Preparação Técnica Multi-passo para recuperar várias classes compostas metabólito para em profundidade e análise metabolômica Informativo

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um meio eficaz de fracionamento de metabólitos em fluidos biológicos complexos, a fim de obter amostras simplificadas para melhor cobertura do metaboloma. Isso é feito primeiro enriquecendo cada amostra com padrões internos para monitorar a reprodutibilidade da preparação da amostra e as condições do instrumento. O segundo passo é adicionar metanol gelado a cada amostra para precipitar as proteínas que podem interferir na cromatografia e análise subsequentes por espectrometria de massa.

Em seguida, a etapa de extração líquida líquida separa os metabólitos hidrofílicos dos hidrofóbicos. A etapa final é a extração em fase sólida para fracionar ainda mais os metabólitos lipídicos em fosfolipídios, ácidos graxos e lipídios neutros. Em última análise, esse método combinado de várias etapas é usado para mostrar separação eficaz, excelente reprodutibilidade e melhor cobertura do metaboloma plasmático.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como uma simples extração de metanol, é que obtemos uma melhor cobertura de metabólitos, especialmente de lipídios, o que é importante ao realizar estudos de perfil metabolômico ou quando os lipídios são de particular interesse. Antes da precipitação da proteína, prepare as amostras primeiro para descongelar as amostras à temperatura ambiente. Em seguida, coloque as amostras com padrões internos ISTD que foram preparados de antemão.

Todas as concentrações-padrão foram ajustadas conforme necessário com base na sensibilidade da instrumentação MS e HPLC utilizada. Para análise, crave cada amostra com 10 microlitros. Cada uma das soluções padrão hidrofílicas e hidrofóbicas enriquece cada amostra com 10 microlitros de uma solução de controle positivo de um x dois x ou quatro x.

Depois que todas as amostras tiverem sido enriquecidas com padrões internos e soluções de controle positivo, vórtice cada amostra por 10 segundos. Para iniciar a precipitação de proteínas, adicione 400 microlitros de metanol gelado a cada amostra. Vórtice por 10 segundos por centrífuga de tubo a zero graus Celsius por 15 minutos a 18.000 vezes.

G, Um pellet de proteína deve se formar no fundo do tubo. Após centrifugação, transferir todo o sobrenadante para um novo tubo de cultura de vidro e secar em seguida sob azoto. Este resíduo seco será submetido à extração líquida líquida posteriormente.

Para análise da fracção de proteica, adicionar um mililitro de éter de metila ou MTBE ao vórtice de proteicos brancos ou esbranquiçados durante 30 segundos por tubo e centrifugar a zero graus Celsius durante 15 minutos a 18 000 vezes. G decanta a camada de MTBE para um novo tubo de cultura de vidro. Como o tamanho do pellet varia entre as amostras, é importante aspirar consistentemente a mesma quantidade de MTBE para todas as amostras.

Por exemplo, se apenas 900 microlitros puderem ser decantados para a amostra com a menor quantidade de sobrenadante, então decantar 900 microlitros. Para todas as amostras, adicione outro mililitro de MTBE ao vórtice de pellets de proteína por 30 segundos e, em seguida, centrifugue a zero graus Celsius ou 15 minutos. Adicionar 18 000 vezes G como antes, aspirar a camada de MTBE e adicionar aos tubos de cultura de vidro preparados anteriormente.

Seque as amostras por fluxo de nitrogênio e ressuspenda em 200 microlitros de metanol de clorofórmio um-para-um. Transfira cada amostra para um tubo de centrífuga e centrifugue a zero graus Celsius por 15 minutos a 18.000 vezes G. Depois disso, use pipetas de vidro para transferir o sobrenadante para os frascos de tampa de rosca do amostrador automático. Para iniciar este procedimento, use uma pipeta de vidro para adicionar três mililitros de MTBE ao resíduo de metanol seco preparado anteriormente e vórtice por 30 segundos.

Depois disso, adicione 750 microlitros de água a cada tubo e vórtice por 10 segundos. Centrifugue a cerca de 200 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente, duas camadas distintas são visíveis Após a centrifugação, aspire cuidadosamente 2,5 mililitros da camada superior de MTBE sem pipetar a camada aquosa abaixo e transfira para uma cultura de vidro limpa. Dois. Adicione três mililitros de MTBE à parte restante da água de cada amostra.

E vórtice 10 segundos por centrífuga de tubo a cerca de 200 vezes G por 10 minutos. À temperatura ambiente, aspire três mililitros de MTBE sem obter água e combine com o tubo MTBE anterior. Esta fração MTBE será submetida à extração em fase sólida posteriormente.

