Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

O objetivo geral deste procedimento é quantificar rapidamente em tempo real a invasão de células de câncer de ovário no modelo de co-cultura de células mesoteliais de asteróides de metástase. Isso é feito primeiro gerando câncer de ovário a partir de linhagens celulares, cultivando as células em condições não aderentes em metilcelulose. O segundo passo é preparar um analisador de células em tempo real, placa CIM, codificando a câmara superior dos dois bem compartimentados com matrigel para imitar a membrana basal subjacente ao mesotélio da cavidade peritoneal e ao próprio revestimento mesotelial.

Em seguida, os esteróides do câncer de ovário são colhidos e adicionados às câmaras superiores dos poços das placas do analisador em tempo real. A etapa final é programar e iniciar o analisador de células em tempo real, que fará leituras periódicas em intervalos predefinidos durante um período prolongado de ensaio. Em última análise, os resultados obtidos retratam o processo de invasão contínua, que é usado para determinar os principais fatores que regulam as células cancerígenas de ovário à medida que invadem as barreiras celulares e matriciais.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como ensaios transworld padrão de invasão de células cancerígenas, é que essa abordagem permite medições contínuas da invasão de células cancerígenas por longos períodos de tempo. Ao contrário de um único ensaio de endpoint, que não captura totalmente a natureza dinâmica das metástases do câncer de ovário, embora esse método seja usado para fornecer informações sobre o câncer de ovário, também pode ser aplicado para estudar diferentes tipos de processos metastáticos, como câncer de mama ou a ação de células cancerígenas através de uma camada endotelial. Da mesma forma, pode ser usado para estudar a invasão celular normal, como a invasão do trofoblasto durante a implantação do embrião Para preparar células de câncer de ovário para a marcação de células fluorescentes.

As primeiras células de colheita a 75% de fluência de co e resus suspendem as células a uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro em um mililitro de PBS pré-aquecido por 0,1% BSA Adicionar a quantidade ideal de esteróides por poço e manusear o esteróide com cuidado são essenciais para o sucesso deste procedimento. Em seguida, adicione dois microlitros de um estoque de cinco milimolares de solução de CSFE de traços celulares às células a uma concentração final de 10 micromolares e incube a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos Em banho-maria, resfrie a reação com um mililitro de meio gelado contendo 10% de FBS e regue por centrifugação. Reus. Gaste 10 mililitros do meio de crescimento pré-aquecido apropriado e das células da semente em uma cultura de frasco com filtro de 75 centímetros quadrados a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono até que o nível de marcação de fluorescência seja adequado para detecção.

Comece este procedimento medindo o volume de meio de cultura apropriado para cada linha celular, que é de 15 mililitros menos o volume de células necessário para a geração de esfe. Adicione três mililitros de solução estoque de metilcelulose ao meio de cultura para obter uma concentração final de metilcelulose de 20% e misture bem por inversão suave. Adicione 300.000 células ao meio contendo metilcelulose e misture bem por pipeta de inversão suave 150 microlitros da mistura de meios de metilcelulose celular em cada poço de uma placa de cultura de fundo côncavo de 96 poços.

Isso resultará em um total de 3000 células por poço de cultura em 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por um a quatro dias ou até a forma uniforme de PHE. Normalmente, um esteróide por poço é observado, o analisador de células em tempo real ou o ensaio de invasão de células RTCA utiliza uma placa CIM de 16 poços RTCA de duas câmaras. Trabalhando em grupos de quatro poços de cada vez, adicione 50 microlitros de matriz a cada poço da câmara superior da placa para garantir que a área total da superfície seja coberta.

Remova 30 microlitros de matriz imediatamente, mas lentamente, para se livrar de qualquer excesso de fluido. Incube a placa a 37 graus Celsius por quatro horas antes de usá-la em uma incubadora de cultura de tecidos. Após quatro horas, adicione 30 microlitros do meio livre de soro apropriado para cada linha de células cancerígenas à câmara superior e 160 microlitros de meio com ou sem soro.

De acordo com o projeto experimental para a câmara inferior, monte a placa CIM clicando a câmara inferior na câmara superior e equilibre em uma incubadora de 37 graus Celsius. Por uma hora em uma incubadora de cultura de tecidos, abra o programa RTCA e selecione a guia de layout. Destaque todos os poços experimentais, clique com o botão direito do mouse nos poços e selecione ativar poços.

Em seguida, preencha as condições experimentais e venda os nomes conforme desejado. Para adicionar etapas ou subetapas ao programa, selecione a guia de agendamento e clique com o botão direito do mouse em adicionar uma etapa. O primeiro passo é uma varredura de fundo pré-programada, que é incorporada automaticamente ao programa.

Depois de adicionar uma etapa, insira os detalhes do programa desejado para a etapa dois do programa RTCA, que registrará as leituras durante o estabelecimento da monocamada de células mesoteliais humanas LP nove. Adicione os intervalos de tempo entre as leituras de impedância selecionando a guia de intervalo e inserindo 15 minutos. Adicione a duração experimental selecionando a guia duração e inserindo um tempo entre 12 a 24 horas.

As etapas subsequentes são adicionadas da mesma maneira. A terceira etapa do programa RTCA direcionará o instrumento para fazer leituras durante a invasão de frid. Insira cinco minutos na guia de intervalo e 48 horas na guia de duração.

Selecione a placa na barra de menus e salve. Para iniciar este procedimento, coloque a placa CIM no instrumento RTCA e abra o programa que foi salvo anteriormente. Selecione executar na barra de menus e, em seguida, iniciar uma varredura em segundo plano será executada automaticamente.

