A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II
1 de agosto de 2014
O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.
O objetivo geral deste procedimento é detectar células T autorreativas com alto grau de especificidade utilizando dextrímeros de classe II do MHC. Neste vídeo, o cerebral é obtido a partir do cérebro de um camundongo com encefalomielite autoimune experimental induzida por proteína da bainha de mielina. Isso é realizado primeiramente colhendo cuidadosamente os tecidos e preparando os blocos de aros.
O segundo passo é cortar o tecido embutido em aros em seções de 200 micrômetros de espessura com um viome. As seções são então transferidas para câmaras de tecido em uma placa de 24 poços, onde são coradas e fixadas. O passo final é montar as seções de tecido em lâminas microscópicas.
Por fim, a microscopia confocal é utilizada para mostrar as células ligadas aos trimers de dex e ao anticorpo CD4. Concebemos essa ideia inicialmente quando demonstramos pela primeira vez que os dextrômeros de classe II do MHC eram mais sensíveis do que os tetrâmeros convencionais de classe II do MHC para detectar linfócitos T CD4 autorreativos específicos ao antígeno. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o corte de tecidos frescos e seu manuseio são bastante desafiadores.
A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de corte, montagem e análise são difíceis de aprender por serem delicadas. Além de Ting, dois pesquisadores pós-doutorandos, Chandy e Aaron do meu grupo e Christian do laboratório da Dra. Zoe, demonstrarão este procedimento. Após a eutanásia de camundongos com encefalomielite autoimune experimental ou EAE, remova o crânio cortando a calota craniana de forma circular usando uma tesoura curva e vire cuidadosamente os ossos do crânio com pinça. Obtenha o cérebro por dissecação romba usando um bisturi limpo.
Seccione o rerum do cerebelo. Coloque o rerum em um tubo contendo solução salina tamponada com fosfato a 1x fria, ou PBS, e mantenha o tubo sobre gelo até o processamento. Coloque o rerum em uma cassete histológica descartável de base profunda mantida sobre gelo.
Em seguida, despeje emulsão fundida de agarose com PBS tamponado a 4% de ponto de fusão baixo na cassete. Imediatamente, pressione suavemente o cérebro com pinça para submergir o tecido e deixe a cassete sobre gelo até que a solidificação esteja completa. Após a solidificação, remova o excesso de agarose de todos os lados do tecido embutido e exponha levemente a superfície ventral do cérebro.
Em seguida, espalhe cola super forte sobre o bloco de tecido Vibram e transfira o tecido embutido em aros para a superfície colada, posicionando a superfície ventral exposta do cérebro sobre a cola para o corte transversal. Não mova o tecido após posicioná-lo sobre o bloco. Coloque o bloco de vibrotono contendo o tecido embutido em aros sobre gelo e deixe a cola secar por 15 minutos.
Enquanto isso, coloque as câmaras de tecido preparadas em uma placa de 24 poços, com uma câmara por poço. Encha os poços contendo as câmaras de tecido com um mililitro de PBS 1X frio e deixe a placa sobre gelo. Assim que a cola estiver seca, abaixe a lâmina do vibram até o nível da superfície superior do tecido.
Defina a velocidade do Vibram em 0,22 milímetros por segundo e inicie o corte com um movimento para frente para obter cortes de 200 micrômetros de espessura. Usando um pincel macio para aquarela, transfira um corte cerebral para cada câmara de tecido. Na placa de 24 poços, mantenha a placa sobre gelo até a conclusão do corte para prevenir a degradação do tecido.
Em seguida, prepare uma segunda placa de 24 poços adicionando 300 microlitros de um coquetel contendo IA de S myelin protio lipid protein 1 39 a 1 51 dextro e anticorpo CD4 a três dos poços. Em seguida, adicione 300 microlitros do coquetel controle de IA de S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 a 86 dextro e anticorpo CD4 a outro conjunto de três poços. Prossiga para rotular os poços.
