é calculada a partir do curso de tempo de concentração (calculado, por sua vez, a partir do indicador de transmitância tintura), supondo que ele segue a mesma dinâmica como aconcentração de corante. P f Fit é um programa disponível para uso gratuito. O &#39;PfFit_Installer_web.exe&#39; pode ser baixado a partir de: P f Guia Fit Usuário &#39;com explicações e definições é acessível através de Jove como um arquivo suplementar, que ajuda a familiarizar o usuário com a P f programa Fit. </li><li> No painel &#39;Indicador Fit&#39;, importe os dados do curso o tempo médio do transmitância Indicador Dye (&quot;arquivo de dados Indicador &#39;, Figura 3A) e inserir manualmente os parâmetros da experiência atuais e as estimativas iniciais dos parâmetros&quot; width &quot;e&quot; t_half &#39;descreve a evolução temporal da concentração Indicador Dye (Figura 3B. Clique em &quot;Executar&quot; para ver as parcelas dos cursos de tempo da concentração Indicador Dye (dados reais e em forma, Figura 4A), e do calculado banho modelado () osmolaridade (Figura 4B). NOTA: agood ajuste aos dados é essencial (uma recomendação: comece com os valores mostrados na Figura 3). </li></ol> 6 Determinar o f P usando o Matlab programa de adaptação P f Fit NOTA: Além dos pressupostos básicos com relação ao comportamento de um protoplasto como um verdadeiro e perfeito osmï¿½etro 11, a determinação do P f repousa na presunção de que P f pode mudar com o tempo, que essa dinâmica de P f subjacente ao tempo Claro que a variação de volume da célula e que três parâmetros são suficientes para descrever: fi P (o valor inicial de P f), Pista Pf (a taxa de variação linear de P f) e de retardo (o período desde o início do banho mudança osmolaridade até o início da alteração do volume da célula). Diferentes modelos podem ser testados, incluindo diferentes combinações desses parâmetros e seus valores, incluindo valores nulos 11. P <sub&gt; f Fit procura a melhor combinação destes parâmetros para se obter - pelo cálculo - a reprodução mais fiel do curso da variação de volume da célula 11, o tempo calculado experimental, por sua vez, a partir da série de áreas de células importado-contorno (ver também o Suplementar &#39;P f Guia Fit Usuário &quot;). <ol><li> Mude para o &#39;Volume Fit&#39; painel (Figura 5). Escolha para a importação do arquivo de dados de áreas (o arquivo de texto com o curso do tempo das &quot;áreas&quot; dos protoplastos analisados, Figura 5A). Escolha &#39;Last Indicador de montagem&#39; como fonte de parâmetros (Figura 5B, ver o &#39;P f Guia Fit Usuário&#39; de alternativas). NOTA: Estes parâmetros (Figura 5D) são então usadas para regenerar a mudança osmótico no banho para os volumes correspondentes ao procedimento. </li><li> No painel &#39;Volume Fit&#39; (Figura 5C), inicializar (preencher as estimativas iniciais para os parâmetros F) P: P f, Slope Pf e Delay (uma recomendação: começar com 1, 1, e 30, respectivamente), escolheu a modelo &#39;Class&#39; (uma recomendação: começar com II e marca &#39;cheques&#39; para todos os três parâmetros a serem instaladas). Clique em &quot;Executar&quot; e, em seguida globo ocular a figura provisória (Figura 5E) e ajuste o parâmetro Delay eo comprimento do registro, se necessário. </li><li> Examine o gráfico resultados (Figura 6) para avaliar a qualidade em forma e gravar o erro em forma. Altere os parâmetros de inicialização alguns Dobre cada, e re-&#39;Run &#39;. NOTA: Não desanime quando o programa fica preso - basta reiniciar o programa! </li><li> Repita esse procedimento várias vezes, começando com diferentes combinações de parâmetros de inicialização, visando o menor valor do erro em forma. </li><li> Copie a lista dos resultados de ajuste diretamente a partir da tela, ou encontrá-los em tele PfFit gerado pelo arquivo &#39;_FIT_Vol_Results.txt&#39;. </li></ol>

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Aqui descrito é um procedimento simples e muito eficiente para medir a P f isoladas de protoplastos de plantas, em princípio, aplicável também a outras células esféricas, por exemplo., Os oócitos de rã 11. Este método baseia-se na medição da P f em resposta a um desafio osmótico para a célula. Em contraste com os outros métodos com base nesta abordagem, no entanto, a alteração das soluções, ou seja, da osmolaridade, não é instantânea, mas gradual, durante um banho de pe...

