Glutamina Flux imagem usando sensores codificados geneticamente
31 de julho de 2014
Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente.
O objetivo geral deste procedimento é obter imagens do transporte de glutamina por meio de um transportador expresso heterologamente em células vivas, utilizando sensores de transferência de energia por ressonância de fluorescência ou sensores fret. Isso é realizado primeiramente transfectando células HEK 293 com um sensor de glutamina e um transportador. O sensor é composto por um doador fret inserido em uma proteína bacteriana de ligação à glutamina e por um aceptor fret localizado na extremidade C da proteína de ligação à glutamina.
O segundo passo é montar um sistema de perfusão e imagens das células em tempo real utilizando um microscópio invertido com fluorescência. O passo final é analisar as imagens e visualizar a dinâmica da glutamina. Em última instância, atividades de transportadores em uma única célula podem ser detectadas utilizando esses sensores de fret.
A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como medições baseadas em cromatografia, é que se obtém uma resolução espacial e temporal muito maior. Esta técnica consiste em três partes: transfeção de células com proteínas sensoras, imagem em tempo real e análise pós-experimental. Células HEK293 são utilizadas neste experimento devido à sua baixa atividade endógena de transporte de glutamina.
Plaqueie as células com cerca de 70 a 80% de confluência em DMEM acrescido de 10% de soro de bezerro cósmico ou CCS e 100 unidades por mililitro de penicilina-estreptomicina em uma placa de oito poços com fundo de vidro. Incube a 37 graus Celsius, 5% de CO₂, umidade de 100% por 24 horas.
Após 24 horas, substitua o meio de crescimento por DMEM contendo 10% CCS sem antibióticos e cultive durante a noite a 37 graus Celsius, 5% CO2 e umidade de 100% no dia da transfeção. Adicione 0,4 microgramas de cada um dos plasmídeos de DNA que codificam o sensor de glutamina e o transportador obrigatório de aminoácidos marcado mCherry A SCT2 a 50 microlitros de meio livre de soro.
Adicione um microlitro de reagente de transfeção a 50 microlitros de meio livre de soro, misture suavemente e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, misture a solução contendo o DNA com o reagente de transfeção diluído e incube à temperatura ambiente por 20 minutos. Após 20 minutos, adicione cuidadosamente a mistura do reagente de transfeção sobre as células Cost Seven e misture suavemente balançando a câmara.
Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius, 5%CO2 e 100% de umidade. Após 24 horas, substituir o meio por DMEM acrescido de 10%CCS e 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Retornar as células ao incubador antes de iniciar a perfusão.
Prepare os tampões de perfusão de A a F seguindo as receitas no manuscrito suplementar. Fixe torneiras de fechamento em seringas de 50 mililitros. Feche as torneiras e preencha as seringas com as soluções de perfusão.
Abra a torneira por um breve período para preencher o espaço livre na torneira com o tampão. Em seguida, ligue a gravidade de oito canais. Alimente o sistema de perfusão com um lápis de perfusão e selecione o modo manual.
Na opção de função selecionada. Coloque um recipiente de resíduos sob a caneta de perfusão. Para o sucesso deste experimento, é importante configurar a perfusão de maneira a minimizar a deriva e a contaminação cruzada das soluções.
Ative manualmente as portas pressionando os números correspondentes e preencha os tubos com água. Usando uma seringa de 10 mililitros, feche as portas, posicione as seringas contendo os tampões de A a F nas portas de um a seis do sistema de perfusão e abra as torneiras de fechamento. Depois disso.
Abra as portas novamente para substituir a água nos tubos pelos tampões. A taxa de fluxo deve ser de aproximadamente 0,8 mililitros por minuto. Pressione cancelar uma vez no controlador de perfusão para retornar ao menu de seleção de função.
Ative a opção do programa de edição e digite o protocolo de perfusão indicado nesta tabela. Salve o programa de perfusão. As células são imagiadas de 48 a 72 horas pós-transfecção.
Lave as cavidades do recipiente com fundo de vidro duas vezes com o tampão de perfusão A, tomando cuidado para não remover as células. Coloque o recipiente com fundo de vidro sobre a platina do microscópio de fluorescência. Conecte o sistema de perfusão à câmara.
