Name: Projeto e fabricação de Ultraleve Peso, ajustável Sondas Multi-eletrodo para gravações eletrofisiológicas em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Aprenda a projetar e fabricar sondas multi-eletrodo ultraleves e ajustáveis para gravações eletrofisiológicas em ratos. Este método permite registros estáveis de circuitos cerebrais em animais em comportamento livre.

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Agradecemos aos membros do laboratório Wilson por seus conselhos úteis sobre o método de fabricação.
Este trabalho foi apoiado pela Simons Foundation, um prêmio de carreira NIH pathway to independence do NINDS e um NARSAD Young Investigator Award (para MMH), bem como bolsas do NIH (para JAW).

1. Intenção do projeto <ol><li> Identificar a região do cérebro de escolha (núcleo geniculado lateral (LGN, tálamo visual)), percorrendo as seções sagital do cérebro do rato atlas eletrônicos. </li><li> No coordenadas A / P (-2,3 - -2,7 mm), o LGN é mais largo. Use esta região para projetar a parte inferior da unidade (peças inferiores). NOTA: Um total de 8 eletrodos independentemente móveis podem ser usados ​​para direcionar LGN (4-6 eletrodos vai fazer isso para o LGN, 2-4 eletrodos são adicionados para compensar erros de implantação, Figura 1A). </li><li> No SolidWorks, desenhar um esboço do corpo de design (Figura 1B) no plano frontal. Clique esboço e, em seguida, usar a combinação de linhas e curvas para fazer um desenho que irá incluir os contornos para a base da unidade, puxadores e poliamida meia ranhuras, como mostrado. Certifique-se de que o contorno não contém lacunas abertas. Em seguida, clique em Sair do esboço. </li><li> Em seguida, selecione a frente e os aviões certos, e clique em &quot;Create Axis &quot;. Em seguida, crie o modelo de corpo de design 3D rodando o contorno de esboço azul realçado (Figura 1B) 360 °. No menu de recursos, clique em &quot;Revolved Boss / Base&quot;. Escolha a linha média como o eixo de revolução. Na seção de parâmetros, sob a direção de um clique Cego, e sob ângulo selecionar 360,00 graus. Na seção contornos selecionado, verifique se o azul destacou contorno é o selecionado. </li><li> Criar meia um slot poliimida revolvendo o vermelho destacou contornos 13 ° (Figura 1C, canto superior esquerdo). Passos são idênticos aos 1.4 acima, excepto para a especificação ângulo </li><li> Criar uma unidade lida pelo revolvimento do contorno verde 15 ° (Figura 1C, canto superior direito). </li><li> Crie a segunda alça da unidade usando a função padrão circular (Figura 1C, canto inferior esquerdo). No menu de recursos, clique em &quot;Circular Pattern&quot;. Em parâmetros, escolha a linha média como eixo de revolução. Selecione uma80,00 graus como o ângulo, e 2 como o número de ocorrências. Certifique-se que o primeiro identificador é selecionado em &quot;Recursos para Pattern&quot;. </li><li> Criar dezesseis poliimida meia-slots com a função padrão circular (Figura 1C, canto inferior esquerdo). Realize movimentos semelhantes a 1.7, mas marcar a primeira metade do slot poliimida como os &quot;Recursos para padrão&quot;. O ângulo é de 22,5 ° eo número de casos são 16 (Nota: esta é apenas a 360 ° dividido pelo número de vezes que você quer padrão o recurso) </li><li> Criar um novo plano no qual desenhar o receptáculo poliimida. Conseguir isso clicando em &quot;Inserir&quot; no menu principal. Clique em &quot;Geometria de referência&quot;, selecione os dois lados de slots de meia poliimida e clique em &quot;Criar Novo Plano&quot;; (Figura 1E, em cima) </li><li> Crie o receptáculo microdrive (o orifício do parafuso, polyimides buraco e anti-binário ferroviário (Figura 1D, inferior). Conseguir isso através da criaçãoum esboço que engloba todas estas características sobre o novo plano criado em 1,9. Note-se que para os carris de anti-torque, definem uma linha de centro, entre os dois lados das ranhuras superiores de poliamida. Em seguida, desenhe os trilhos anti-torque através da criação de dois círculos perpendicular à linha central, cujos centros são um raio de distância, e, em seguida, corte o contorno do meio. </li><li> No menu Recursos, clique em &quot;Extrude Boss / Base&quot; para criar o trilho anti-torque e escolher uma extrusão cega de 10 mm que vai para cima e dois milímetros de ir para baixo. Para o orifício do parafuso e furo poliimida, clique em &quot;cut Extrude&quot; e escolha seis milímetros cego, e alguns mms indo para cima para ambos (Figura 1E, esquerda). </li><li> Padrão receptáculo micro-drive 16x, utilizando o centro como o eixo de revolução (22,5 °, 16 casos, espaçamento igual), (Figura 1E, à direita) </li><li> Na parte superior da alavanca, desenhar um quadro 3 mm x 3 milímetros começando na extremidade do centro da unidade de punho, de frente para o centro de umxis. Expulse esta 2 milímetros para cima usando a função &quot;Extrude Boss&quot;. Desenhe círculos de 1mm de diâmetro nos locais em que os parafusos do BEI vai continuar. Depois, fazer 1,5 milímetros &quot;Extrude Cut&quot; para fazer um buraco. Então, padrão da caixa e buraco duas vezes usando a função Padrão Circular (Sobreposição de texto: 180 °, 2 casos, espaçamento igual, em torno do eixo central). </li><li> Use as dimensões (em milímetros) na Figura 1F para desenhar um esboço parte superior. Use o &quot;Extrude Boss / Base&quot; para fazer um modelo 3D do mesmo. NOTA: Após essas etapas o projeto da unidade está completa. O corpo rígido físico é criado através do processo de