Name: Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Aprenda a quantificar em tempo real a invasão de células de câncer de ovário usando um analisador celular RTCA com placa CIM. Este método permite monitorar continuamente a dinâmica metastática em co-cultura com células mesoteliais.

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Este trabalho foi apoiado por uma CASS Fundação Ciência e Medicina Grant; (MB); um Conselho de Pesquisa Nacional de Saúde e Medicina da Austrália Projeto Grant (KLS, 338516); e pelo Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria (Austrália).

1. Preparação de células, Mídia e Reagentes <ol><li> Preparação do Meio contendo metilcelulose <ol><li> Dissolve-se 1,5 g de metil-celulose em 100 ml de Meio Eagle Modificado de Dulbecco estéril (DMEM) (sem aditivos) num frasco de 250 ml. </li><li> Aquece-se a solução em baixo no forno de microondas durante 5 min; tomar cuidado para evitar a ferver. </li><li> Uma vez que o pó de metilcelulose é semi-dissolvido, adicione um agitador magnético limpa e mídia para levar o volume para 125 ml. </li><li> Misturar, invertido, e agita-se à temperatura ambiente durante 1,5 horas, seguindo-se agitação a 4 ° C durante a noite. </li><li> Dividir a solução igualmente em quatro tubos de 50 ml e centrifugar durante 1,5 horas a 2300 x g. </li><li> Recolher o sobrenadante claro, altamente viscoso (cerca de 90-95% das ações), alíquota em estéreis tubos de 50 ml, e armazenar a 4 ° C por até 3 meses. </li></ol></li><li> Cultura e marcação de células <ol><li> Manter as linhas de células de câncer de ovário em monocamada em um tiincubadora de cultura ssue a 37 ° C, 5% de CO 2 em meio de crescimento apropriado (DMEM para as células KGN 17 e MCBD110: M199 para as linhas de células e OVCA429 OVCA433 18) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L -glutamina, e 1% de penicilina-estreptomicina. </li><li> Manter as células mesoteliais humanas LP9 em M199: Hams meio F12 contendo 15% de FBS, 10 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF) e 400 ng / ml de hidrocortisona, numa incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Células semente no tamanho desejado frasco e crescer para cerca de 75% de confluência. Células colheita por tripsinização utilizando 0,05% de tripsina / EDTA, rotação em 186 xg durante 5 min, e lave o peletizado de células duas vezes com PBS. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. </li></ol></li><li> Opcional fluorescente método de marcação celular <ol><li> Ressuspender as células cancerosas, a uma concentração final de 1 x 10 6 células / ml em 1 ml de pré-aquecido PBS/0.1% de BSA. </li><li> Adicione 2 mL de 5 mM estoque celular Trsolução CSFE ace (ou outro marcador de células preferida, que é mantida a longo prazo) de células a uma concentração final de 10 uM e incubar a 37 ° C durante 10-15 minutos em banho-maria. </li><li> Extingue-se a reacção com 1 ml de gelo meio frio contendo FBS a 10% e novamente por centrifugação. Ressuspender em 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido adequado (ver passo 1.2.1). </li><li> Células de sementeira em um 2 frasco com tampa de filtro de 75 cm e a cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Verificar as células sob um microscópio de fluorescência para verificar que o nível de marcação de fluorescência é adequado para detecção. Uma vez que células atingem aproximadamente 75% de confluência, colheita e contar como nos passos 1.2.3 e 1.2.4 acima. </li></ol></li></ol> 2. Geração de esferóides em Metilcelulose <ol><li> Calcule o volume de células de câncer de ovário a partir da Secção 1 necessárias para a geração de esferóide (um total de 300.000 células são necessárias para cada full 96 poços experimento placa). Nãote: se utilizando diferentes linhas de células do que aqui apresentado, as densidades celulares para a produção de esferóide uniforme pode ter de ser optimizada para cada linha. </li><li> Para calcular a diluição das células em meio de metilcelulose, em primeiro lugar, subtrair o volume de células necessário (passo 2.1) a partir de 15 ml. </li><li> Adicionar 3 ml da solução de metilcelulose (para fazer 20% de metilcelulose final) a um volume de meio de cultura apropriado para cada linha celular, igual a 15 ml, menos o volume da célula e misturar bem por inversão suave. </li><li> Adicionar 300.000 células para o meio contendo metilcelulose e bem misturados por inversão suave. </li><li> Pipete 150 pi da mistura de células / metilcelulose / média (para um total de 3.000 células / poço) a cada poço de uma placa de cultura de 96 poços de fundo côncavo e cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1-4 dias ou até formar esferóides uniformes (1 esferóide / poço é tipicamente observado). </li></ol> 3. RTCA celulares Invasão Ensaios NÃOTE: As leituras de impedância são expressos como Índice de célula (Cl), um parâmetro adimensional que é uma mudança relativa da impedância celular medida que representa o estado da célula. Para análise, os dados de importação em uma planilha, como o Microsoft Excel. <ol><li> Preparação Placa <ol><li> Trabalhando em grupos de quatro poços ao mesmo tempo, adicionar 50 ul de matriz (diluídas a 1:10 em meio de cultura livre de soro) para cada poço da câmara superior de uma placa de 16 poços RTCA CIM para assegurar que a área total da superfície está coberta . Retire 30 mL de matriz de imediato, mas devagar, para se livrar de qualquer excesso de líquido. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 4 horas antes de ser utilizado numa incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Adicionar 30 ul de meio isento de soro (SFM) apropriadas para cada linha de células de cancro para a câmara superior e 160 ul de meios de comunicação com ou sem soro (como por seu desenho experimental) para a câmara inferior. </li><li> Monte a placa CIM, clicando na câmara inferior à câmara superior e equilibrcomeu numa incubadora a 37 ° C durante 1 hora numa incubadora de cultura de tecidos. </li></ol></li><li> Programação do Instrumento RTCA <ol><li> Abra o programa RTCA e selecione a guia &quot;layout&quot;. Destaque todos os poços experimentais. </li><li> Clique direito sobre poços e selecione &quot;Ativar poços &#39;; em seguida, preencha as condições experimentais e nomes de células se o desejar. </li><li> Para adicionar etapas ou sub-passos para o programa, selecione a guia &quot;Agenda&quot; e clique direito em &#39;Adicionar um passo &quot;. O primeiro passo é uma varredura de fundo pré-programado, que é automaticamente incorporado no programa uma vez &#39;adicionar um passo&#39; é escolhido. </li><li> Digite os detalhes do programa desejadas para Etapa 2 do programa RTCA, que irá gravar as leituras durante o estabelecimento da monocamada LP9. Adicione os intervalos de tempo entre as leituras de impedância, selecionando a guia &#39;Intervalo&#39; e inserir &#39;15 min &#39;. Adicionar duração experimental, selecionando o &#39;duração&#39; guia umd inserindo um tempo entre 12-24 horas. </li><li> Para adicionar etapas subseqüentes, selecione a guia &quot;Agenda&quot; e clique direito em &#39;Adicionar um passo&#39; e digite os detalhes das medidas adicionais, como acima. Etapa 3 do programa RTCA vai dirigir o instrumento para fazer leituras durante a invasão esferóide; entrar min &#39;5 &#39;sob o&#39; guia &#39;e &#39;48 horas&#39; Interval na aba &#39;Duração&#39;. </li><li> Selecione &quot;Placa&quot; na barra de menu e salvar. </li></ol></li><li> Geração de LP9 monocamada e Mensuração de esferóide Invasion <ol><li> Coloque placa CIM em instrumento RTCA e programa aberto a partir do Passo 3.2 acima. Antes de adicionar células, selecione &quot;Executar&quot; na barra de menu e, em seguida, &#39;Start&#39;. Uma varredura de fundo será automaticamente realizada (Passo 1 nas instruções de software RTCA). </li><li> Remova a placa CIM do instrumento após a varredura de fundo e coloque em uma capa de cultura de tecidos. </li><li> Placa 50,000 LP9 células suspensas em 160 mL SFM na câmara superior de cada placa CIM bem. </li><li> Coloque a placa no instrumento RTCA e fazer leituras a cada 15 minutos, enquanto a monocamada LP9 é estabelecer durante a noite (Etapa 2 do programa RTCA). </li><li> Esferóides câncer Colheita gerado na etapa 2 &#39;Geração de esferóides em metilcelulose&#39;, acima. <ol><li> Assepticamente, cortar um milímetro a parte superior de uma ponta de pipeta de 1 ml e usar para recuperar suavemente o conteúdo de cada poço. Transferir para um tubo estéril. </li><li> Centrífuga esferóides a 120 xg por 8 min e remover metilcelulose contendo meio por aspiração suave. </li><li> Lave esferóides mais duas vezes com PBS, centrifugação a 120 xg por 8 min para sedimentar esferóides após cada lavagem. </li><li> Para cada poço experimental, ressuspender um total de 10 esferóides em 160 ul de meio sem FBS. </li><li> Pause o experimento RTCA, selecionando &quot;Executar&quot; na barra de menu e verificando &amp;# 8216; Pausa &quot;. Remova a placa CIM do instrumento, e coloque em uma capa de cultura de tecidos. Aspirar fora da mídia de cada poço e substituir com a mídia esferóide contendo (10 esferas em 160 mL) ou meio fresco para poços de controlo somente LP9. </li></ol></li><li> Retorne a placa para o instrumento RTCA. Selecione &quot;Executar&quot; na barra de menu e verifique &#39;Abortar passo&#39;. O programa vai passar para o próximo passo automaticamente. Para retomar o experimento, selecione &quot;Executar&quot; na barra de menu e marque &quot;Iniciar / Continuar &#39;. Passo 3 no programa RTCA iniciará. </li></ol></li><li> Análise de Dados <ol><li> Para determinar o nível de capacidade de invasão de células esferóide, subtrair os valores obtidos para a monocamada LP9 apenas a partir dos valores individuais obtidos para as linhas celulares de cancro do ovário, em cada ponto de tempo. </li><li> Para traçar &#39;invasão esferóide&#39;, normalizar todos os valores para o ponto de tempo em que os esferóides foram adicionados à placa, por setting que ponto do tempo para &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Taxa de acesso aberto paga pela ACEA Biosciences, Inc. e MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Que invadem as células de cancro do ovário interagir com uma variedade de tipos de células na superfície do peritoneu, incluindo fibroblastos, adipócitos e células mesoteliais, e a comunicação bidireccional entre as células cancerosas e as células peritoneais é pensada para desempenhar um papel-chave na condução do processo metastático 2. Uma vez dominado, o protocolo aqui descrito é facilmente adaptável para o estudo destas interacções dentro do microambiente peritoneal, por exemplo, através da adição de citocinas exógenas, factores de crescimento, ou inibidores específicos para as câmaras superiores e inferiores da placa de CIM bem ou manipulação genética do cancro ou de linhas de células peritoneais. Além disso, este método pode ser usado com as células do tumor dos ovários primários colhidos de fresco a partir de ascite maligna e / ou células peritoneais primárias para obter insights directas para os sinais de regulação e das interacções celulares que governam a criação de uma lesão metastática no interior da cavidade peritoneal <sup&gt; 2. A utilização