Se uma câmara aberta for usada, monte outra bomba que remova a solução de perfusão da câmara. Abra o software de imageamento de lâmina. Inicie uma nova lâmina usando a função de foco, encontre células coexpressando o sensor e A SCT two M cherry utilizando conjuntos apropriados de filtros.
Ajuste o ganho clicando na aba da câmera e movendo a barra deslizante abaixo de ganho. Além disso, ajuste a configuração do filtro de densidade neutra no menu suspenso do filtro de densidade neutra. Clique em captura de imagem e, em seguida, na janela de aquisição, especifique os filtros a serem utilizados.
As imagens serão adquiridas em três canais: excitação do doador, emissão do doador, excitação do doador, emissão do aceptor e excitação do aceptor, emissão do aceptor. Clique no botão de teste para ajustar o tempo de exposição digitando o tempo desejado na caixa. Próximo às configurações de filtro, os três canais precisam ser expostos pelo mesmo período de tempo.
Desenhe uma região de interesse utilizando a ferramenta de regiões. Selecione o modo de captura com intervalo de tempo na caixa do tipo de captura. Em seguida, especifique o intervalo e os pontos de tempo para o experimento.
Em seguida, desenhe uma região em uma área sem células fluorescentes para ser usada na subtração do fundo. Clique com o botão direito na região desenhada e defina-a como fundo. Idealmente, devem-se usar células que não estejam expressando os sensores como região de fundo, a fim de considerar tanto a autofluorescência quanto a fluorescência de fundo detectada pela câmera.
Selecione o programa desejado na opção selecionar função executar programas, alterne para o programa salvo e pressione enter no controlador de perfusão. O programa agora está carregado e pressionar qualquer tecla iniciará a perfusão, garantindo que tanto a perfusão quanto o experimento de imagem comecem ao mesmo tempo. Clique no botão iniciar na janela de captura no mesmo momento em que pressiona uma tecla no controlador de perfusão.
Mostrados aqui estão experimentos típicos de curso temporal utilizando células coexpressando o transportador a s CT dois e sensores de fret para glutamina com afinidades de oito milimolares e 100 micromolares. A entrada de glutamina é detectada como a mudança nas razões de intensidade de fluorescência entre o doador mtfp um e o aceptor Venus. Também é demonstrada a entrada de glutamina na presença de alanina como substrato.
As especificidades dos transportadores também podem ser examinadas utilizando os sensores. Aqui, as células foram previamente carregadas com glutamina e, em seguida, diversos aminoácidos foram adicionados ao perfusato extracelular. Oito, como esperado, A ct dois substratos induziram o fluxo de glutamina, enquanto aminoácidos não substrato não o fizeram.
A ausência de alterações na eficiência de fret após a adição de um substrato pode ser atribuída a várias razões, como a baixa capacidade de captação do substrato em teste, conforme demonstrado em células que expressam o sensor de oito milimolares ou o sensor de 100 micromolares. Porém, que não expressam o transportador a s CT dois, para confirmar que a alteração na eficiência de fret é devida à mudança real no substrato e não à alteração em outros parâmetros. O mesmo protocolo de perfusão é realizado utilizando células que expressam um sensor que se espera estar saturado nas condições experimentais.
E neste exemplo, a afinidade do sensor é de 1,5 micromolar. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imaginar a dinâmica de metabólitos utilizando sensores FRET. Não se esqueça de que o cultivo celular deve ser tratado adequadamente seguindo os procedimentos operacionais padrão, de modo que o risco de exposição seja minimizado.
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Visão Geral
Este artigo demonstra o uso de FRET para monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas. Ele discute o planejamento experimental, detalhes técnicos e considerações para análises pós-experimentais utilizando sensores genéticos codificados para glutamina.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biofísica
Contexto
- A glutamina é um aminoácido essencial envolvido em diversos processos metabólicos.
- O monitoramento da dinâmica da glutamina pode fornecer informações sobre o metabolismo celular.
- Sensores FRET permitem a imagem em tempo real de moléculas biológicas.
- Sensores geneticamente codificados permitem resolução em nível subcelular em células vivas.
Objetivo do Estudo
- Para imaginar o transporte de glutamina em células vivas.
- Para utilizar sensores de FRET para monitorar atividades de transportadores.
- Para analisar a dinâmica da glutamina no nível de célula única.
Métodos Utilizados
- Transfectar células com um sensor de glutamina e um transportador.