estereolitografia. Há uma série de empresas que oferecem impressão estereolitografia baseado em arquivos STL. Recomendamos serviços que podem imprimir em plástico duro (como Accura® 55), com uma resolução mínima de pelo menos 0,1 mm. </li></ol> 2 Preparação de componentes Hyperdrive <ol><li> Coloque uma pequena(: &#39;. / 0116&#39; ID / OD 0,0071 &#39;&#39;; Wall: 0,00225) pedaço de fita dupla face em uma superfície plana e cortar o número necessário de 31 g de tubos de poliamida para cerca de 8 centímetros (Figuras 2A - 2B) . </li><li> Coloque para fora a primeira camada de tubos de guia na fita dupla face, tendo o cuidado de colocar tubos de guia o mais próximo possível um do outro na fita. Dab uma pequena quantidade de finos, de cola de cianoacrilato sobre a camada de poli-imidas. (Figura 2C) </li><li> Estabelecer rapidamente a uma segunda camada de poli-imidas (Figura 2D). </li><li> Criar um espaço reservado de fibra óptica usando uma cânula 26 G. Certifique-se de que este é lubrificado com um lubrificante à base de Teflon, antes de serem incorporados na montagem (Figura 2E). </li><li> Aplique uma linha de epóxi 4-5 mm de comprimento perpendicular ao feixe de poliimida (Figura 2F). Uma vez que o epóxi endurecido (2-3 horas), remova a fita da camada inferior e reePOxy o outro lado. Depois do epóxi ter endurecido de novo, a 26 L de uma cânula pode ser removida e a construção de corte no meio utilizando uma lâmina de barbear (Figura 2G), resultando em duas matrizes de poliamida, cada um dos quais pode ser usado para uma hiperpropulsão (Figura 2H). </li><li> Imprima o modelo de cone em uma folha de papel a transparência e cortar uma folha correspondente da folha de alumínio resistente (Figuras 3A - 3C). </li><li> Aplicar uma camada de epóxi à folha de alumínio e aplicar rapidamente o papel transparência. Usando um objecto pesado ou um pino de madeira, suavizar o epoxi de modo que ele é distribuído uniformemente (Figura 3D). </li><li> Recorte o molde cone e apertar em conjunto, utilizando um jacaré. Finalmente, use outra bagatela de epóxi para fixar permanentemente as peças (Figura 3e). </li></ol> 3. montagem final do Microdrive <ol><li> Prenda o BEI para o corpo rígidoE reinserir o 26 G cânula através da matriz de tubo guia poliimida. Alinhe a matriz de poliimida com o corpo rígido usando o buraco de fibra óptica no BEI para garantir que os tubos de guia são perpendiculares ao BEI e epóxi a matriz para o corpo rígido com cuidado para garantir que nenhum epóxi flui para os tubos de guia ou na corpo rígido (Figuras 4A - 4C). </li><li> Mapear cada tubo guia na matriz de poliimida para um suporte correspondente na parede interna do corpo da unidade. Deslize um pequeno anel de 33 L de poliimida, sobre cada tubo de guia e para dentro do suporte e aplicar uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato para fixar cada tubo guia. (Figuras 4D - 4E) Finalmente, epóxi todo o aparelho para a parede interior do corpo da unidade e cortar as poliamidas de modo a que se projectem ligeiramente acima do rebordo interior (Figuras 4F - 4G). </li><li> Construir uma montagem microdrive, colocando uma das custom-bparafusos uilt através do orifício central de uma peça superior, seguido de uma das molas 5 mm. Deslize o orifício exterior da peça de topo sobre uma das calhas, e suavemente a inserção do parafuso. Dirija o parafuso até que a mola atinge o comprimento mínimo comprimido. (Figuras 4H - 4I) Repita esse processo para cada trilho / Microdrive (Figura 4J). </li><li> Vire a matriz de unidade de cabeça para baixo e tirar uma foto da matriz de tubo guia. Esta imagem será utilizada para mapear a localização do tubo guia correspondente para cada microdrive (Figura 4K). </li><li> Inserir um tubo de poliimida (0,005 &quot;) em cada tubo de guia a partir da parte inferior da base da unidade. Deixe o tubo transportador estender 1-2 mm de distância do topo da microdrive totalmente abaixada e registro na fotografia da identidade do micro-drive correspondente. (Figuras 4L - 4M) </li><li> Epóxi tubo de poliimida ao suporte Microdrive, tomando cuidado para não let epóxi executado através do Microdrive para a primavera ou parafuso (Figuras 4 N, 4P - 4T). </li><li> Totalmente menor todas as microdrives. Cortar todos os tubos de descarga de poliimida fora na parte inferior da matriz de poliimida (Figura 4O). </li><li> Monte a placa de interface eletrodo à base da unidade utilizando dois # 00-90 x 3/16 &quot;dos parafusos (Figura 4R). NOTA: Neste ponto, a matriz de unidade está pronta para ser carregado com stereotrodes ou tetrodes. Para mais detalhes sobre a construção tetrodo e carregamento, consulte 10. A base da unidade impressa e os microdrives foram projetados em SolidWorks 2011 software 3D CAD: link para baixar os arquivos do SolidWorks. </li><li> Após o carregamento, a unidade de inverter cuidadosamente e diminuir o cone de blindagem sobre a unidade de forma que apenas a parte inferior sobressai. Cole o cone de proteção por epoxying o cone com o corpo rígido. </li><li> Após o cone está ligado, tira um pequeno comprimento defio de aço inoxidável (0,008 &#39;Bare, 0,011&#39; Revestido) eo pino ao BEI. Raspe o interior da peça, o cone de alumínio com uma agulha e o fio de terra para o cone de aço usando tinta de prata. Uma vez que a pintura prata secou, ​​reforçar com um pouco de epóxi. Alternativamente, o arame de aço pode ser directamente ligado ao cone com um pouco de epóxi condutora (MG Chemicals, Surrey, Canadá). </li></ol>