Em seguida, transfira três câmaras de tecido contendo as seções designadas para coloração com dex trimers específicos para os três poços designados da placa de 24 poços, com uma câmara por poço. Da mesma forma, transfira as três câmaras de tecido contendo as seções designadas para coloração com dex streamers controlados para esses poços. Com uma câmara por poço, cubra os poços com uma tampa.
Cubra a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma plataforma oscilante ajustada para rotação suave durante 1,5 hora no escuro e à temperatura ambiente. Após o período de incubação, lave as seções de tecido transferindo-as para um poço novo contendo um mililitro de solução de lavagem de um XPBS frio por pelo menos 10 minutos na plataforma oscilante. Repita a lavagem três vezes.
Certifique-se de que as seções de tecido não sequem, pois podem aderir às laterais da câmara. Fixe as seções transferindo as câmaras de tecido para um poço fresco. Da placa de 24 poços contendo um mililitro de paraformaldeído tamponado a 4% em PBS filtrado e incube em plataforma agitadora durante duas horas com rotações suaves.
Após lavar as seções mais três vezes, coloque as seções coradas e fixadas sobre uma lâmina microscópica limpa. Usando um pincel macio para aquarela, remova o excesso de água sem tocar na seção e monte a seção utilizando meio de montagem. Cubra com uma lamínula microscópica e deixe as lâminas secarem à temperatura ambiente durante a noite.
No quarto escuro, utilize um microscópio confocal Nikon A one Eclipse 90 I para a varredura rotineira e aquisição de imagens. Para iniciar, abra o software NIS elements AR, selecione os canais tetraethyl, rumine, isothiocyanate ou trit C e ciano cinco ou SCI cinco no painel. Os comprimentos de onda de excitação e emissão para os canais Trit C e SCI cinco aparecem por padrão.
Atribua a cor pseudocolorida verde para o canal Trit Sea e vermelha para o canal SCI cinco. Coloque a lâmina a ser examinada sobre a platina do microscópio e foque manualmente com aumento de 100 vezes. Ajuste o HV para um 10 e o offset para zero, clique em foco e ajuste a voltagem.
Para otimizar os lasers, clique em foco e escaneie a seção de cima para baixo, ajustando o nível Z para a aquisição de imagem. Em seguida, clique em série CH e adquira a imagem sequencialmente. Identifique células T dextro ou positivas para CD4 positivas, que aparecem como células pontilhadas amarelas com base na colocalização dos sinais gerados pelos canais vermelho e verde.
Utilize um microscópio confocal Olympus FV 500 BX 60 para a enumeração quantitativa fácil de células T dextro ou positivas para CD4 positivas. Para começar, abra o software flu ovu. Selecione os corantes S SI three e SCI five no menu suspenso e clique em aplicar para carregar os lasers respectivos.
Coloque a lâmina a ser examinada na platina do microscópio e foque manualmente com baixa ampliação, clique em foco enquanto o laser SI três está ligado e foque o foco inflamatório. Altere a objetiva para 100 vezes de ampliação. Defina o tamanho do arquivo como cinco 12 sobre cinco 12 no menu suspenso, clique em foco e ajuste os valores de ganho e deslocamento do PMT para otimizar separadamente o laser para S SI três e sci cinco, clique em Z stage e depois clique em foco enquanto ambos os lasers estão ligados.
Defina a espessura do estágio Z clicando nas setas para cima e para baixo. Defina o intervalo Z como dois micrômetros. Clique em parar e escolher.
Busque 1, 2, 3. Em seguida, clique em X, y, Z e comece a adquirir imagens em série Z para a área selecionada dentro do foco inflamatório; salve as imagens em série Z como arquivos VI. Para salvar os arquivos de imagem, selecione a imagem da série Z e, então, salve no formato TIFF.