- Configurar um sistema de perfusão para imagem em tempo real.
- Utilizar um microscópio fluorescente invertido para obtenção de imagens.
- Analisar imagens para visualizar a dinâmica da glutamina.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida do transporte de glutamina em células vivas.
- Detecção de atividades de transportadores utilizando sensores FRET.
- Monitoramento em tempo real da dinâmica da glutamina realizado.
- Informações sobre o metabolismo celular fornecidas pelo estudo.
Conclusões
- Os sensores FRET são eficazes para monitorar a dinâmica da glutamina.
- A metodologia permite uma análise detalhada das atividades dos transportadores.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão dos processos metabólicos em células vivas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem em tempo real do transporte de metabólitos utilizando sensores FRET codificados geneticamente permite a investigação precisa da cinética de transportadores e especificidade de substrato em resolução de única célula. Esta abordagem auxilia na validação de alvos ao fornecer leituras dinâmicas e quantitativas da atividade do transportador em células vivas, reduzindo a ambiguidade mecanicista na fase inicial de descoberta. O método aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao associar a função do transportador aos estados metabólicos celulares relevantes para modelos de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação direta da atividade do transportador de glutamina, apoiando a validação funcional de transportadores de solutos como alvos terapêuticos.
- Valor Operacional: Fornece dados em tempo real com resolução subcelular que esclarecem a cinética do transportador e a especificidade do substrato, sem necessidade de lise celular ou ensaios de ponto final.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao confirmar o fluxo mediado pelo transportador sob condições definidas de substrato, aumentando a confiança nas hipóteses de interação com o alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera alterações quantitativas na razão de fluorescência que servem como leituras robustas em tempo real para avaliação da função do transportador em ensaios com células vivas.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento padronizado e reprodutível da atividade do transportador sob diferentes condições de perfusão, apoiando a escalabilidade do ensaio para triagem de compostos.
- Prontidão para Triagem: Permite a detecção de perfis de fluxo e inibição específicos ao substrato, preparando o sistema para avaliação dos efeitos de moduladores sobre a atividade do transportador.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a análise relevante para doenças ao permitir a investigação específica de tipos celulares no transporte de glutamina em modelos que expressam transportadores relevantes.
- Alinhamento Pré-clínico: Fornece leituras dinâmicas do metabolismo que podem se correlacionar com desfechos fenotípicos, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco.
- Conhecimento Mecanístico: Ajuda a distinguir efeitos específicos do transportador de alterações metabólicas fora do alvo, aumentando a confiança no alvo durante a validação pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a avaliação funcional em tempo real de transportadores após a identificação do alvo, orientando a otimização de compostos líderes por meio de perfis dinâmicos de atividade.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função de transportadores mediante a visualização do fluxo de substratos em células vivas, esclarecendo seu papel biológico em vias metabólicas.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas em tempo real adequadas para avaliar os efeitos de compostos sobre a cinética e especificidade de transportadores em formato baseado em perfusão.
- Análises: Gera medições de fluorescência ratiométricas que permitem comparar a atividade de transportadores entre diferentes condições, possibilitando triagem orientada por dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer dados de fluxo de metabólitos em contextos celulares relevantes para doenças, apoiando estudos mecanicistas alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para monitorar a dinâmica de transportadores de aminoácidos em múltiplos alvos e linhagens celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a incerteza sobre o mecanismo do transportador e a especificidade do substrato.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização de ensaios de transportadores por meio de perfusão controlada e imagem em tempo real.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não avançar ao fornecer dados funcionais e dinâmicos que reduzem os riscos na seleção de alvos no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de transportadores com base em perfis de atividade quantitativos e validados em células vivas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, microscopia de células vivas e detecção de sinal baseada em FRET.
- Depende do acesso a microscopia de fluorescência invertida com conjuntos de filtros para excitação e emissão do doador e do aceptor, e um sistema de perfusão para troca de solução.
- Necessita padronização da eficiência de transfeção, dos níveis de expressão do sensor e da subtração de fundo entre experimentos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes pares transportador-sensor, incluindo ajuste de afinidade e validação de expressão.
- É limitado pela faixa dinâmica do sensor e pelos potenciais efeitos de saturação, os quais devem ser caracterizados para quantificação precisa do fluxo.