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63, 27-39 (2009).</li>
<li>Halassa, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+optical+drive+of+thalamic+reticular+nucleus+generates+thalamic+bursts+and+cortical+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective optical drive of thalamic reticular nucleus generates thalamic bursts and cortical spindles.</a> Nat Neurosci. 14, 1118-1120 (2011).</li>
<li>Tsien, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subregion-+and+cell+type-restricted+gene+knockout+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain.</a> Cell. 87, 1317-1326 (1996).</li>
<li>Nestler, E. J., Hyman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models of neuropsychiatric disorders.</a> Nat Neurosci. 13, 1161-1169 (2010).</li>
<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grand+challenges+in+global+mental+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li>
<li>Wilson, M. A., McNaughton, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+hippocampal+ensemble+code+for+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the hippocampal ensemble code for space.</a> Science. 261, 1055-1058 (1993).</li>
<li>Wilson, M. A., McNaughton, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+hippocampal+ensemble+memories+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of hippocampal ensemble memories during sleep.</a> Science. 265, 676-679 (1994).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve o processo de construção de uma matriz microdrive ultra-leve para alvejar uma única ou múltiplas regiões cerebrais no mouse. Após as etapas finais de construção, a hipervelocidade está pronto para ser implantado usando técnicas de implante cirúrgico padrão e afixado ao crânio do rato com cimento dental. Pós-implantação, os eletrodos podem cada ser avançado independentemente usando uma pequena chave de fenda, enquanto o mouse é contido com a mão. A distância por sua vez, que cada eletrodo avanços é determinado pelo passo do parafuso. Utilizando os parafusos referenciados aqui avança cada eletrodo aproximadamente 150 mm por sua vez, embora metade e quartas de voltas pode ser utilizado para uma maior resolução. As dimensões do esboço na Figura 1B determinar o tamanho total do implante, por conseguinte, uma forma óbvia para dimensionar implantes bidireccional é a alteração das dimensões em que esboço crítico. Além disso, the o comprimento dos parafusos pode ser estendida para atingir as estruturas mais profundas do cérebro. Recomendamos personalizado feito parafusos de titânio, como os que são leves e menos frágil do que o aço. Note-se que os trilhos antitorque preciso dimensionar de forma linear com o comprimento do parafuso, e, neste ponto, não se determinou o comprimento máximo a que estas estruturas podem ser impressas. Para atingir várias regiões do cérebro, a forma da parte inferior pode ser modificado. A adição de arruelas conhecidos tamanho (espessura de 200 um), poderia fornecer espaçadores necessários entre polyimides segmentação estruturas cerebrais separados (por exemplo, o hipocampo eo córtex pré-frontal). Estes poderiam ser incluídos nas etapas de montagem parte de fundo, e depois cortados após o epoxi endurece. A grande limitação deste projeto é a sua dependência de software proprietário (Solidworks, neste caso). O desenvolvimento futuro de programas de código aberto que fornecem interfaces conviviais propício para a concepção de tal equipamento com o mínimo de fu engenhariarodada seria de grande benefício para a comunidade da neurociência. Este método proporciona várias vantagens sobre os métodos existentes. Primeiro, o design é simples, dependente de poucos desenhos (Figura 1). Segundo, é ultra-leve, sem necessidade de cimento dental ou material pesado para entrar em sua montagem. Em geral, pesa cerca de 1,7 g - cerca de um terço do peso dos implantes comercialmente disponíveis de funcionalidade semelhante. Em terceiro lugar, ele não requer nenhum equipamento especializado para fazer - o corpo do implante pode ser impresso em 3D a partir de várias fontes (por exemplo approto.com, mas existem vários outros); os parafusos podem ser feitos (por exemplo antrinonline.com); as molas estão comercialmente disponíveis (por exemplo leesprings.com); e como resultado a totalidade do processo de montagem pode acontecer em um dia. Finalmente, estes implantes têm sido usados ​​para gravar a partir de várias regiões do cérebro durante o forrageamento naturais, tarefas comportamentais estruturadas e sono (Figura5). As aplicações futuras deste método incluem a implementação de sua escalabilidade. É provável que o implante pode ser dimensionado bidireccionalmente simplesmente mudando 1) o tamanho do esboço na Figura 1B e, 2) o número de recipientes de micro-unidade (Figura 1D) modelado. Por exemplo, ele pode ser escalado para baixo, para registro de agir livremente ratos início do desenvolvimento, e escalado para cima, para gravar a partir de ratos, coelhos, furões e primatas não-humanos, talvez. A palavra final é para lembrar ao leitor que críticos para a implementação bem sucedida do método descrito é o protótipo de todas as modificações que implementar para .stl arquivos de projeto em anexo. O leitor notará, por exemplo, que o desenho em anexo contém um &quot;Figura 8&quot; anti-torque ferroviário. Este foi o melhor projeto possível, dada a limitação de impressão 3D, como muitas vezes é necessário que nós perfuramos esses buracos. Tê-lo ser um círculo, se cortesiaestabilidade romise, mas ter que ser um quadrado ou uma forma angular que limitaria a capacidade de corrigir imperfeições de impressão 3D por perfuração.