do instrumento RTCA para medir a capacidade invasiva de células individuais ou esferóides oferece várias vantagens sobre os ensaios de terminais individuais convencionais e analisa imagem time-lapse. O instrumento mede RTCA invasão celular em intervalos definidos de forma contínua durante o curso de um ensaio, o qual pode demorar horas ou dias. Isso permite a determinação de mudanças na taxa de invasão ao longo do tempo, o que supera as limitações dos ensaios de terminais individuais. Por exemplo, analisando os dados de invasão das linhas celulares de cancro diferentes em um único ponto de extremidade (Figura 2), por exemplo, 3 horas, pode ter levado à conclusão errônea de que KGN e OVCA433 células eram muito mais invasivo do que OVCA429 células. Outra vantagem desta tecnologia é que o instrumento RTCA mede mudanças na impedância elétrica. Isto significa que os ensaios podem ser executados sem marcação das células com um agente exógeno, o que poderia ter repercussões indesejadas sobre phen celularotype ou função. Isto torna-se particularmente importante quando se estuda as células de câncer de ovário primários derivados da ascite maligna, com o qual é imperativo manter manipulações ao mínimo, de modo a evitar a introdução de alterações moleculares e fenotípicos que não são o reflexo de sua natureza in vivo 2. Além disso, a utilização do aparelho RTCA permite a recolha de dados quantitativos em tempo real, o que não só evite o demorado análises associados com microscopia de lapso de tempo, mas também permite a determinação rápida de janelas experimentais fundamentais para a optimização do ensaio. Isto é particularmente útil quando se comparam os efeitos de uma gama de factores de invasão esferóide, dado que vários factores podem exercer os seus efeitos máximos em momentos diferentes, ou com diferentes perfis muito mais tempo. Embora este protocolo é passível de alterações (por exemplo, uso de diferentes matriz ECM, linhas celulares de cancro diferentes, ou diferente cel alvosl), se fazer isso, é importante notar que as várias condições experimentais devem primeiro ser optimizado. Por exemplo, antes de se iniciar os estudos de invasão esferóide, o número óptimo de células cancerosas / placa CIM bem, em primeiro lugar deve ser determinado por ensaio de titulação número de células em cultura em monocamada. O número óptimo de esferóides de usar por poço é então com base nessa análise. Por exemplo, no método actual, esferóides compreendem aproximadamente 3.000 células quando cada primeiro gerado. Se titulações número de células iniciais indicam que 30.000 células em monocamada são ideais para a detecção de invasão analisa, em seguida, 10 esferóides são adicionados por placa CIM bem. Além disso, quando a realização de experiências de co-cultura, é importante para estudar o comportamento do &quot;alvo&quot; monocamada de células em separado, a fim de determinar se estas células são inerentemente invasivo, uma vez que pode confundir os resultados. No exemplo demonstrado, esferóides de cancro foram semeadas em cima de uma célula monola LP9yer, com e sem FBS adicionada à parte inferior bem como uma chemoattractant. Em paralelo, as células são cultivadas LP9 sozinho, em cada condição de tratamento. Da mesma forma, quando se estuda a capacidade invasiva de células e esferóides, também é importante examinar as suas capacidades migratórias bem, a fim de distinguir as duas condutas (ou seja, invasão requer a digestão proteolítica de uma barreira de ECM enquanto migração não). Para fazer isso, omitir a barreira ECM (Passos 3.1.1 - 3.1.3) e realizar o ensaio em paralelo com a barreira de ECM no lugar. A última medida &quot;invasão&quot; pode ser corrigido à antiga medida &quot;migração&quot;, se desejar. Finalmente, é importante observar que a informação obtida a partir de medidas de impedância eléctrica está limitado no seu âmbito: uma vez que as células tenham invadido para dentro da câmara inferior, as mudanças na sua fixação, espalhamento, e proliferação sobre o lado inferior da membrana pode contribuir para mudanças nas impedância readings. Assim, este método é mais informativa quando usado em conjunto com outros testes de viabilidade de células esferóide, adesão, migração, e morfologia, a fim de avaliar exaustivamente comportamentos celulares esferóides. Por exemplo, o ideal, a fim de compreender as interações esferóides-mesotélio, co-culturas separadas também deve ser trabalhada periodicamente sob microscopia de fase padrão, de modo que as avaliações qualitativas da morfologia esferóide e saúde podem ser feitas em paralelo com os ensaios RTCA quantitativas de invasão. Se a etapa de rotulagem facultativa é realizada, em seguida, os comportamentos das células cancerosas individuais podem ser determinado por microscopia de fluorescência como desagregar do esferóide e interagir com as células mesoteliais sem rótulos. Um benefício adicional de fluorescência marcação das células cancerosas, quando a co-cultura com um segundo tipo de célula que é, em seguida, é possível constatar que apenas as células cancerosas invadiram através das barreiras celulares e de ECM. <p class="jove_content"&gt; Em resumo, este método representa um débito análise quantitativa alta de invasão esferóide câncer de ovário de barreiras mesoteliais e ECM. Através da adição de citocinas exógenas, fatores de crescimento, ou inibidores específicos para as câmaras superiores ou inferiores da placa CIM bem, este método permite uma rápida, a determinação de fatores que regulam as interações entre células de câncer de ovário esferóides invasores através de mesotélio e barreiras ao longo da matriz tempo.