A absorção de água eo fluxo através das membranas celulares é um requisito fundamental para a existência de plantas, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Ao nível celular, aquaporinas (AQPs) desempenham um papel fundamental na regulação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) da membrana celular 1-3. Até à data, vários métodos têm sido utilizados para medir a endógena P f de protoplastos de diferentes órgãos da planta (ou seja, raízes, mesofilo, endoderme, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uma das abordagens para medir P f é expor os protoplastos a um desafio osmótica e para controlar a velocidade inicial da sua alteração de volume (isto é., O declive da fase linear inicial da alteração de volume). Dois métodos diferentes foram previamente descritos com base nesta abordagem, tanto com base em uma troca instantânea de soluções. O primeiro consiste em immobilizing o protoplasto com uma micropipeta de sucção e interrupção do fluxo de solução a 5 e a segunda transferência de protoplasto de uma solução para outro, utilizando uma micropipeta 6. Estes métodos transferência de sucção micropipeta e micropipeta, que permitem a aquisição de imagens logo no início da troca rápida solução (para capturar a fase linear precoce de alteração de volume), provavelmente envolverá um esforço físico para protoplastos e requerem equipamentos especializados e micromanipulação especialista. O método aqui descrito minimiza a perturbação das células, e não envolve a micromanipulação permite derivação de P f quando o banho de perfusão não é instantânea. Após a digestão enzimática, os protoplastos, submersas numa solução isotónica, são imobilizados no fundo lamela de vidro de Plexiglass (aka Lucite ou perspex) por câmara de interacção de cargas. Em seguida, durante um banho de perfusão constante,a solução isotônica é nivelado afastado por uma solução hipotônica gerando um desafio hipoosmótico aos protoplastos. O inchamento do protoplasto é vídeo gravado e, em seguida, através da combinação da informação sobre a evolução no tempo do banho de perfusão e o curso de tempo da expansão celular, a P f é determinada por procedimentos de processamento de imagem e de ajuste de curva. As vantagens deste método é que a experiência é muito eficiente, ou seja, é possível acompanhar algumas células simultaneamente em um único ensaio, e que não requer equipamento especial ou habilidades específicas de micromanipulação. Várias aplicações para este método são possíveis. Por exemplo, a determinação da P f nativo de uma variedade de células de diferentes tecidos e plantas, tais como mesófilo e agrupar as células da bainha de folhas de Arabidopsis 7, milho mesofilo ou células do córtex da raiz de 8-10 ou de suspensão de células cultivadas 11,12. Em additina, é possível determinar P f de células de animais, tais como células esféricas 11 oócitos. Outro exemplo envolve a análise da actividade AQP pela expressão transitória de seu gene nos protoplastos (ou quaisquer outros genes que possam afetá-los, por exemplo, genes de quinases) e determinação de sua contribuição para a P f; por exemplo, a expressão de tomate AQP SlTIP2; 2 em Arabidopsis mesofilo protoplastos por transformação PEG e determinação do SlTIP2; 2 relacionada com a P f 13. Finalmente, o exame do efeito sobre o f P de diferentes substâncias (moléculas / medicamentos, hormonas, etc) adicionado às soluções podem também ser examinadas, por exemplo, o bloqueador de AQP HgCl 2 7. O protocolo seguinte descreve o isolamento de protoplastos de células e determinação da sua P f Arabidopsis mesófilo.