Mus musculus tem, devido à sua rastreabilidade genética, tornar-se rapidamente o modelo animal de escolha para os fisiologistas interessados ​​em nível de microcircuito dissecção de neurônios identificados geneticamente e na investigação de modelos de rato da doença humana. Por exemplo, a recente introdução de ferramentas genéticas causais, tais como atuadores genéticos optogenetic e químicas permitiu experimentalistas para testar a necessidade e suficiência dos circuitos neurais identificados no comportamento 1-4. A ampla disponibilidade de transgênicos linhagens recombinantes driver do mouse (CRE-linhas), ampliou a facilidade experimental pelo qual os subtipos de neurônios são direcionados, somando-se o valor do mouse para estas experiências 5. Da mesma forma, as telas genéticas e genômicas amplas associações de distúrbios neurológicos e psiquiátricos comuns têm facilitado a identificação de fatores de risco genético para a doença cerebral 6,7. Estes avanços, combinados com o crescimentocaixa de ferramentas para a manipulação genética e engenharia de genoma em camundongos, fizeram o organismo de escolha para a modelagem de doenças humanas. A combinação de modelos de doenças e ferramentas genéticas causais oferece uma oportunidade sem precedentes para a compreensão de doenças do cérebro e identificar alvos no nível do circuito de intervenções. Para tirar pleno partido destas ferramentas moleculares e ganhar a introspecção em função microcircuito na saúde e na doença, é essencial para associá-los com leituras fisiológicos da atividade cerebral. Idealmente, o experimentador seria capaz de controlar um grande número de neurónios, mantendo a resolução de células simples. Extracelulares, gravações multi-eletrodos em animais se comportando livremente fornecer tal oportunidade; no entanto, o uso desta tecnologia no rato tem sido limitado. Para gravar a partir de pequenos alvos (por exemplo, a camada CA1 do hipocampo), o uso de eletrodos ajustáveis ​​é necessário como pequenos movimentos em eletrodos de registro seguintes Surgicimplantação al tornar impossível a manutenção da estabilidade de gravação 8,9. Tradicionalmente, os métodos que têm sido empregados para mover eletrodos dentro do cérebro impor limitações de peso quando usado no rato, tornando-se um desafio para a gravação par de um grande número de neurônios com o comportamento neste organismo. Aqui, os métodos são introduzidos para a fabricação em miniatura, ultra-leves, matrizes de microeletrodos que são individualmente customizável a região do cérebro a ser alvo, optogenética-compatível, e facilmente montado a partir de peças disponíveis no mercado. Cada &quot;microdrive&quot; dentro do multi-eletrodo &quot;hipervelocidade&quot; utiliza um mecanismo de mola e parafuso para fazer avançar o eletrodo e um trilho de plástico, integrado ao corpo da hipervelocidade, para contrariar o torque do parafuso. Primeiro, o processo de concepção dos corpos Hyperdrive e microdrives em um programa CAD para a impressão 3D é descrito. Ao projetar corpos Hyperdrive que são personalizadosde estruturas específicas, é possível aumentar a precisão de orientação e para aumentar ainda mais o rendimento da preparação. Em segundo lugar, o processo de fabricação é descrito em detalhe, em que a matriz de multi-eléctrodo é montada a partir de peças de mão que estão disponíveis comercialmente. Esta técnica tem sido utilizada, com sucesso, para gravar a partir de conjuntos de neurônios no hipocampo, tálamo e córtex no animal se comportar livremente durante o forrageamento natural e tarefas operantes.