Salve sempre imagens TIFF múltiplas. Primeiro, para proteger os dados; o próximo passo é examinar três seções pareadas que foram coradas com ambos os conjuntos de dex trimmers. Primeiramente, obtenha as imagens em série Z digitalizando as lâminas em um movimento horizontal vertical para cima e horizontal vertical para baixo, de modo a evitar a repetição de séries Z dentro do mesmo foco.
Uma vez que as imagens em série Z forem capturadas, nomeie os arquivos identificando os números dos lâminas, os nomes das seções e o número de imagens em série Z obtidas. Utilize o software Image J para contar as células T CD4 positivas dextro em relação ao número total de células T CD4 positivas. Selecione o tipo de contador no Image J, marque mostrar tudo e comece a contagem clicando no centro de cada célula e continue contando em diferentes imagens em série Z utilizando as setas laterais.
Após contar todos os linfócitos T CD4, escolha outro tipo de contador e conte os linfócitos T CD4 positivos dextro positivos. Clique na guia resultados para obter o número total de células contadas com os dois contadores diferentes. A detecção de linfócitos T CD4 específicos para a proteína protéica da mielina ou PLP foi realizada utilizando cortes cerebrais frescos derivados de camundongos com EAE e corados com coquetéis contendo anti-CD4 e dextros de PLP 139 a 151 ou dextros controle TMEV 70 a 86 por microscopia confocal de varredura a laser (LSCM).
A análise de cortes cerebrais corados em dupla marcação mostra células positivas para os trimeros dex de PLP 1-39 a 1-51 em vermelho e células positivas para o anticorpo CD4 em verde, enquanto as células duplamente positivas apareceram em amarelo. As células duplamente coradas exibiram pontos pontuados ao redor da periferia. Tal característica estava ausente nos cortes corados com o controle TMEV 70-86.
A detecção de linfócitos T CD4 específicos para miosina cardíaca por cortadores Dex mediante coloração in situ com a cadeia pesada alfa da miosina cardíaca alfa 334 a 352 Dexters também foi realizada. A análise dessas imagens por microscopia confocal de varredura a laser (LSCM) revelou a presença de células positivas para Dexters MYHC 334 a 352 em vermelho, células positivas para CD4 em verde e células marcadas tanto por Dexter quanto por CD4 como células pontilhadas amarelas. A coloração de fundo para os Dexters de RNA controle 43 a 56 foi desprezível. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de oito a dez horas, ao contrário de três dias com outros protocolos publicados, se for executada corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar os reagentes com antecedência e seguir os passos de forma sistemática. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como seccionar e corar os tecidos para a enumeração de células T CD4 reativas a proteína C reativa nos tecidos-alvo.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para detectar linfócitos T CD4 autorreativos no cérebro e no coração utilizando dextrâmeros de classe II do MHC. O método permite uma análise abrangente das frequências de linfócitos T CD4+ específicos por antígeno in situ.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Autoimunidade
Antecedentes
- Células T autorreativas desempenham um papel fundamental nas doenças autoimunes.
- Os dextrâmeros de MHC classe II são ferramentas para identificar populações específicas de células T.
- A contagem precisa das frequências de células T é essencial para compreender as respostas imunes.
- Este estudo concentra-se no cérebro e no coração, áreas-chave afetadas nas condições autoimunes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para detectar linfócitos T CD4 autorreativos.
- Quantificar as frequências de linfócitos T específicos por antígeno in situ.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos autoimunes no cérebro e no coração.
Métodos Utilizados
- Coleta de tecidos cerebrais e cardíacos de camundongos com encefalomielite autoimune experimental.
- Preparação de cortes teciduais utilizando um micrótomo.
- Coloração e fixação dos cortes teciduais para análise.
- Montagem dos cortes em lâminas microscópicas para visualização.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de linfócitos T CD4 autorreativos em tecidos cerebrais e cardíacos.
- Demonstrou a eficácia dos dextrâmeros de MHC classe II na detecção de linfócitos T.
- Forneceu um método confiável para enumerar frequências de linfócitos T.
- Contribuiu para a compreensão das respostas autoimunes em tecidos específicos.