O câncer de ovário tem a maior taxa de mortalidade de todos os cânceres ginecológicos 1. No mundo, há ~ 230.000 casos e mais de 100.000 mortes em decorrência da doença a cada ano 1. (&gt; 75%) A maioria dos pacientes são diagnosticados depois que o câncer já tem metástase, quando o tratamento é ainda mais complicada pelo aumento da resistência à quimioterapia eo prognóstico é pobre 2. Pacientes com estadio III-IV doença metastática têm taxas de sobrevida em 5 anos de apenas 30-40% 3. Assim, existe uma necessidade urgente para uma melhor compreensão dos comportamentos celulares subjacentes a metástase do cancro de ovário, a fim de tratar eficazmente a doença avançada. O atual modelo de metástase do câncer de ovário propõe várias etapas no processo metastático, cada uma das quais ocorre em um microambiente distinta que impactos no comportamento do tumor. Metástase de células de câncer de ovário, inicialmente, são derramadas a partir do local do tumor primário e sobreviver em um nonadherestado ent dentro do fluido peritoneal como células individuais ou estruturas multicelulares tridimensionais, denominado agregados multicelulares ou esferóides 2,4,5. As células que não fazem esferóides em suspensão são mais suscetíveis a anoikis 2,4,5. Spheroids também apresentam maior resistência a quimioterápicos, contribuindo para a doença residual e recorrência posterior da 2,4,5 câncer. Um segundo passo crítico na metástase do câncer de ovário é a transição de agregados a partir de aglomerados de livre flutuação de tumores secundários estabelecidos dentro da parede peritoneal e omento 5,6. Interacções célula-célula e célula-substrato foram implicados na formação de agregados, a sobrevivência e a adesão à matriz extracelular (ECM) produzida pelo revestimento mesotelial do peritoneu 4-11. Até ao momento, estes processos não são bem entendidos. Para definir os mecanismos envolvidos na disseminação dos cânceres de ovário, esferóides podem ser generated a partir de linhas celulares de cancro estabelecidas utilizando métodos de cultura de não-aderentes, a manutenção de células em suspensão, quer por adição de metilcelulose a meio de cultura 12,13 ou por cultura de células em placas de menor fixação 2,14. Quando cultivadas desta maneira, as células de cancro do ovário montar em agregados multicelulares ou esferóides, que exibem propriedades celulares, moleculares e bioquímicas semelhantes às de agregados tumorais encontradas in vivo 2,14. Após a formação, esferóides pode ser subsequentemente recolhido do meio não-aderentes e replaqueadas para uma variedade de superfícies sólidas para estudos funcionais. Isto representa um avanço sobre os ensaios em cultura em monocamada, que não modelar de forma precisa o comportamento de células de cancro do ovário metastizados dentro de um ambiente não-aderentes, tais como o fluido intraperitoneal. A capacidade invasiva de esferóides de câncer pode ser avaliado em ensaios de terminais tradicionais em câmaras de Boyden 2 </sup&gt;, mas esta abordagem pode ser enganadora, como a invasão de células do cancro do ovário é um processo dinâmico ao longo do tempo. Um método em tempo real recente foi concebido através de microscopia de vídeo time-lapse de folga células mesoteliais invadindo esferóides de câncer de ovário 15,16; No entanto, a análise de dados de intervalo de tempo é demorada e pode ser subjectiva. Aqui, um método rápido, quantitativo para avaliar os comportamentos invasivos de esferóides de câncer de ovário em tempo real é descrito. Em primeiro lugar, um modelo de célula esferóide-mesoteliais foi estabelecido que representa o estágio da metástase do câncer de ovário quando esferóides multicelulares juntar-se e invadir o revestimento peritoneal para formar tumores secundários. Em seguida, a metodologia para um analisador de tempo real celular (RTCA, ver a tabela de Materiais para detalhes da empresa) foi adaptado para realizar medições em tempo real quantitativos da capacidade invasiva de diferentes linhas de células de cancro do ovário, desenvolvidos como esferóides e testados neste modelo. No RTCA emtrumento, as respostas celulares são monitorados continuamente ao longo do curso de um ensaio, sem a necessidade de etiquetas exógenos, medindo as alterações na impedância eléctrica. As placas de cultura especialmente concebidos para ter microeléctrodos revestido de ouro localizado debaixo de uma membrana microporosa na interface entre as câmaras superior e inferior de um 2 câmaras poço (placas &quot;CIM&quot;). A localização dos eletrodos na Câmara permite a medição das mudanças