<table><tbody><tr><td>Parafusos Microdrive</td><td>Antrin</td><td></td><td>Half Circle 0.6 UNM Titanium Screws. Rosca de 8 mm. 9 mm de comprimento sob a cabeça.</td></tr><tr><td>Torneira</td><td>AGS CO.</td><td>#TA2</td><td>Microdrives</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de graxa de rosqueamento<td>, consulte . STL</td></tr><tr><td>arquivo Corpo</td><td></td><td></td> da unidade <td>Consulte . Arquivo STL</td></tr><tr><td>Componentes Invasivos do Tubo Guia de Poliimida Externa</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Item IWG # 72113300022-012</td><td>Comprimento: 12' ', ID: 0,0071' ', OD: 0.0116' ', PAREDE: 0,00225' '</td></tr><tr>Componentes Minvasive <td>do Tubo Guia Interno de Poliimida</td><td>&nbsp;</td><td>Item IWG # 72113900001-012</td><td>Comprimento: 12' ', ID: 0,0035' ', OD: 0,0055' ', PAREDE: 0,001' '</td></tr><tr><td>Fio de aterramento</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>&nbsp; Catálogo # 791900</td><td>0.008'' Nu, 0.011'' Revestido</td></tr><tr><td>Tri-Flow</td><td></td><td></td><td>Lubrificante à base de Teflon - Aerossol</td></tr><tr><td>Molas Microdrive</td><td>Lee Spring</td><td>Parte # CB0050B 07 E</td><td>Diâmetro externo: 1.016 mm, Diâmetro do furo: 1.193 mm, Diâmetro do fio: 0.127 mm, Comprimento livre: 10.160 mm, Comprimento sólido: 3.581 mm</td></tr><tr><td><a name="RANGE! A24">Z-poxy 5 Minute</a></td><td>Pacer Technology (Zap)</td><td>PT37</td><td></td></tr><tr><td>Tinta Prateada</td><td>GC Electronics</td><td>Parte #: 22-023</td><td>Silver Print II</td></tr><tr><td></td><td>Tri-Flow&nbsp;</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>Tubo hipodérmico de 26 G - Peças pequenas de aço inoxidável</td><td></td><td>HTXX-26T-12-10</td><td>Comprimento: 12' ', ID: 0,012' ', OD: 0,018' '</td></tr><tr><td>Parafusos EIB</td><td>Component Supply Co.</td><td>MX-0090-03SP</td><td>#00-90 x 3/16' '</td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Toughcut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Papel Transparência de 22 mm</td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>PP2500</td><td></td></tr><tr><td>Folha de Alumínio</td><td>Reynold's Wrap Heavy Duty</td><td></td><td>Extra Grosso</td></tr></tbody></table>

projeto e fabricação de ultraleve peso, ajustável sondas multi-eletrodo para gravações eletrofisiológicas em ratos

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

O número de investigações fisiológicas no musculus rato, mus, sofreu um aumento recente, em paralelo com o crescimento nos métodos de genética de segmentação para dissecção microcircuito e modelagem de doenças. A introdução de Optogenetics, por exemplo, tem permitido a manipulação bidireccional de neurónios identificados geneticamente, em uma resolução temporal sem precedentes. Para capitalizar sobre essas ferramentas e obter insights sobre as interações dinâmicas entre microcircuitos do cérebro, é essencial que a pessoa tem a capacidade de gravar a partir de conjuntos de neurônios no interior do cérebro deste pequeno roedor, em ambas as preparações fixo-cabeça e se comportando livremente. Para gravar a partir de estruturas profundas e camadas de células distintas requer uma preparação que permite o avanço precisa de eletrodos para regiões cerebrais desejados. Para gravar conjuntos neurais, é necessário que cada um dos eléctrodos ser independentemente móvel, permitindo que o experimentador para resolver as células individuais, deixando neighbeletrodos Oring imperturbável. Para fazer as duas coisas em um rato comportando livremente requer uma unidade de eletrodo que é leve, resistente e altamente personalizável para a segmentação de estruturas cerebrais específicas. Uma técnica para a concepção e fabricação de miniatura, peso ultraleve, matrizes de eletrodos de micro-unidade que são individualmente personalizável e facilmente montado a partir de peças disponíveis comercialmente é apresentado. Estes dispositivos são facilmente escalável e pode ser personalizado para a estrutura a ser alvo; que tem sido utilizado com sucesso para gravar a partir de regiões do tálamo e do córtex de um animal comportando livremente durante seu comportamento natural.

