Análise do dano epitelial Produzido pela

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as interações precoces entre o hospedeiro e o patógeno e o potencial de invasão da TBA.Histolytica. Primeiro, prepare os trofozoítos intactos, os lisados totais de trofozoítos ou os trofozoítos secretados. Em seguida, incube as células epiteliais do hospedeiro com concentrações apropriadas dos diferentes trofozoítos.

Agora, utilizando imunofluorescência com AM, analise as culturas epiteliais tratadas quanto a proteínas selecionadas de ABA histolytica que interagem com junções apertadas das células epiteliais, além de medir alterações na barreira paracelular por meio da resistência elétrica transepitelial. Em conjunto, os resultados podem demonstrar a desmontagem das junções apertadas por TBA Histolytica e também identificar a participação dos complexos selecionados nesse processo. As principais vantagens dessa técnica são o uso de diferentes produtos do parasita para avaliar a translocação dos fatores Eva histo para o epitélio do hospedeiro, bem como demonstrar a participação dessas Eva.

Esses fatores sobre a abertura de junções em células inteiras nos primeiros momentos da infecção. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de invasividade de amebas, como compreender as interações moleculares entre células epiteliais e o parasita *diva isli*. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque desconhecem os tempos de incubação adequados, a proporção correta entre os dois tipos celulares para co-incubação, bem como a forma de obter os diferentes produtos ELI e como medir a TER.

As implicações desta técnica estendem-se ao nosso tratamento de infecções, pois fatores virais como o complexo E-H-C-P-A-D-H 112 poderiam ser explorados como alvos em novas estratégias terapêuticas. Este método in vitro pode fornecer informações sobre a participação do fator viral Anica na interação inicial com o sítio de hospedagem. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como modelos de infecção in vivo em hamsters, camundongos, porquinhos-da-índia e em biópsias intestinais humanas.

As células MDCK em 10 mililitros de meio DMEM complementado a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Cresça autenticamente uma vez 10 à quinta trofozoítos de *Entamoeba histolytica* em 15 mililitros de meio TYIS 33, a 37 graus Celsius. Para destacar os trofozoítos, resfrie o tubo por cinco a 10 minutos em banho de gelo e água.

Em seguida, transfira a cultura assépticamente para um tubo cônico e centrifugue a 360 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Agora, despreze cuidadosamente o sobrenadante. Adicione PBS gelado ao pellet e inverta o tubo várias vezes para dispersar as células após a centrifugação.

Determine o número de trofozoítas utilizando um hemocitômetro para lisar as trofozoítas, congele rapidamente em nitrogênio líquido por um minuto, descongele a quatro graus Celsius e vortex vigorosamente. Agora, ative as proteases presentes nos lisados com beta-mercaptoetanol 0,02%. Dilua nove vezes 10 à sexta potência de trofozoítas em três mililitros de PBS gelado, e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros.

Agora, coloque a suspensão de trofo em um ângulo horizontal inclinado de cinco graus em uma incubadora a 37 graus Celsius por duas horas para coletar os produtos secretados, centrifugue o tubo a 360 ×g por 10 minutos. Use uma seringa descartável e estéril para coletar cuidadosamente o sobrenadante, evitando a contaminação das amostras com trofozoítos do pellet. Em seguida, para eliminar quaisquer células transferidas, passe o sobrenadante através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 mícron.

Agora, ative as proteases com beta-mercaptoetanol 0,02% para cultura de imunofluorescência. As células MDCK sobre lamínulas de vidro estéreis dentro de uma placa de cultura celular de 24 poços. Inspecione as células no microscópio invertido até que atinjam confluência de 100%.

Adicione as diferentes condições de trofozoítas diluídas em um mililitro de PBS quente. Inclua as condições de controle de células MDCK com PBS e sem E. histolytica, bem como células MDCK com as diferentes condições de trofozoítas, mas omitindo a incubação com os anticorpos primários. Coloque a placa de cultura no incubador por dois ou 30 minutos.

Em seguida, lave as células epiteliais cinco vezes com PBS frio para eliminar moléculas não ligadas ou trofozoítas. Fixe e permeabilize as células com um mililitro de etanol 96% durante minutos a menos 20 graus Celsius em câmara úmida. Retire cuidadosamente as lamínulas dos poços.