na impedância elétrica como células invadir através de um ECM ou ECM / barreira celular. A interface da membrana entre as duas câmaras de cada poço de placa CIM é primeiramente revestida com o componente de interesse de ECM. No sistema modelo de célula-esferóide mesotelial, a interface é revestido com uma camada de Matrigel (veja a tabela de Materiais para detalhes da empresa), para imitar o ECM complexo subjacente ao revestimento mesotelial do peritoneu, seguido de uma monocamada confluente de mesotélio humano &#39; das células-alvo. Finalmente, pré-formados esferóides de câncer de ovário são added. Células esferóides câncer de ovário devem invadir ativamente através da camada de células-alvo e matriz para alcançar a câmara inferior e alterar as leituras de impedância elétrica. As células alvo na sua própria também são avaliados para garantir que eles não invadem através da camada de matriz e são adequados para utilização neste ensaio.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analyser</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM placas&nbsp;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&nbsp;</td><td>Sondas Moleculares</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose (4.000 centipose)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Médio 199&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td></td><td></td>11150067</tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11765062</tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona&nbsp;</td><td>Placa</td> de cultura côncava de 96 poços Gibco-Invitrogen Gibco-Invitrogen 15400-054 <td></td> Sigma H4001<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 Linha celular mesotelial humana</td><td>Coriell Institute for Medical Research&nbsp;</td><td></td><td></td>AG07086</tr><tr><td>Matriz de Matrigel Reduzida por Fator de Crescimento</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Rolamento 354230</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação do cancro do ovário esferóide apego e invasão de células mesoteliais em tempo real

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Cancros do ovário metástase derramando no líquido peritoneal e dispersando aos locais distais dentro do peritônio. Culturas em monocamada não modelar de forma precisa o comportamento de células cancerosas no interior de um ambiente não-aderente, tal como as células cancerosas agregar inerentemente em estruturas multicelulares que contribuem para o processo metastático por anexação e invadir o revestimento peritoneal para formar tumores secundários. Para modelar esta importante etapa da metástase do cancro do ovário, os agregados multicelulares, ou esferóides, podem ser gerados a partir de linhagens de células de câncer de ovário estabelecidos mantidos em condições não-aderentes. Para simular o microambiente peritoneal encontrado por células de tumor in vivo, num modelo de co-cultura esferóide-mesotelial foi estabelecido em que pré-formado esferóides são colocadas no topo de uma monocamada de células de mesotélio humano, formado ao longo de uma barreira de matriz extracelular. Métodos foram então desenvolvidos utilizando um analisador de células em tempo real para conduzir verdadeiro quantitativaAs medições do tempo da capacidade invasiva de diferentes linhas de células de cancro do ovário, desenvolvidos como esferóides. Esta abordagem permite a medição contínua da invasão por longos períodos de tempo, o que tem várias vantagens sobre os ensaios de ponto final tradicionais e análises em tempo real da imagem de microscopia mais laborioso. Em suma, este método permite uma rápida, a determinação de fatores que regulam as interações entre células de câncer de ovário esferóides invasores através mesoteliais e matriz barreiras ao longo do tempo.

Esferóides de cancro do ovário pode ser gerado a partir de muitos tipos de linhas celulares através da sua cultura em suspensão ou pela colheita de células de tumor primário a partir de ascite maligna 2,14. Aqui, duas linhas celulares de cancro de ovário epitelial, OVCA433 e OVCA429, e uma linha de tumor de células da granulosa do ovário, KGN, têm sido usados ​​para gerar esferóides (Figura 1A). Neste método, as células são cultivadas em poços de fundo U, enquanto suspenso em suportes que tenham sido feitas viscosa pela adição de metilcelulose. Nestas condições, muitas células de cancro do ovário exibem uma capacidade inerente para agregar para formar esferóides 13. Seguindo a cultura durante a noite em suspensão em metilcelulose / meios de comunicação, todas as três