Conclusões
- O protocolo oferece uma ferramenta valiosa para o estudo de linfócitos T autorreativos.
- Os achados podem orientar pesquisas futuras sobre doenças autoimunes.
- Estudos adicionais são necessários para explorar as implicações dessas populações de linfócitos T.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção de linfócitos T CD4 autoreativos em tecidos-alvo fornece subsídios mecanicistas sobre a patogênese autoimune, apoiando a validação de alvos nas áreas terapêuticas de neuroimunologia e cardiologia. A enumeração baseada em dextrâmeros de classe II do MHC permite a avaliação quantitativa das frequências de linfócitos T específicos por antígeno, contribuindo para a identificação de candidatos promissores e estratégias de desvio de riscos pré-clínicos. Essa abordagem sustenta decisões orientadas por dados de avançar/não avançar ao associar a infiltração de células imunes a danos teciduais relevantes para a doença em modelos de EAE e EAM.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da infiltração de linfócitos T CD4 específicos por antígeno nos tecidos cerebral e cardíaco.
- Valor Operacional: Oferece detecção específica de populações de linfócitos T autoreativos utilizando dextrâmeros de classe II do MHC com controles negativos apropriados.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica por meio da observação direta de linfócitos T específicos para PLP 139-151 e Myhc 334-352 in situ.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de imagens em série Z para análise de frequência de linfócitos T CD4 específicos para antígeno em cortes de tecido.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho reprodutível de coloração e aquisição de imagens por microscopia confocal para detecção consistente de linfócitos T.
- Valor Científico: Fornece leituras baseadas em colocalização (pontos amarelos) que indicam dupla positividade para marcadores dextramer e CD4.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona respostas imunológicas periféricas à autoimunidade tecido-específica nos modelos EAE e EAM.
- Valor Operacional: Facilita a comparação entre modelos dos padrões de infiltração de linfócitos T nos tecidos cerebral e cardíaco.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação mecanicista ao validar o engajamento de alvos por linfócitos T autoreativos em órgãos relevantes para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a caracterização de modelos pré-clínicos, permitindo o monitoramento imunológico em sistemas relevantes para a doença.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao confirmar a presença de linfócitos T específicos ao antígeno em tecidos-alvo após indução autoimune.
- Triagem: Fornece cortes de tecido prontos para ensaio com protocolos padronizados de coloração para visualização confiável de células imunes.
- Análises: Oferece medidas quantitativas de frequência obtidas por meio de imagens Z-seriais, permitindo comparação estatística entre condições experimentais e controle.
- Pesquisa Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao associar a detecção de linfócitos T à patologia tecidual em modelos autoimunes.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho compatível com plataformas para monitoramento imunológico em múltiplos modelos de doenças autoimunes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio da detecção direta e específica de linfócitos T autoreativos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de coquetéis padronizados de dextrâmeros, coloração e procedimentos de imagem confocal.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avançar/não avançar ao fornecer evidências mecanicistas de patologia tecidual mediada por alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em dados de infiltração de células imunes em tecidos relevantes.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em coleta de tecidos, seccionamento e microscopia confocal para detecção ideal do sinal.
- Depende do acesso a microscópios confocais de varredura a laser e fluorescência com conjuntos de filtros apropriados.
- Necessita de preparo padronizado de reagentes e condições de coloração para manter a especificidade do dextramer.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes tipos de tecidos ou modelos de doenças.
- Limitado pela autofluorescência do tecido e qualidade do corte, o que pode afetar a clareza da imagem e a precisão da quantificação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
1:49
In Situ Staining of Cerebral Sections with MHC Class II (IAs)/PLP 139-151 Dextramers
6:28
Analysis of Dextramer+ (dext+) CD4+ T Cells by Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM)
10:50
Results: In Situ Detection of Antigen-specific Autoreactive CD4 T Cells by Direct Staining with MHC Class II Dextramers
12:29
Conclusion