Construção do implante é um processo que se inicia com o desenho do 3D impressa hiperpropulsão (Figura 1), se proceder à construção da peça de fundo (Figura 2), o cone de blindagem (Figura 3), e a montagem final do hiperpropulsão, pela construção individual dos microdrives (Figura 4). Estes passos são seguidos por carregar os microdrives com eletrodos (ver 10). Seguindo este passo, é possível utilizar estes dispositivos para gravar a partir de várias regiões do cérebro. Na Figura 5, a partir de um exemplo traça gravação simultânea do núcleo geniculado lateral (CGL) e do hipocampo (HPC) são mostrados. A estabilidade das unidades individuais mostrados na Figura 5B foi notável, que mostra formas de onda consistentes ao longo de um curso de vários dias. Estes neurónios foram confirmadas como neurónios LGN por ser sensível à luz emissora de diodo estimulação, como mostrado pelaperistimulus tempo histograma (PSTH) na Figura 5C. Nesta mesma preparação, HPC potencial de campo local foi registrado como um proxy para o estado comportamental. Esses traços mostrou ondulações acentuadas onda (Figura 5D), durante uma inibição comportamental, de acordo com a sua origem no hipocampo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51675/51675fig1highres.jpg" /> Figura 1 Projetando a hipervelocidade, Solidworks. A. Esquema de uma secção coronal do cérebro do rato em A / P coordena -2,3 - -2,7 mm de bregma. Quatro polyimides individuais (300 mM) são desenhadas acima do córtex, o que ilustra a segmentação da região de LGN (vermelho) com eletrodos. B. Esboço do corpo design. Rotativo o contorno azul 180 ° resulta em um modelo de corpo de design 3D (no detalhe). C. A adição de slots de poliimida e unidade lida com o corpo design. Rotativo a highl vermelhocontornos ighted em B por 13 ° resulta em um half-slot de poliimida (superior esquerdo). Uma alça da unidade é adicionada através da rotação de contorno verde em B por 15 ° (canto superior direito). A segunda alça é adicionado usando a função padrão circular (canto inferior esquerdo). A mesma função pode ser usada para criar os 16 slots de meia poliimida (canto inferior direito). D. Um novo plano é adicionado ao projeto (em cima), que permite criar um novo esboço para o receptáculo microdrive, composta pelo orifício do parafuso, polyimides buraco e ferroviário anti-torque (em baixo). E. Esses recursos serão implementados no projeto usando as funções de corte e de extrusão e girava 360 ° para criar 16 recipientes. F. Dimensões do esboço peça superior (esquerda) e do modelo 3D (direita ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51675/51675fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt= &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51675 / 51675fig2highres.jpg&quot; /&gt; Figura 2 Preparando a parte inferior da hipervelocidade. A. O primeiro tubo de poliimida é colocado fita dupla face. B. tubos subseqüentes são colocados individualmente, tendo o cuidado para minimizar o espaço entre os tubos. C. Após a primeira camada é colocada para fora , uma fina camada de cola de cianoacrilato é aplicado D. Uma segunda camada de poli-imidas é adicionado rapidamente antes de a cola é seca. E. No topo do feixe de poliimidas, um G cânula 26 é adicionado como um local para a fibra óptica. F . Toda a construção está firmemente fixada com uma gota de epóxi. G. Após a remoção da cânula, a construção pode ser cortado no meio com uma lâmina de barbear, obtendo-se dois pedaços de fundo idênticas. H. Ver na superfície de corte de uma acabado peça de fundo, que ilustra as duas filas de quatro poliimidaseo buraco para a fibra óptica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51675/51675fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51675/51675fig3highres.jpg" /> Figura 3 Montagem da hipervelocidade. A. A matriz de poliimida é inserido no corpo rígido, e alinhado com a placa de interface eletrônica (BEI), utilizando a cânula 26 G. B. Uma pequena quantidade de epóxi é usado para fixar a matriz de poliimida para o corpo rígido. C. Uma segunda aplicação de epoxi pode ser necessária, após o que o excesso de epoxi deve ser dremeled distância D. vista superior do corpo rígido com a matriz inserido. E. Usando um pequeno pedaço de tubo de poliimida 33 L, o exterior tubos de guia estão ligados nas ranhuras correspondentes do corpo rígido. F. </strong&gt; Todos os tubos de guia exteriores devem ser mapeados para um trilho, tendo o cuidado para minimizar a tensão sobre os tubos. G. Depois de todos os tubos de guia exteriores são mapeados, eles devem ser protegidos com epóxi e corte um pouco acima do lábio interno. H. A Microdrive montagem, que consiste de um parafuso construído por encomenda, uma mola 5 mm e uma parte superior deve ser montado e colocado sobre um carril correspondente a um dos tubos de guia. I. Cada conjunto microdrive deve ser cuidadosamente aparafusado no corpo rígido. J. Após a montagem, cada tubo guia deve ter um microdrive correspondente K. Vista inferior da poliimida matriz L -.. M. Tubos de poliimida (0.005 &#39;) são inseridas em cada tubo guia exterior. N. Cada tubo guia interno deve caber confortavelmente no garfo dele é microdrive correspondente. O. Os tubos de poliamida internos são presos com epóxi para o Microdrive correspondente ecorte tão curto quanto possível. Depois de todos os tubos de guia interiores são epoxied, os tubos de guia interior que saem da matriz de poliamida devem ser cortados rente com o lábio da matriz. P. invertido visão macro da unidade durante o carregamento do tubo guia interior. Q. Top visão macro da unidade durante o carregamento do tubo guia interior. R. Totalmente montado hipervelocidade com o BEI ligado, pronto para ser carregado com eletrodos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51675/51675fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51675/51675fig4highres.jpg" /> . Figura 4 Preparando o cone de proteção modelo A. Cone impresso em papel transparência B -. D. A folha de alumínio é colada ao molde usando uma fina camada de epóxi. E. &lt;<html> / Forte&gt; Depois de cortar o molde, o cone é formado e coladas umas às outras com epóxi. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/51675/51675fig5highres.jpg" /> Figura 5 gravações Multi-site usando a hipervelocidade ultralight de peso. Uma. Imagem de um rato comportando livremente com a hipervelocidade implantado. B. Exemplos de duas unidades de formas de onda único gravações deste mouse. C. Esquerda, corte coronal do cérebro do rato com destaque para o núcleo geniculado lateral, onde alguns dos eletrodos foram reduzidos. Certo, exemplo peristimulus histogramas de tempo (PSTHs) de dois neurônios LGN alinhados à estimulação visual (barra amarela). D. Direito, corte coronal com destaque para o hipocampo (HPC), onde um outro conjunto de eletrodos foram reduzidos. Certo, Exemplo de campo local, potencial de gravação de uma ondulação do hipocampo (destaque vermelho). nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/51675/51675fig6highres.jpg" /> Figura 6 Visão geral dos componentes de acionamento. (Esquerda) visão abrangente dos componentes Hyperdrive. (Direito) Ilustração de montagem na microdrive individual.

Compreender os substratos neurais do comportamento requer gravação de conjunto de circuitos cerebrais. Devido à sua tratabilidade genética, o camundongo oferece um modelo para dissecção de circuitos e mimetismo de doenças. Aqui, é descrito um método de projetar e fabricar sondas miniaturizadas que é adequado para atingir a estrutura cerebral profunda do mouse.