Após a varredura de fundo, remova a placa CIM do instrumento e coloque-a em uma placa de capuz de cultura de tecidos. 50.000 LP nove células suspensas em 160 microlitros de meio livre de soro na câmara superior de cada placa CIM. Bem, coloque a placa no instrumento RTCA e faça leituras a cada 15 minutos enquanto a monocamada LP nove está se estabelecendo durante a noite no dia seguinte, corte assepticamente um milímetro do topo de uma ponta de pipeta de um mililitro e use-o para recuperar suavemente o conteúdo de cada poço para cada linha celular.

Pool 10 esteróides em uma centrífuga de tubo estéril. Esteróides a 120 GS por oito minutos e, em seguida, remova o meio contendo metilcelulose por aspiração suave. Lave o cuspe mais duas vezes com PBS centrif para usar a 120 GS por oito minutos para pellet esteróides após cada lavagem.

Para cada poço experimental, a Resus gasta um total de 10 esteróides em 160 microlitros de meio sem PBS. Pause o experimento RTCA selecionando executar na barra de menus e marcando a pausa. Remova a placa CIM do instrumento e coloque-a em uma capa de cultura de tecidos.

Aspire o meio de cada poço e substitua por meio contendo esteróides. Retorne a placa ao instrumento RTCA. Selecione executar na barra de menus e marque a etapa de anulação.

O programa passará para a próxima etapa automaticamente. Para retomar o experimento, selecione executar na barra de menus e marque iniciar continuar. A etapa três do programa RTCA iniciará neste experimento duas linhas de células epiteliais de câncer de ovário OVCA 4 33 e OVCA 4 29 e uma linha de tumor de células da granulosa ovariana.

KGN foram usados para gerar esteróides após cultura durante a noite e permanências de fundo em U suspensas em meio contendo metilcelulose. Todas as três linhagens celulares formaram estruturas esteróides compactas de aproximadamente 400 a 500 micrômetros de diâmetro. Os painéis inferiores mostram a linha celular correspondente cultivada em escala monocamada.

As barras representam 100 micrômetros uma vez formadas. Os esteróides foram colhidos e plaqueados em cima de uma monocamada de nove células mesoteliais LP em uma placa R-T-C-A-C-I-M. Imagens sob microscopia de contraste de fase ou sob microscopia fluorescente de culturas paralelas foram tiradas periodicamente para auxiliar na interpretação dos dados da RTCA.

É informativo avaliar tanto a camada basal de invasão de uma linhagem de células cancerígenas quanto a invasão induzida por quimioterapia. Neste exemplo, a invasividade basal é medida pela adição de meio livre sérico ou SFM às câmaras superior e inferior. Meios completos com 10% FBS, que contém muitos atrativos de quimioterapia potenciais, são usados para examinar a invasão induzida por atrativos de quimioterapia.

Aqui são mostrados os resultados representativos de uma comparação da invasão celular entre as células kgn e as nove células mesoteliais LP. O ensaio de invasão RTCA foi realizado com e sem FBS na câmara inferior da placa A CIM. Os resultados são mostrados como média positiva menos o índice de células SD de poços triplicados no ponto de tempo de 24 horas e durante um período inteiro de ensaio de dois dias.

Esses resultados confirmam que as células LP nove são minimamente invasivas ao longo de dois dias sob condições basais ou induzidas por quimioatraente e, portanto, eram um bom tipo de célula para uso em ensaios de co-cultura com células de câncer de ovário. Em contraste, KG e esteróides de câncer de ovário exibiram a capacidade de invadir um atrativo de quimioterapia. Este gráfico apresenta os resultados de uma comparação da capacidade invasiva das linhagens celulares K-G-N-O-V-C-A 4 29 e OVCA 4 33 representadas durante um período de 24 horas durante o ensaio de dois dias.

Todas as três linhagens celulares exibiram a capacidade de invadir um atrativo de quimioterapia, conforme indicado pelo aumento dos índices celulares. As linhagens celulares exibiram taxas de invasão semelhantes, conforme indicado pelas inclinações das linhas paralelas das curvas. No entanto, a curva OVCA 4 29 exibiu um maior tote asim superior, o que indicou um maior nível máximo de invasão em comparação com as outras linhagens celulares.

Em contraste, os níveis basais de invasão de todas as linhagens celulares foram baixos. Além disso, as linhagens celulares exibiram diferenças em seus tempos para o início da invasão, conforme mostrado por uma análise mais detalhada dos dados de invasão em um período de 2,5 horas. As células KGN invadem as barreiras celulares e matriciais rapidamente, enquanto as células OVC 4 33 e OVC 4 29 demoram três e cinco vezes mais para invadir, respectivamente.

É importante ressaltar que seus comportamentos no início da invasão não foram preditivos de sua capacidade geral de invasão. Isso sugere diferentes capacidades inerentes das linhagens de células cancerígenas, mas também pode indicar que diferentes fatores regulam os comportamentos invasivos precoces e tardios dos esteróides. Uma vez dominada, esta técnica é prontamente adaptável para estudar várias moléculas de sinalização e vias celulares dentro do microambiente peritoneal que afetam o comportamento metastático.

Isso pode ser alcançado pela adição de fatores de crescimento exógenos, citocinas ou inibidores à câmara inferior ou superior do poço. Alternativamente, você pode manipular geneticamente as próprias células cancerígenas ou as células-alvo peritoneais.