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247-1</td><td><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> Qualquer fonte, grau anal</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>11718006</td><td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> Qualquer fonte, anal. grau</td></tr><tr><td>2-(N-morfolina)-ácido etanossulfônico (MES)</td><td>Sigma</td><td>15152002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com Qualquer fonte, anal. grau</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>18032003</td><td>http://www.sigmaaldrich.com Qualquer fonte, anal. grau</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, EUA</td><td>LS002603</td><td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Karlan,&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Phonix, AZ, EUA</td><td>8006</td><td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td></tr><tr><td>Polivinil-pirrolidona K 30 (PVP)</td><td>Sigma</td><td>81420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Albumina de soro bovino (BSA)</a></td><td>Sigma</td><td>A9418-5G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http:// www.sigmaaldrich.com< / a ></td></tr> <tr><td>sulfato de protamina</td><td>Sigma</td><td>P4380</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>xileno cianol</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>graxa de vácuo de silicone pesada</td><td>Merck</td><td>107921</td><td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=verdadeiro& anexos=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=verdadeiro& anexos=CoA</a></td></tr><tr><td>Microscópio invertido&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100/TS100F</td><td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>BIO-RAD</td><td>EP-1 Econo&nbsp; Pump</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Câmera digital em tons de cinza</td><td>Scion Corporation</td><td>CFW-1308M</td><td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td></tr><tr><td>CMU 1394 Camera Driver' plugin para ImageJ</td><td>Carnegie Mellon</td><td></td><td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> Software livre</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> Software livre</td></tr><tr><td>Kit de conexões para bomba Econo Gradient</td><td>BIO-RAD</td><td>731-9006</td><td><a href="http:// www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Conectores, coletor</td><td>DirectMed</td><td></td><td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? AÇÃO=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S</a></td></tr><tr><td>Conjuntos de infusão de bureta (colunas)</td><td>Welford</td><td>IF-BR-001</td><td>Tubulação http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td></tr><tr><td></td><td>TYGON</td><td>R-3603</td><td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td></tr><tr><td>3M embalagem Fita adesiva 1'', transparente</td><td>Viking Industrial, Reino Unido</td><td>VKMONO25</td><td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8</a> qualquer fita adesiva transparente (fita adesiva, etc.) provavelmente estará OK</td></tr></tbody></table>

medindo o coeficiente de permeabilidade osmótica de água (p<sub&gt; f</sub&gt;) de células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Estudar mecanismos de regulação AQP é crucial para a compreensão das relações de água, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Apresentada aqui é um método simples e muito eficiente para a determinação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) em protoplastos de plantas, em princípio aplicável também a outras células, tais como esféricas oócitos de rã. A primeira etapa do ensaio é o isolamento de protoplastos a partir do tecido de planta de interesse por digestão enzimática para uma câmara com uma solução isotónica adequada. A segunda etapa consiste em um ensaio de desafio osmótica: protoplastos imobilizados no fundo da câmara é submetido a uma perfusão constante de partida com uma solução isotónica e seguido de uma solução hipotónica. O inchaço da célula é de vídeo gravado. Na terceira etapa, as imagens são processadas desligada para proporcionar mudanças de volume, e o curso de tempo das alterações de volume está correlacionada com a evolução no tempo da mudança de osmolarança do meio de perfusão da câmara, usando um procedimento de ajuste de curva escrito em Matlab (a &#39;PfFit&#39;), para se obter P f.

A fim de determinar o P f e comparar a actividade de diferentes AQPs, mesófilo protoplastos de folha de Arabidopsis são utilizados. Estes protoplastos foram encontrados a ter baixos basal (fundo) P f níveis 7 e pode servir como um sistema de expressão funcional para permitir medições P f reprodutíveis. Os protoplastos a partir de uma folha madura a partir de uma planta Arabidopsis seis semanas de idade foram isolados e três construções de genes com...

Medir o coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) de células pode ajudar a compreender os mecanismos de regulação de aquaporinas (AQPs). P f determinação em protoplastos de células de plantas esféricas aqui apresentados protoplastos envolve o isolamento e análise numérica da sua velocidade inicial da alteração de volume, como um resultado de um desafio osmótica constante durante a perfusão de banho.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