Projeto e fabricação de Ultraleve Peso, ajustável Sondas Multi-eletrodo para gravações eletrofisiológicas em Ratos

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

O objetivo geral deste procedimento é projetar e construir um implante robusto e ultra leve, com eletrodos ajustáveis independentemente, a partir de peças comercialmente disponíveis, que possa ser personalizado para direcionar qualquer região cerebral e que possa ser facilmente adaptado para uso em diversas espécies de animais pequenos. Primeiro, identifica-se a região cerebral de interesse e é necessário definir o arranjo dos eletrodos de registro. Isso determinará o design do corpo do drive e da base do drive.O segundo passo é criar o corpo do drive para acomodar os microdrives individuais, bem como as peças superiores, que sustentarão os eletrodos, utilizando um software de projetos tridimensionais. Em seguida, prepara-se a peça inferior contendo os tubos-guia para os eletrodos e um cone de blindagem. O passo final é montar completamente o hiperdrive inserindo a peça inferior no corpo do drive, construindo os microdrives individuais, fixando a placa de interface eletrônica e carregando os microdrives com os eletrodos.No fim das contas, o hiperdrive é implantado e podem ser obtidas gravações de unidade única de múltiplas regiões cerebrais. Devido à facilidade com que o hiperdrive pode ser personalizado e dimensionado, ele beneficiará o número de pesquisadores que trabalham com uma variedade diferente de modelos animais. Assim, ter implantes robustos e leves nos permite obter gravações estáveis de conjunto neuronal em camundongos com comportamento livre enquanto realizam tarefas psicofísicas.Para iniciar o procedimento, identifique a região cerebral de interesse. No nosso caso, é o núcleo geniculado lateral nas coordenadas AP negativas de 2,3 a 2,7 milímetros. O NGL é mais largo nesta região, e essa área é usada para projetar a base do drive.Abra o software Solid Works e selecione o plano frontal. Desenhe o perfil 2D da engrenagem utilizando a função de esboço, que incluirá os contornos da base da engrenagem, dos manípulos e das ranhuras poliamida meia. Certifique-se de que o contorno não contenha quaisquer lacunas abertas.Em seguida, selecione os planos frontal e direito e clique em criar eixo. Depois, clique na função base de revolução. Selecione o perfil 2D azul e, em seguida, gire o perfil 2D ao redor do eixo em 360 graus.Para criar a base de acionamento 3D, clique em cego sob a direção um e insira 360 graus como o ângulo de rotação. Em seguida, crie um entalhe semielíptico de poliamida selecionando o contorno destacado e utilizando a função de revolução para girar o contorno em 13 graus ao redor do eixo central. Posteriormente, selecione o contorno para as alavancas e gire-o em 15 graus ao redor do eixo central para criar a segunda alavanca de acionamento.Usando a função de padrão circular no menu de recursos, clique em padrão circular e escolha o eixo central como o eixo de revolução. Selecione 180 graus como o ângulo e dois como o número de instâncias, e certifique-se de que a primeira alça esteja selecionada em recursos a serem padronizados para criar 16 ranhuras semicirculares de poliamida. Usando a função de padrão circular, selecione a primeira ranhura semicircular de poliamida como o recurso a ser padronizado.Repita o padrão 16 vezes inserindo 16 no número de instâncias e 22,5 graus no ângulo. Defina um novo plano clicando na aba plano em geometria de referência. Selecione os dois lados de um dos slots superiores de poliamida para criar um novo plano.Este plano é onde o receptáculo será colocado. Desenhe os contornos circulares para o furo do parafuso e para o furo de poliamida neste plano. Para os trilhos antitorque, defina uma linha central entre os dois lados das ranhuras superiores de poliamida.Em seguida, desenhe os trilhos antitorque criando dois círculos perpendiculares à linha central, cujos centros estão separados por um raio, e depois recorte os contornos centrais para criar o encaixe do microacionador, incluindo o furo do parafuso, o furo de poliamida e o trilho antitorque. Clique em extrusão de corpo base para criar o trilho antitorque e escolha uma extrusão cega de 10 milímetros para cima e dois milímetros para baixo. Em seguida, adicione arredondamentos de 0,3 milímetro nas bordas utilizando a função de arredondamento.Para aumentar ainda mais a resistência do furo para o parafuso e do furo de poliamida, clique em extrusão, corte e escolha cego. Faça cortes de três milímetros em ambos os sentidos, para baixo e alguns milímetros para cima. Em seguida, repita o encaixe do microacionador 16 vezes usando o centro como eixo de revolução na parte superior do cabo.Desenhe uma caixa de três milímetros por três milímetros começando na ponta central do cabo da alavanca, voltada para o eixo central. Extruda esta caixa dois milímetros para cima. Utilizando a função de extrusão de corpo, desenhe círculos de um milímetro de diâmetro nos locais onde os parafusos da EIB serão colocados posteriormente.Faça um corte extrudado de 1,5 milímetro para criar um orifício. Em seguida, repita a caixa e o orifício duas vezes. Utilizando a função de padrão circular, faça cortes extrudados adicionais no corpo do acionador para reduzir ainda mais o peso, desenhando um padrão no plano frontal e usando a função de padrão circular.Depois disso, desenhe um esboço da peça superior com as dimensões indicadas em milímetros. Em seguida, utilize o recurso extrusão de corpo para criar um modelo 3D. Adicione arredondamentos de um milímetro nas quinas utilizando a função de arredondamento. Quando o projeto estiver