Remova o excesso de líquido da borda usando papel filtro e imerja a lamínula com as células voltadas para baixo na solução bloqueadora de BSA 0,5%. Incube as amostras por uma hora à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare uma mistura de anticorpos primários em PBS.

Retire as lamínulas da solução bloqueadora. Seque o excesso de líquido em papel filtro. Transfira as células para a solução de anticorpo e incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius.

Lave as células cinco vezes com um mililitro de PBS para remover moléculas não ligadas. Prepare agora uma mistura dos dois anticorpos secundários fluorescentes em PBS. Incube as amostras com os anticorpos secundários por uma hora à temperatura ambiente, no escuro, para coloração nuclear.

Incube as células por três minutos com 200 microlitros de solução de dappy 0,05 milimolar, em temperatura ambiente e no escuro. Em seguida, analise os preparos por microscopia confocal através de cortes de Zack e planos XZ em experimentos de co-incubação. Usando inibidores de protease ou um anticorpo específico, incube cada condição experimental por 20 minutos a quatro graus Celsius com inibidores de protease ou um cultivo de anticorpo monoclonal.

Células MDCK sobre suportes permeáveis estéreis em compartimento superior, adicione 100 microlitros da suspensão celular e no compartimento inferior adicione 600 microlitros de meio DMEM suplementado. Coloque os filtros transwell preparados no incubador sobre um microscópio invertido. Verifique se as células estão 100% confluentes.

Colete e reúna o meio do compartimento superior de cada transwell em 50 microlitros dessa mistura de meio. Adicione 50 microlitros de suspensão de trofozoítas ou controle com PBS. Em seguida, transfira as misturas para a câmara superior de cada transwell contendo as células MDCK.

Mergulhe imediatamente os dois eletrodos do STX em cada transwell para medir a resistência elétrica transepitelial. Certifique-se de que o eletrodo mais longo toque o fundo da câmara inferior e de que o eletrodo mais curto esteja coberto pelo meio no compartimento superior. Os E. histolytica foram cultivados em condições específicas e colhidos na fase final do crescimento logarítmico até a fase inicial estacionária.

Aqui, o marcador de junção apertada ZO-1 foi utilizado para visualizar os contatos celulares de células epiteliais que são estabilizados por junções apertadas e de aderência. A imunofluorescência com o anticorpo monoclonal foi usada para estudar a interação do complexo derivado do ameba com a superfície epitelial mediante aplicação de trofozoítos, lisados totais ou produtos secretados sobre a monocamada epitelial, o que resultou na colocalização do complexo com a junção apertada. Após 30 minutos, um padrão de marcação descontínuo de ZO-1 se desenvolveu nas bordas celulares e ocorreu internalização em vesículas.

Essa interrupção foi mais acentuada nos contatos entre células MDCK e trofozoítas e trofozoítas. A microscopia confocal a laser de lisados totais indicou que o complexo de virulência penetrou em direção ao espaço intercelular. A colocalização com o parasita em contato com a marcação interrompida da ZO-1, função de barreira epitelial interrompida e resultou em uma queda de 90% na resistência elétrica transepitelial.

A pré-incubação dos trofozoítas com um anticorpo contra o complexo ou com inibidores de protease resultou em proteção contra a queda da resistência elétrica transepitelial (TER). Em conjunto, esses dados sugerem que tanto a atividade proteolítica quanto as propriedades adesivas são fatores de virulência importantes desse complexo durante a invasão por E. histolytica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar os mecanismos pelos quais os fatores de virulência de E. histolytica abrem junções apertadas nos estágios iniciais da infecção. Quando dominada, essa análise de dano epitelial pode ser realizada em três horas, uma vez que os produtos líticos e as culturas celulares estejam prontos.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de respeitar rigorosamente os tempos exatos de interação para os íons. Outros métodos, como ensaios de imunoprecipitação, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como possíveis associações entre fatores de virulência de *E. histolytica* e proteínas epiteliais após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de interações intestinais explorarem a patogênese da AMS em camundongos, cobaias e tecidos humanos.