O objetivo geral do experimento a seguir é aprender sobre a função das aquaporinas determinando o coeficiente de permeabilidade osmótica à água, ou PF de protoplastos vegetais. Corte um pedaço de uma folha sem epiderme axial e coloque-o em uma solução isotônica. Transferir as peças para uma solução enzimática e incubar durante 20 minutos a 28 graus Celsius, depois para uma solução isotónica fresca.Em seguida, colete os protoplastos contendo solução com uma ponta cortada. Como segundo passo, prepare uma câmara experimental. Prenda uma lamínula na parte inferior da corrediça usando graxa de silicone.Em seguida, cubra o fundo da câmara com uma cola de carga positiva e encha a câmara com uma solução isotônica. Protoplastos isolados são então adicionados à câmara, e a câmara é colocada delicadamente na platina do microscópio. Posteriormente, os protoplastos são expostos a uma solução hipotônica enquanto os vídeos são gravados para capturar seu curso de tempo de inchaço.Em seguida, o curso do tempo de inchamento é analisado numericamente por software, incluindo procedimentos de ajuste de precisão, a fim de determinar o PF de cada protoplasto, com base nos resultados da análise numérica são obtidos que mostram diferenças no PF induzidas, por exemplo, pela expressão de diferentes genes de aquaporina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia da membrana celular, como a regulação da função da aquaporina. Embora este método possa fornecer informações sobre a água mática, a permeabilidade das plantas aquáticas são nativas ou geneticamente modificadas.Também pode ser aplicado a outros sistemas, como origem de interesse exposta a ide. Antes de iniciar este procedimento, prepare as soluções isotônicas e hipertônicas necessárias e verifique sua osmolaridade. Usando um filtro OSM, a osmolaridade de cada solução deve estar dentro de 3% do valor alvo.Encha uma placa de Petri de 10 centímetros com cerca de seis gotas de solução isotônica. Descasque o selo ABBA ou abaixe a epiderme da folha de uma esponja de coelho e corte a folha descascada em quadrados de cerca de quatro por quatro milímetros. Coloque os pequenos pedaços sobre as gotas de solução isotônica com o lado axial exposto voltado para baixo e tocando a solução.Em seguida, dissolva 5,7 miligramas da mistura enzimática em 165 microlitros de solução isotônica em um tubo de 1,5 mililitro e misture delicadamente pipetando por um minuto ou mais até dissolver. Coloque várias gotas semelhantes da solução enzimática na mesma placa de Petri. Transfira os pedaços de folhas para a solução enzimática. Gotas.Feche o prato e feche a tampa com uma rodada de perfil. Flutue o prato em banho-maria a 28 graus Celsius por 20 minutos. Após 20 minutos, adicione mais algumas gotas da solução isotônica ao prato usando uma pinça.Levante cada pedaço de folha por sua borda para transferi-lo para uma nova solução isotônica Gota e, em seguida, sequencialmente para uma segunda gota. Agite o pedaço de folha na segunda gota para liberar os protoplastos usando uma ponta de pipeta de 100 microlitros cortada. Colete as gotas com os protoplastos em um tubo de 1,5 mililitro.Preparar o sistema de profusão preenchendo uma coluna com a solução isotónica e outra coluna com a solução hipotónica. Abra a válvula para deixar um pouco de solução hipotônica fluir para encher a tubulação até o coletor de admissão. Depois de garantir que não haja bolhas de ar presas, feche a válvula.Repetir para a solução isotónica. Sele uma lamínula usando graxa de silicone para fazer um fundo para a câmara dentro da lâmina de plexiglass para tornar o fundo da câmara pegajoso para protoplastos, cubra-o com sulfato de protamina com carga positiva ou poli L lisina. Use uma ponta de pipeta para espalhar essa cola sobre a lamínula.Aguarde de um a dois minutos. Enxágüe três a quatro vezes com a solução isotônica e sacuda a solução restante. Encher a câmara com a solução isotónica.Em seguida, use uma ponta de pipeta cortada para adicionar uma gota de protoplastos contendo solução à câmara. E espere de três a quatro minutos para que os protoplastos se assentem. Cubra a câmara com uma tampa transparente tocando a superfície da solução.Evite prender bolhas de ar por baixo. Coloque uma lâmina suavemente em uma mesa de microscópio invertida e conecte-a conectada ao sistema de perfusão e à bomba protegendo contra bolhas de ar na tubulação. Ligue o fluxo de solução isotônica para perfusão constante a um mililitro por minuto.Para registrar as alterações de volume, escolha um campo de exibição com o maior número possível de células de formato esférico e com um contorno de célula bem focado em seu maior perímetro. Grave um 62º vídeo de protoplastos imóveis selecionados a uma taxa de uma imagem por segundo ou um hertz. Inicie a gravação com uma lavagem de 15 segundos da solução isotônica e mude para a solução hipertônica por 45 segundos.Salve o filme no formato Tiff em Para analisar uma série de imagens de uma célula inchada, use os plug-ins Image Explorer e protoplasts analyzer no software image J. Iniciar imagem J.To abrir o filme, clique em arquivo no painel Imagem J e, em seguida, consecutivamente nos menus suspensos à medida que eles desdobram a importação. Em seguida, o explorador de imagens.Destaque o filme escolhido. Clique com o botão direito sobre ele e depois para a esquerda. Clique em analisador de protoplastos.Na primeira imagem, use o mouse para desenhar círculos