linhas de células formadas estruturas esferóides compactos de cerca de 400-500 um de diâmetro (Figura 1A). Enquanto isso, a placa RTCA CIM é preparada, em primeiro lugar, por revestimento do interface de membrana porosa com a matriz e, em seguida, uma monocamada confluente de mes humanosothelial células (Figura 1B). Uma vez formados, os esferóides são, então, transferidos para a placa de CIM preparado. Esferóides de cancro colhidos são semeadas em cima da monocamada de LP9 e avaliadas, como descrito abaixo. Imagens sob microscopia de fase (padrão ou sob microscopia de fluorescência, se a etapa de marcação celular opcional) foi seguido de culturas paralelas são tomados periodicamente para ajudar na interpretação dos dados RTCA (Figura 1C). É informativo para avaliar tanto a nível basal de invasão de uma linha de células de cancro, bem como a invasão induzida por quimioatractor. Tipicamente, a invasividade basal é medida pela adição de SFM para ambas as câmaras superiores e inferiores. Meios completos (10% de FBS), que contém muitas quimioatractores potenciais, é utilizado no exemplo actual a examinar &#39;induzida-quimioatractiva&#39; invasão (Figura 2). Estudos paralelos de LP9 células mesoteliais só confirmou que estas células são minimamente eminvasiva durante 2 dias sob quer basal ou &#39;quimioatractiva&#39; condições induzidas e, portanto, era um tipo de célula boa para usar em ensaios de co-cultura com células de cancro do ovário (Figuras 2A e 2B). Em contraste, os esferóides de cancro do ovário gerados utilizando qualquer uma das três linhas celulares exibiram a capacidade de invasão para um quimioatractor (FBS) (Figuras 2A-2C). A principal vantagem da utilização dos instrumentos em tempo real sobre os ensaios de ponto final RTCA tradicionais é que as alterações no comportamento celular / esferóide pode ser quantificada ao longo do tempo. Durante o ensaio de 2 dias, a KGN, OVCA429, e linhas celulares OVCA433 todos exibiram a capacidade de invasão para um quimioatractor (indicado pelo aumento índices celulares), mas baixos níveis basais de invasão (Figura 2C). As linhas celulares exibiram taxas semelhantes de invasão, como indicado pelas pistas paralelas das curvas (Figura 2C); No entanto, a curva de OVCA429 exibiu uma assíntota superior maior,o que indicava um maior nível máximo de invasão em comparação com as outras linhas celulares. Além disso, as linhas de células apresentaram uma diferença nos seus tempos de início de invasão, com as células KGN invadindo rapidamente as células da matriz e as barreiras e a OVCA433 e OVCA429 células tomam 3-5x mais para invadir, respectivamente (Figura 2D). Mais importante, os seus comportamentos no início da invasão não foram preditivos da sua capacidade geral para a invasão (Figuras 2C e 2D). Isto sugere diferentes capacidades inerentes às linhas de células cancerosas, mas também pode indicar que diferentes fatores podem regular comportamentos invasivos precoces e tardias de esferóides. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 geração esferóide e modelo experimental criado A:.. Eumagos sob microscopia de contraste de fase de esferóides formando em metilcelulose / media (em cima) e da linha celular correspondente crescido como uma monocamada (em baixo) B:. esquemática mostrando o RTCA 2 câmaras placa CIM bem montado, em que pré-formada do câncer de ovário esferóides são colocadas no topo de uma monocamada de uma camada mesotelial / barreira matriz LP9 na câmara superior e média ± FBS como um quimioatractor é adicionada à câmara inferior. Eletrodos debaixo da interface da medida 2 câmaras aumentando impedância elétrica quanto mais células invadem as barreiras para a câmara baixa C:. Imagens de esferóides kgN em cima da monocamada LP9 sob microscopia de contraste de fase (esquerda) ou microscopia de fluorescência (direita). Barras de escala = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> .. Figura 2 os dados de invasão esferóide do cancro do ovário em tempo real A - B: Os resultados representativos de um ensaio de invasão RTCA realizada com e sem FBS na câmara inferior de uma placa de CIM bem. Invasão celular KGN é comparada com células mesoteliais LP9. Os resultados são apresentados como Índice de média ± DP de poços em triplicado celular no ponto de tempo de 24 h (A) e ao longo de todo o período de ensaio de dois dias (B) C - D:. Uma comparação da capacidade invasiva de KGN, OVCA429, e célula OVCA433 as linhas descritas ao longo de um período de 24 horas (C) e de uma forma mais detalhada mais de um período de tempo de 2,5 horas (D).