Concentrar a camada aquosa restante por secagem sob azoto. Ressuspenda o resíduo em 100 microlitros de um e adicione 400 microlitros de metanol gelado a cada vórtice de tubo e, em seguida, transfira para um tubo de microcentrífuga. Deixe a 80 graus Celsius negativos por 20 a 30 minutos para permitir que qualquer proteína restante precipite no metanol.

Em seguida, centrifugue a zero graus Celsius por 15 minutos a 18.000 vezes G, deve haver um precipitado ao longo da lateral do tubo após a centrifugação, aspire 450 microlitros de sobrenadante sem aspirar o precipitado e transfira para um tubo de microcentrífuga limpo. Seque completamente em um concentrador centrífugo a vácuo a não mais de 45 graus Celsius por cerca de uma a duas horas. Ressuspenda o sobrenadante seco em 200 microlitros de água acetilnitrílica a 5% e vórtice.

Transfira brevemente as amostras para automóveis, amostradores, frascos e congele a 80 graus Celsius negativos. Para iniciar o procedimento de extração em fase sólida, secar a fração MTBE obtida anteriormente sob um bom fluxo de nitrogênio de 35 a graus Celsius por 10 a 15 minutos. Quando as frações de MTBE estiverem completamente secas, pare o fluxo de nitrogênio e ressuspenda rapidamente cada amostra em um mililitro de clorofórmio usando um vórtice de pipeta de vidro.

Lave brevemente e condicione a extração em fase sólida ou o cartucho SPE duas vezes com 400 microlitros de hexano. Descarte os resíduos e substitua por um novo tubo de coleta de vidro. Adicione a amostra à coluna SPE, aplique vácuo e colete o fluxo.

Com uma pipeta de vidro, adicione um mililitro de álcool isopropílico clorofórmio dois a um à coluna SPE e recolha o fluxo nos mesmos tubos de vidro. Esta é a fração neutra. Secar a fracção neutra em azoto durante 10 a 15 minutos.

Para minimizar a oxidação com uma pipeta de vidro, adicione um mililitro de ácido acético a 5% em éter etílico à coluna SPE e colete o fluxo. Esta é a fração de ácidos graxos. Seque a fração de ácidos graxos sob nitrogênio por 10 a 15 minutos para minimizar a oxidação usando pontas de plástico.

Adicione 800 microlitros de metanol ao cartucho SPE e colete o fluxo através de tubos cônicos de plástico de 15 mililitros, esta é a fração fosfolipídica. Transfira a fração fosfolipídica para tubos de centrífuga de 1,5 mililitros, seque as amostras com um concentrador centrífugo a vácuo a 45 graus Celsius por cerca de uma a 1,5 horas. Por fim, suspenda cada uma das amostras das três frações em 200 microlitros de transferência de metanol a 100% para automóveis, amostradores, frascos e armazene no freezer negativo de 80 graus Celsius.

A eficácia do método M-T-B-E-S-P-E na extração de padrões lipídicos e metabólitos endógenos é demonstrada em geral, melhor extração e cobertura dos metabólitos foram obtidas em comparação com outros métodos, como extração de metanol ou extração apenas de MTBE, quando o número de características foi comparado usando software qualitativo e quantitativo. Após a análise de lc MS, a comparação das frações M-T-B-E-S-P-E mostrou sobreposição mínima entre as três frações após SPE, o que demonstra a eficiência na separação dos metabólitos hidrofóbicos em suas respectivas classes químicas para uma identificação mais confiável dos metabólitos. Além disso, a recuperação dos padrões internos em frações utilizando o método M-T-B-E-S-P-E, a NR 12 demonstrou que os padrões internos foram aludidos na fração relacionada à sua classe química.

Para avaliar a reprodutibilidade cromatográfica dos dados, a preparação da amostra foi realizada em três amostras separadas de CQ de plasma agrupado, e cada amostra foi injetada em triplicata no instrumento LCM MSS. A sobreposição consistente demonstra a reprodutibilidade do instrumento e da preparação da amostra. O aumento do ruído químico observado para o modo de ionização negativa da fração de ácidos graxos pode ser devido a contaminantes nos solventes LCM S.

Portanto, apenas os metabólitos que aludiram antes de nove minutos foram analisados. Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio, MTBE, éter etílico e até mesmo os reagentes mais comuns usados neste método pode ser extremamente perigoso e precauções como usar jaleco, luvas e proteção para os olhos e realizar a preparação de amostras em uma capela de exaustão devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.