Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

O objetivo geral deste procedimento é identificar parceiros de interação proteica para uma determinada proteína de interesse. Isso é feito primeiro cultivando as células em meios de cultura de células contendo arginina e lisina marcados com diferentes isótopos estáveis de carbono e nitrogênio. O segundo passo é transfectar plasmídeos e revestir uma proteína de interesse ou um plasmídeo de controle nas células marcadas.

Em seguida, as células são lisadas e as amostras são imunoprecipitadas dos lisados. Em seguida, volumes iguais de imunoprecipitados de controle e amostra são combinados e submetidos à análise de lc MS MS. A etapa final é analisar os dados de espectrometria de massa para identificar proteínas que interagem com a proteína de interesse.

Em última análise, a marcação de isótopos estáveis de aminoácidos em cultura de células ou precipitações de aminoácidos silacos são capazes de identificar um grande número de interações diretas e indiretas com uma proteína de interesse de células de cultura de tecidos. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a marcação por toque, é que ela elimina a necessidade de o investigador enviar bandas individuais da espectrometria de massa. Isso remove uma importante fonte de viés enquanto aumenta a sensibilidade.

Embora esse método possa ser usado para fornecer informações sobre proteínas celulares, as interações proteicas também podem ser aplicadas a outros sistemas, como o estudo de interações patógeno-hospedeiro. Para começar a raspar as células T HEK 2 93 marcadas com SLAC, expressando a proteína de interesse marcada com GFP ou o controle GFP da placa de cultura de células em PBS gelado, em seguida, centrifugue a suspensão celular a 220 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, lave as células três vezes adicionais em 10 mililitros de PBS gelado, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão de lise celular contendo coquetel inibidor de protease recém-adicionado três a uma concentração X e adicione cinco microlitros de coquetel de RNAs por mililitro de tampão de lise, incube no gelo por cinco minutos. Em seguida, centrifugar o lisado celular a 13 000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e reter o sobrenadante como lisado celular solúvel.

Meça a concentração de proteína do lisado celular usando um ensaio de BCA. Em seguida, normalizar a concentração de proteína em cada lisado de amostra em um volume final de 500 microlitros usando o tampão de lise contendo inibidores de protease. Adicione 500 microlitros de tampão de diluição contendo um coquetel de inibidores de protease três a cada um dos lisados de células normalizadas para ajustar o volume total para um mililitro.

Mantenha os lisados no gelo enquanto prepara grânulos anti-GFP e retenha uma alíquota de 50 microlitros de cada amostra a ser usada para entrada de amostra. Vortex a pasta do grânulo para ressuspender os grânulos. Em seguida, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros com o corte final para transferir 25 microlitros de grânulos por amostra para um tubo novo.

Para cada 25 microlitros de pasta de esferas, adicione 20 volumes de tampão de diluição para lavar, centrifugue as esferas a 2.700 vezes G por cinco minutos. Lavar os grânulos mais vezes com 20 volumes de tampão de diluição. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de diluição por 25 microlitros de pasta de esferas.

Em seguida, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros com o corte final para transferir 85 microlitros da pasta de esferas ressuspensa para cada um dos lisados de amostra rotulados com SLAC. Incube as amostras com grânulos em um rotador a quatro graus Celsius por duas horas após as amostras terem sido incubadas com os grânulos, centrifugue as amostras a 2.700 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Conservar 50 microlitros do sobrenadante como amostra não ligada e rejeitar o restante do sobrenadante.

Ressuspenda os grânulos em cada tubo em um mililitro de tampão de diluição e, em seguida, centrifugue a 2.700 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Repita esta etapa de lavagem duas vezes para eluir a proteína das contas. Adicione 50 microlitros de dois tampão de carregamento XSDS a cada amostra e aqueça a 95 graus Celsius por 10 minutos.

Quando o aquecimento terminar, centrifugue cada amostra a 2.700 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para tubos pré-lubrificados e armazene a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para ser submetido à análise de MS. Em seguida, misture volumes iguais de precipitados amino de controle e amostra e submeta a amostra combinada a uma instalação de espectrometria de massa para análise lc ms MS.

Antes de analisar os dados de espectrometria de massa, copie os dados brutos em uma nova planilha. Em seguida, nesta planilha, remova todas as colunas, exceto as colunas que contêm o número de acesso, o número de proporções de peptídeos únicos, comparando amostras, a variabilidade da proporção e a descrição da proteína. Use a função de classificação do Excel para ordenar os dados pelo número de peptídeos e remover as entradas de proteínas que não possuem mais de um peptídeo.

