Análise do dano epitelial Produzido pela Entamoeba histolytica Infecção

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as interações iniciais do patógeno hospedeiro e o potencial de invasão da TBA. Histolytica. Primeiro faça preparações dos trofozoítos intactos, dos trofozoítos, dos lisados totais ou dos trofozoítos secretados. Em seguida, incube as células epiteliais do hospedeiro com concentrações apropriadas dos diferentes trofozoítos.

Agora usando imunofluorescência AM, analise as culturas epiteliais tratadas para proteínas ABA histolytica selecionadas que interagem com junções apertadas das células epiteliais e também medem alterações da barreira paracelular por resistência elétrica transepitelial. Em conjunto, os resultados podem demonstrar a desmontagem da junção apertada pela TBA Histolytica e também identificar a participação dos complexos selecionados neste processo. As principais vantagens desta técnica são o uso de diferentes produtos do parasita para avaliar a translocação de fatores Eva histo para o epitélio do hospedeiro, bem como para demonstrar a participação desses eva.

Seus fatores na abertura da junção de células inteiras em tempos muito precoces de infecção. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ameba, como a compreensão das interações moleculares entre o parasita epitelial e o parasita da divaístia. De um modo geral, as pessoas novas neste método terão dificuldades porque não conhecem a proporção adequada dos tempos de incubação das duas células para a co-incubação, bem como a forma de obter os diferentes produtos ELI e a medição da TER.

As implicações dessa técnica se estendem à nossa terapia de amis, porque esses fatores vir, como o complexo E-H-C-P-A-D-H 112, podem ser explorados como alvos em novas estratégias de tratamento. Quatro. Este método in vitro pode fornecer informações sobre a participação do fator viral Anica na interação inicial do local do hospital. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como inbivo, modelos de infecção em camundongos hamster, porquinhos-da-índia e também em biópsias intestinais humanas. Cultura.

As células MDCK em 10 mililitros de meio DMEM complementado a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Cresça autenticamente uma vez 10 elevado ao quinto trofozoítos da ameba histolytica em 15 mililitros de TYIS 33, médio a 37 graus Celsius. Para separar os trofozoítos, resfrie o tubo por cinco a 10 minutos em banho de água gelada.

Em seguida, transferir a cultura assepticamente para um tubo cónico e centrifugar a 360 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Agora, decantar cuidadosamente o sobrenadante. Adicione PBS gelado ao pellet e inverta o tubo várias vezes para dispersar as células após a centrifugação.

Determine o número de trofozoítos usando um hemocitômetro para lixítar, os trofozoítos, congelam em nitrogênio líquido por um minuto, descongelam a quatro graus Celsius e voram vigorosamente. Agora ative as proteases presentes nos lisados com 0,02% de beta mercaptoetanol. Dilua nove vezes 10 para os seis trofozoítos em três mililitros de PBS gelado e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros.

Agora coloque a suspensão trofo em um ângulo horizontal inclinado de cinco graus em uma incubadora de 37 graus Celsius por duas horas para coletar os produtos secretados, centrifugue o tubo a 360 vezes G por 10 minutos. Use uma seringa descartável e estéril para coletar cuidadosamente o sobrenadante, evitando a contaminação das amostras com trofozoítos do pellet. Em seguida, para eliminar quaisquer células transferidas, passe o sobrenadante por uma membrana de acetato de celulose de 0,22 mícron.

Agora ative as proteases com 0,02% de beta mercaptoetanol para cultura de imunofluorescência. As células MDCK na tampa de vidro estéril deslizam dentro de uma placa de cultura de células de 24 poços múltiplos. Inspecione as células no microscópio invertido até que atinjam 100% de confluência.

Adicione as diferentes condições de trofozoítos diluídos em um mililitro de PBS quente. Inclua as condições de controle de células MDCK com PBS e não e histolytica, bem como células MDCK com as diferentes condições de trofozoítos, mas emitindo incubação com anticorpos primários. Coloque a placa de cultura na incubadora por dois ou 30 minutos.