ao redor dos protoplastos selecionados. Em seguida, clique em OK. Na tabela de parâmetros de detecção que aparece para iniciar o algoritmo de detecção de protoplastos, clique em local no painel superior da imagem de protoplastos.Em seguida, processe. No menu suspenso, examine os círculos verdes ao redor dos protoplastos selecionados ao longo do filme. Usando o controle deslizante inferior, salve os resultados em um arquivo do Excel.A análise é feita quadro a quadro. Portanto, no caso de mais de uma célula, a classificação é necessária para separar as linhas pertencentes a cada célula Aqui. Os três cursos de tempo são mostrados em uma planilha do Excel antes e depois da classificação com os valores de área convertidos de pixels para micrômetros quadrados.Cada curso de tempo é exportado para um arquivo de texto separado. Para iniciar este procedimento, conecte a câmara ao sistema de perfusão e à bomba e ligue o indicador de fluxo da matriz para uma taxa de perfusão constante de um mililitro por minuto, grave um 62º vídeo à taxa de um hertz. Inicie a gravação com 15 segundos de matriz indicadora e, em seguida, mude para a solução hipertônica Por 45 segundos, pare a gravação.Nivelado com o indicador. Morra novamente por pelo menos 30 segundos. Antes de iniciar um novo filme, grave e salve de cinco a seis filmes para analisar os filmes.Para obter um curso de tempo médio da transmitância da matriz indicadora de mudança, inicie a imagem J clique no arquivo. Em seguida, abra e procure o filme. Para cada filme, desenhe um retângulo vertical de 10 pixels de largura em qualquer lugar na primeira imagem do filme, clique na imagem no painel principal da Imagem J.Em seguida, clique em cortar no menu suspenso. Para alinhar os 60 quadros em uma linha, clique em imagem e, em seguida, clique consecutivamente nos menus suspensos à medida que desdobram as pilhas e fazem a montagem. Desenhe um retângulo horizontal de um pixel de altura em qualquer lugar ao longo de toda a linha de imagens e clique em analisar no painel principal da Imagem J.Em seguida, clique em Perfil de plotagem. No menu suspenso, copie as listas dos dados de transmitância para um arquivo do Excel. Calcule a média dos cursos de tempo de transmitância obtidos dos filmes Sero das descargas de matrizes indicadoras.Gere uma base em tempo real multiplicando o número sequencial da imagem por 0,1. Salve o curso de tempo médio em um arquivo de texto para calcular os vários parâmetros do curso de tempo de osmolaridade. Use o programa de adaptação MATLAB PF fit, que está disponível para uso.Gratuito. Detalhes sobre como baixar e usar este programa estão disponíveis no texto do protocolo. No painel de ajuste do indicador.Importe os dados do curso de tempo médio da transmitância do corante indicador. Insira manualmente os parâmetros do experimento atual, as suposições iniciais dos parâmetros com formiga H. Descrevendo o curso de tempo da concentração do corante indicador também podem ser alterados. Clique em executar para visualizar o gráfico dos cursos de tempo da concentração do indicador DAI e da osmolaridade do banho modelada.Um bom ajuste aos dados é essencial para determinar o coeficiente de permeabilidade à água. Alterne para o painel de ajuste de volume. Escolha para importar o arquivo de dados da área.Escolha o último ajuste do indicador como a fonte do parâmetro. Escolha a classe de modelo. Comece com dois.Os parâmetros PF pf slow PF e delay precisam ser inicializados, por exemplo, como mostrado, mas outros valores também são possíveis. Mark verifica se todos os três parâmetros devem ser ajustados. Clique em executar.Em seguida, observe a figura provisória e ajuste o parâmetro de atraso e o comprimento do registro, se necessário. Examine o gráfico de resultados para avaliar o ajuste, a qualidade e registrar o erro de ajuste. Altere os parâmetros de inicialização algumas vezes cada e execute novamente.Repita este procedimento várias vezes, começando com diferentes combinações de parâmetros de inicialização, visando o menor valor do erro de ajuste para determinar o coeficiente de permeabilidade à água ou pf, e comparar a atividade de diferentes aquaporinas Mesil Protoplasts de uma folha de opsys de coelho foram isolados e transformados separadamente com três construções gênicas com genes de aquaporina de um coelho, opsys e labirinto. Os protoplastos foram marcados por co-ran com um vetor que codifica a proteína fluorescente verde aprimorada. Os cursos de tempo das mudanças de volume celular após a exposição ao desafio hipotônico foram obtidos para cada célula, bem como o curso de tempo da mudança de osmolaridade do banho durante o desafio hipotônico, os valores de PF foram derivados para cada célula.Utilizando o programa PF FIT, observou-se que os valores de PF dos PROTOPLASTS transformados com cada uma das três aquaporinas foram significativamente maiores do que o PF da célula controle transformada apenas com GFP. Uma vez dominada, essa técnica pode fornecer análise de algumas dezenas de células em alguns dias experimentais, se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a permeabilidade à água do SMO em protoplastos isolados ou outras células focais submetidas a um ensaio hipotônico.Para qualquer dúvida restante, não hesite em nos contatar.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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