completo, as peças do corpo e da parte superior do acionador podem ser impressas pela maioria dos serviços de impressão 3D.Neste procedimento, coloque um pequeno pedaço de fita dupla face sobre uma superfície plana e corte os tubos de poliamida de calibre 31 em pedaços de aproximadamente oito centímetros. Em seguida, disponha a primeira camada de tubos-guia o mais próximo possível uns dos outros sobre a fita dupla face. Depois, aplique uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato de secagem rápida sobre a camada de poliimidas.Em seguida, disponha rapidamente uma segunda camada de poliamida. Depois disso, crie um espaço reservado para fibra óptica utilizando uma cânula de calibre 26. Certifique-se de que a cânula esteja lubrificada com um lubrificante à base de teflon antes de ser incorporada à montagem.Em seguida, aplique uma linha de epóxi de quatro a cinco milímetros perpendicular ao feixe de poliamida. Uma vez que o epóxi tenha endurecido, após duas a três horas, remova a fita da camada inferior e reaplique o epóxi no outro lado. Após o epóxi ter endurecido novamente, remova a cânula de calibre 26.Faça um corte no centro usando uma lâmina de barbear para gerar duas matrizes de poliamida, sendo que cada uma pode ser usada para uma hiperunidade. Agora, imprima o molde do cone em uma folha de papel transparente e recorte uma folha correspondente de papel alumínio resistente. Aplique uma camada de epóxi sobre o papel alumínio e, em seguida, aplique rapidamente o papel transparente utilizando um objeto pesado ou um rolo de madeira, alisando o epóxi para que fique uniformemente distribuído.Em seguida, recorte o molde do cone e prenda-o com um clipe de jacaré. Por fim, use outra pequena quantidade de epóxi para fixar permanentemente as peças e montar a microplataforma. Primeiro, fixe a EIB ao corpo da plataforma usando dois parafusos.Em seguida, reinsira a cânula de calibre 26 através da matriz de tubos-guia de poliamida. Alinhe a matriz de poliamida com o corpo do drive utilizando o orifício para fibra óptica na EIB, garantindo que os tubos-guia fiquem perpendiculares à EIB. Depois disso, fixe a matriz ao corpo do drive com epóxi, tomando cuidado para que nenhum epóxi entre nos tubos-guia ou no interior do corpo do drive.Por fim, o excesso de epóxi é removido usando uma dremel após mapear cada tubo-guia na matriz de poliamida para um suporte correspondente na parede interna do corpo do acionador. Deslize um pequeno anel de poliamida 33 em cada tubo-guia e dentro do suporte. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato para fixar cada tubo-guia.Por fim, fixe todo o aparato à parede interna do corpo do mecanismo com epóxi e corte o poliamida para que eles fiquem levemente acima da borda interna. Em seguida, monte um conjunto de microacionamento inserindo um dos parafusos personalizados pelo orifício central de uma peça superior, seguido por uma das molas de cinco milímetros. Deslize o orifício externo da peça superior sobre um dos trilhos e aperte suavemente o parafuso.Em seguida, aperte o parafuso até que a mola atinja seu comprimento mínimo comprimido. Repita esse processo para cada micromotor de trilho. Depois, vire o conjunto de motores de cabeça para baixo e anote a disposição da matriz de tubos-guia.É usado posteriormente para mapear a localização do tubo guia correspondente a cada microdrive. Em seguida, registre a identidade do microdrive correspondente. Agora, insira um tubo IDE poli em cada tubo guia a partir da base do drive.Deixe o tubo suporte estender-se de um a dois milímetros acima do topo do microdrive totalmente abaixado. Em seguida, registre a identidade do microdrive correspondente na fotografia.Fixe o tubo de poliamida ao suporte do microdrive com epóxi, tomando cuidado para não deixar o epóxi escorrer pelo microdrive até a mola ou o parafuso. Em seguida, corte todos os tubos de poliimida na altura da cabeça do parafuso do microdrive e alinhe-os ao nível inferior da matriz de poliimida. Posteriormente, monte a EIB à base do drive utilizando dois parafusos.Neste momento, o conjunto de drives está pronto para ser carregado com TROs estéreo ou teros. Após o carregamento, inverta o drive e abaixe cuidadosamente o cone de blindagem sobre o drive, de modo que apenas a peça inferior fique exposta; fixe o cone de blindagem conectando-o ao corpo do drive com epóxi. Após a fixação do cone, descasque um pequeno pedaço de fio de aço inoxidável e conecte-o ao EIB.Risque a parte interna de alumínio do cone com uma agulha e conecte o fio de aço ao cone usando tinta de prata. Após a secagem da tinta de prata, reforce-a com uma pequena quantidade de epóxi. Abaixo há uma imagem de um camundongo em movimento livre com o hyperdrive implantado.E estes são exemplos de gravações de formas de onda de uma única unidade provenientes deste camundongo. Mostrada aqui está uma seção coronal do cérebro do camundongo destacando o núcleo geniculado lateral, onde alguns dos eletrodos foram posicionados. E aqui há um exemplo dos histogramas peri-estímulo de dois neurônios do NGL alinhados à estimulação visual.Aqui está a seção coronal destacando o hipocampo, onde outro conjunto de eletrodos foi posicionado. Um exemplo de gravação do potencial de campo local de um ripple hipocampal é mostrado aqui. Com a experiência adequada, um novo hyperdrive pode ser montado em um único dia. Os dispositivos desenvolvidos neste procedimento podem ser combinados com outras técnicas, como optogenética, para estimular e registrar de subpopulações identificadas de neurônios.

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Research

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