Em seguida, lave as células epiteliais cinco vezes com PBS frio para eliminar moléculas não ligadas ou trofozoítos. Fixe e faça permanente nas células com um mililitro de etanol a 96% por minutos a 20 graus Celsius negativos em uma câmara úmida. Retire as lamelas dos poços com cuidado.

Remova o excesso de líquido da borda usando papel de filtro e mergulhe a lamínula com as células voltadas para baixo em uma solução de bloqueio de 0,5% BSA. Incubar as amostras durante uma hora à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare uma mistura de anticorpos primários em PBS.

Levante as lamínulas da solução de bloqueio. Seque o excesso de líquido em papel de filtro. Transfira as células para a solução de anticorpos e incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius.

Lave as células cinco vezes com um mililitro de PBS para remover as moléculas não ligadas. Agora prepare uma mistura dos dois anticorpos secundários fluorescentes em PBS. Incubar as amostras em anticorpos secundários durante uma hora à temperatura ambiente no escuro para coloração nuclear.

Incube as células por três minutos com 200 microlitros de solução dappy 0,05 milimolar em temperatura ambiente no escuro. Agora, analise as preparações por microscopia confocal através de cortes de Zack e planos XZ em experimentos de coincubação. Usando inibidores de protease ou um anticorpo específico, incube cada condição experimental por 20 minutos a quatro graus Celsius com inibidores de protease ou uma cultura de anticorpos monoclonais.

As células MDCK em suportes transbem permeáveis estéreis no compartimento superior, colocam 100 microlitros da suspensão celular e no compartimento inferior colocam 600 microlitros de meio DMEM suplementado. Coloque os filtros de transwell preparados na incubadora em um microscópio invertido. Verifique se as células são 100% confluentes.

Colete e acumule o meio do compartimento superior de cada transwell para 50 microlitros desta mistura de meios. Adicione 50 microlitros de suspensão de trofozoítos ou controle PBS. Agora transfira as misturas para a câmara superior de cada transwell contendo as células MDCK.

Mergulhe imediatamente os dois eletrodos STX em cada transwell para medir a resistência elétrica transepitelial. Certifique-se de que o eletrodo mais longo toque a parte inferior da câmara inferior e que o eletrodo mais curto seja coberto por meio no compartimento superior. Os E histolytica foram cultivados em condições de acento e colhidos no final da fase logarítmica ao início da fase estacionária de crescimento.

Aqui, o marcador de junção apertada zero um foi usado para visualizar contatos celulares de células epiteliais que são estabilizadas por junções apertadas e de aderência. A imunofluorescência com o anticorpo monoclonal foi utilizada para estudar a interação do complexo derivado da ameba com a superfície epitelial da aplicação de trofozoítos, trofozoítos, lisados totais ou produtos secretados à monocamada epitelial resultou na colocalização do complexo com junção apertada. Após 30 minutos, desenvolveu-se uma coloração descontínua de ZO one nas bordas celulares e internalização em vesículas.

Essa interrupção foi mais proeminente nos contatos das células MDCK com trofozoítos e trofozoítos. A microscopia confocal a laser de lisados totais indicou que o complexo de virulência penetrou em direção ao espaço intercelular. Co-localizando com o contato interrompido do parasita de coloração ze Oone, interrompeu a função da barreira epitelial e resultou em uma queda de 90% da resistência elétrica transepitelial.

A pré-incubação dos trofozoítos com um anticorpo para o complexo ou com inibidores de protease resultou em proteção contra a queda de TER. Junto. Esses dados sugerem que tanto a atividade proteolítica quanto as propriedades adesivas são importantes fatores de virulência desse complexo durante a invasão histolítica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar os mecanismos pelos quais o EMBA histolytica viral em fatores abrem junções apertadas nos primeiros momentos de infecção Quando dominar esta análise de dano epitelial pode ser feita em três horas, uma vez que os produtos de lya e as culturas de células estejam prontos.

Ao obter este procedimento, é importante lembrar de manter os tempos exatos de interação para íons após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de imunoprecipitação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como possíveis associações entre enba, fatores de violência histolytica e proteínas epiteliais após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de interações laterais explorarem a patogênese da AMS em camundongos hamster, porquinhos-da-índia e em tecidos humanos.