Invasão de células do cancro do ovário no revestimento mesotelial do peritoneu é um processo dinâmico ao longo do tempo. Utilizando um analisador de tempo real, a capacidade invasiva das células de câncer de ovário em uma célula modelo de co-cultura esferóide-mesoteliais podem ser quantificados durante períodos de tempo prolongados, fornecendo insights sobre os fatores que regulam o processo metastático.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar rapidamente, em tempo real, a invasão de células de câncer de ovário em um modelo de co-cultura com células mesoteliais asteróides para metástase. Isso é realizado primeiramente gerando células de câncer de ovário a partir de linhagens celulares, cultivando-as em condições não aderentes em metilcelulose. O segundo passo consiste em preparar um analisador celular em tempo real, utilizando uma placa CIM, codificando a câmara superior do poço de duas câmaras com matrigel para simular a membrana basal que subjaz ao mesotélio da cavidade peritoneal e ao próprio revestimento mesotelial.Em seguida, os esteroides do câncer de ovário são colhidos e adicionados às câmaras superiores das placas do analisador em tempo real. O passo final é programar e iniciar o analisador celular em tempo real, que fará leituras periódicas em intervalos predeterminados durante um período prolongado de ensaio. Por fim, os resultados obtidos retratam o processo contínuo de invasão, o qual é utilizado para determinar os fatores-chave que regulam as células de câncer de ovário enquanto invadem barreiras celulares e matriciais.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os ensaios padrão de invasão de células cancerígenas, é que esta abordagem permite medições contínuas da invasão de células cancerígenas ao longo de períodos prolongados de tempo. Diferentemente de um ensaio com ponto final único, que não capta plenamente a natureza dinâmica das metástases do câncer de ovário, embora este método seja utilizado para fornecer informações sobre o câncer de ovário, ele também pode ser aplicado para estudar diferentes tipos de processos metastáticos, como o câncer de mama ou a invasão de células cancerígenas através de uma camada endotelial. Da mesma forma, pode ser usado para estudar a invasão celular normal, como a invasão de trofoblastos durante a implantação do embrião. Para preparar células de câncer de ovário para marcação fluorescente de células.Primeiro, colete as células com 75% de confluência e ressuspenda-as em uma concentração final de um milhão de células por mililitro em um mililitro de PBS pré-aquecido contendo 0,1% de BSA por 10⁶ células. Adicionar a quantidade ideal de esteroide por poço e manipular o esteroide com cuidado são etapas críticas para o sucesso deste procedimento. Em seguida, adicione dois microlitros de uma solução estoque de cinco milimolar do corante Cell Trace CSFE às células, obtendo uma concentração final de 10 micromolar, e incube a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Em banho-maria, interrompa a reação com um mililitro de meio gelado contendo 10% de FBS e re-pelote as células por centrifugação. Ressuspenda em 10 mililitros do meio de crescimento pré-aquecido apropriado e semeie as células em um frasco de cultura de 75 centímetros quadrados com tampa filtrante, mantido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, até que o nível de marcação fluorescente seja adequado para detecção.Inicie este procedimento medindo o volume de meio de cultura apropriado para cada linhagem celular, que corresponde a 15 mililitros menos o volume de células necessário para a geração de esferoides. Adicione três mililitros da solução estoque de metilcelulose ao meio de cultura para obter uma concentração final de metilcelulose de 20% e misture bem por inversão suave. Adicione 300.000 células ao meio contendo metilcelulose e misture completamente por inversão suave. Pipete 150 microlitros da mistura de meio com metilcelulose e células em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços com fundo côncavo.Isso resultará em um total de 3000 células por poço em cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por um a quatro dias ou até a formação uniforme de PHE. Normalmente, um esteroide por poço é observado no analisador de células em tempo real ou o ensaio de invasão celular RTCA utiliza uma placa CIM de duas câmaras com 16 poços RTCA. Trabalhando em grupos de quatro poços de cada vez, adicione 50 microlitros de matriz a cada poço da câmara superior da placa para garantir que toda a área superficial seja coberta.Remova 30 microlitros da matriz imediatamente, mas lentamente, para eliminar qualquer fluido em excesso. Incube a placa a 37 graus Celsius por quatro horas antes do uso em uma incubadora de cultura de tecidos. Após quatro horas, adicione 30 microlitros do meio livre de soro, apropriado para cada linhagem celular de câncer, à câmara superior e 160 microlitros de meio com ou sem soro.De acordo com o delineamento experimental para a câmara inferior, monte a placa CIM encaixando a câmara inferior na câmara superior e equilibre em um incubador a 37 graus Celsius. Por uma hora em um incubador de cultura de tecidos, abra o programa RTCA e selecione a guia de layout. Destaque todas as poças experimentais, clique com o botão direito nas poças e selecione ativar poças.Em seguida, preencha as condições experimentais e os nomes dos ciclos conforme desejado. Para adicionar etapas ou subetapas ao programa, selecione a guia de programação e clique com o botão direito para adicionar uma etapa. A primeira etapa é uma varredura de fundo pré-programada, que é automaticamente incorporada ao programa.Uma vez escolhido o acréscimo de um passo, insira os detalhes desejados do programa para o segundo passo do programa RTCA, que registrará leituras durante o estabelecimento da monocamada de nove células mesoteliais humanas LP. Adicione os intervalos de tempo entre as leituras de impedância selecionando a aba de intervalo e inserindo 15 minutos. Adicione a duração do experimento selecionando a aba de duração e inserindo um tempo entre 12 e 24 horas.As etapas subsequentes são adicionadas da mesma maneira. A etapa três do programa RTCA orientará o instrumento a realizar leituras durante a invasão por frid. Insira cinco minutos na guia intervalo e 48 horas na guia duração.Selecione placa na barra de menu e salve. Para iniciar este procedimento, coloque a placa CIM no instrumento RTCA e abra o programa que foi salvo anteriormente. Selecione