Em seguida, classifique por proporção e remova as proteínas que não possuem proporções SLAC. Em seguida, converta as proporções de slac em log de dois valores. O uso da fórmula é igual a parênteses logarítmicos, razão SLAC dois e parênteses em que a razão SLAC é substituída pelo identificador de célula.

Em seguida, crie uma nova coluna no arquivo do Excel e calcule Registrar duas taxas SLAC para todas as colunas simuladas de amostra para conversão de uma taxa de amostra simulada em uma taxa simulada de amostra. Use a fórmula igual a um dividido pela proporção. Abra o prisma do GraphPad.

Selecione a nova tabela de dados e gráfico Selecione a coluna na lista do lado esquerdo da janela e selecione os dados de importação de entrada. Insira os valores de réplica empilhados nas opções de colunas. Pressione criar.

Em seguida, selecione e copie uma determinada coluna de proporção SLAC simulada de dois exemplos da planilha do Excel para o novo arquivo de prisma. Em seguida, clique no menu suspenso de inserção e selecione nova análise. Em análise de coluna, selecione distribuição de frequência.

Mantenha as opções padrão e clique em OK. Na pasta de resultados, uma nova seção de histograma terá sido gerada. Selecione a seção de distribuição de frequência, clique no menu suspenso de inserção e selecione o novo ajuste da curva de regressão não linear XY da análise.

Clique em Distribuição gaussiana e clique em OK. Na janela de resultados que aparece, a média e o desvio padrão são fornecidos. Gere um limite adicionando 1,96 desvios padrão ao retorno médio do arquivo do Excel.

Crie uma nova guia chamada coluna de rótulo combinado A e copie todos os números de acesso de cada um dos experimentos individuais para esta única coluna. Em seguida, selecione a guia de dados e, em seguida, a opção remover duplicatas. Em seguida, crie colunas para as proporções SLAC e a variabilidade da proporção de cada experimento, bem como para a coluna de descrição do nome da proteína.

Na guia de descrição, use a fórmula PROCV para coletar a descrição de cada número de acesso. Arraste a fórmula para baixo na coluna para preencher a descrição da proteína e, em seguida, use essa fórmula para obter os dados de proporção e variabilidade dos experimentos individuais. Para destacar proteínas que interagem no conjunto de dados combinado, observe o valor limite para um experimento específico.

Selecione a coluna de proporção e clique na guia inicial. Seguido pela formatação condicional, destaque as regras das células mais regras e, em seguida, selecione o formato clássico de estilo que contém apenas vendas que contenham valor de venda maior ou igual a. Na caixa, digite o valor de desvio padrão de 1,96 e clique em OK.

Avalie a variabilidade da razão para cada interação positiva. Se subtrair a variabilidade percentual, uma ocorrência abaixo do valor limite cairia. Isso deve ser tratado com cautela.

Repita isso para cada uma das colunas de resultados e compare entre os experimentos as proteínas destacadas identificadas em dois ou mais experimentos que representam uma interação de alta confiança. A análise de Western blot confirmou a purificação da proteína de interesse marcada com GFP. A falta de uma banda DH de lacuna nas amostras ligadas indica que as proteínas não interagentes foram esgotadas das amostras pela etapa de imunoprecipitação, enquanto a presença de uma banda EIF 4G nessas amostras indica que parceiros de ligação de interação conhecidos foram retidos.

Várias das quatro proteínas de ligação A identificadas foram conservadas entre as duas isoformas. As proteínas que interagem com o EIF quatro A são identificadas pela alta proporção de LAC, enquanto as proteínas não especificamente ligadas neste experimento têm proporções abaixo de 0,96. Neste diagrama do complexo do fator de iniciação, as quatro proteínas de ligação A do EIF que foram identificadas no experimento de precipitação amino SLAC são sombreadas em vermelho a branco.

De acordo com a razão SLAC log dois, a alta cobertura de parceiros de ligação direta e indireta dos complexos EIF quatro A, um e dois ilustra a eficácia dessa abordagem para identificar interações proteicas Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, embora alguma variação nos níveis de proteína possa ser compensada no estágio de análise de dados, É melhor que isso possa ser evitado garantindo a normalização precisa dos níveis de entrada de proteína e evitando a perda de contas de Aros durante as etapas de lavagem.