executar na barra de menu e, em seguida, iniciar; uma varredura de fundo será automaticamente realizada.Após a varredura de fundo, remova a placa CIM do instrumento e coloque-a em uma capela de cultura de tecidos. Adicione 50.000 células LP nine suspensas em 160 microlitros de meio livre de soro na câmara superior de cada placa CIM. Em seguida, coloque a placa no instrumento RTCA e realize leituras a cada 15 minutos enquanto a monocamada de células LP nine se estabelece durante a noite. No dia seguinte, corte assépticamente um milímetro da extremidade de uma ponteira de pipeta de um mililitro e utilize-a para retirar suavemente o conteúdo de cada poço para cada linhagem celular.Reúna 10 esteroides em um tubo estéril e centrifugue a 120 ×g durante oito minutos, e então remova o meio contendo metilcelulose por aspiração suave. Lave o esferoide duas vezes mais com PBS centrifugando a 120 ×g durante oito minutos para sedimentar os esteroides após cada lavagem.Para cada poço experimental, ressuspenda um total de 10 esteroides em 160 microlitros de meio sem PBS. Pausar o experimento RTCA selecionando executar na barra de menu e marcando pausa. Remova a placa CIM do instrumento e coloque-a em uma capela de cultura de tecidos.Aspire o meio de cada poço e substitua por meio contendo esteroides. Retorne a placa ao instrumento RTCA. Selecione executar na barra de menu e marque a etapa de interrupção.O programa avançará automaticamente para a próxima etapa. Para retomar o experimento, selecione executar na barra de menu e marque iniciar continuação. A etapa três do programa RTCA iniciará neste experimento duas linhagens de câncer epitelial de ovário OVCA 4 33 e OVCA 4 29 e uma linhagem de tumor de células granulosas ovarianas.Células KGN foram utilizadas para gerar esteroides após cultura noturna e cultivo em placas com fundo em U, suspensas em meio contendo metilcelulose. As três linhagens celulares formaram estruturas esteroides compactas com diâmetro aproximado de 400 a 500 micrômetros. Os painéis inferiores mostram a linhagem celular correspondente cultivada em monocamada.As barras representam 100 micrômetros após a formação. Os esteroides foram colhidos e semeados sobre uma monocamada de células mesoteliais LP9 em uma placa R-T-C-A-C-I-M. Imagens sob microscopia de contraste de fase ou microscopia fluorescente de culturas paralelas foram obtidas periodicamente para auxiliar na interpretação dos dados de RTCA.É informativo avaliar tanto a camada basal de invasão de uma linhagem celular de câncer quanto a invasão induzida por quimioatraentes. Neste exemplo, a invasividade basal é medida pela adição de meio livre de soro (SFM) às câmaras superior e inferior. Meio completo com 10% de FBS, que contém diversos quimioatraentes potenciais, é utilizado para examinar a invasão induzida por quimioatraentes.Apresentados aqui estão resultados representativos de uma comparação da invasão celular entre as células kgn e as células mesoteliais LP nine. O ensaio de invasão RTCA foi realizado com e sem FBS na câmara inferior de uma placa CIM. Os resultados são mostrados como índice celular médio positivo menos o desvio padrão (SD) a partir de poços triplicados no ponto temporal de 24 horas e ao longo de todo o período de ensaio de dois dias.Esses resultados confirmam que as células LP9 são minimamente invasivas ao longo de dois dias, tanto em condições basais quanto induzidas por quimioatraente, sendo, portanto, um bom tipo celular para uso em ensaios de co-cultura com células de câncer de ovário. Em contraste, KG e os esteroides de câncer de ovário exibiram a capacidade de invadir em direção a um quimioatraente. Este gráfico apresenta os resultados de uma comparação da capacidade invasiva das linhagens celulares K-G-N-O-V-C-A 4 29 e OVCA 4 33 representadas ao longo de um período de 24 horas durante o ensaio de dois dias.As três linhagens celulares exibiram a capacidade de invadir em direção a um quimioatraente, conforme indicado pelo aumento dos índices celulares. As linhagens celulares exibiram taxas semelhantes de invasão, conforme indicado pelas inclinações paralelas das curvas. No entanto, a curva da OVCA 4 29 apresenta uma assíntota superior mais alta, o que indica um nível máximo de invasão maior em comparação com as outras linhagens celulares.Em contraste, os níveis basais de invasão de todas as linhagens celulares foram baixos. Além disso, as linhagens celulares exibiram diferenças em seus tempos de início da invasão, conforme demonstrado por uma análise mais detalhada dos dados de invasão ao longo de um período de 2,5 horas. As células KGN invadem rapidamente as barreiras celulares e matriciais, enquanto as células OVC 4 33 e OVC 4 29 levam, respectivamente, três e cinco vezes mais tempo para invadir.É importante destacar que seus comportamentos no início da invasão não foram preditivos de sua capacidade geral de invasão. Isso sugere diferentes capacidades inerentes das linhagens de células cancerígenas, mas também pode indicar que diferentes fatores regulam os comportamentos invasivos iniciais e tardios dos esteroides. Uma vez dominada, esta técnica é facilmente adaptável para estudar diversas moléculas de sinalização e vias celulares no microambiente peritoneal que afetam o comportamento metastático.Isso pode ser alcançado pela adição de fatores de crescimento exógenos, citocinas ou inibidores à câmara inferior ou superior do poço. Alternativamente, é possível manipular geneticamente as próprias células cancerígenas ou as células-alvo peritoneais.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

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Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

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Modelagem de metástase de câncer de ovário no revestimento da cavidade peritoneal: um método para estabelecer um modelo 3D in vitro do revestimento peritoneal

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Ensaio de depuração mesotelial: uma técnica in vitro para quantificar a capacidade de invasão de esferoides de câncer de ovário em monocamadas de células mesoteliais

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Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

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Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

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Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

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