Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial
6 de setembro de 2014
Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é <30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.
O objetivo geral deste procedimento é isolar rapidamente mitocôndrias puras e competentes para respiração do tecido de rato. Isso é feito primeiro associando e homogeneizando amostras de tecido. Os próximos passos são misturar a subína A no homogeneizado e incubado no gelo.
Isso é seguido pela filtragem da mistura homogeneizada em BSA e filtrando-a novamente. As etapas finais são girar o filtrado e ressuspender os grânulos mitocondriais no tampão respiratório. Em última análise, os resultados podem mostrar que as mitocôndrias isoladas são viáveis e competentes em respiração por meio da análise da respiração e de um ensaio de luminescência A TP.
A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes que relatam tempos de isolamento mitocondrial variando de 60 a cem minutos, é que as mitocôndrias viáveis e competentes para respiração podem ser isoladas em menos de 30 minutos. Allison mackay, um técnico de um laboratório colaborador demonstrará o ensaio de luminescência A TP pouco antes de começar. Dissolva a subína A em um mililitro de tampão homogeneizador e dissolva o BSA também em um mililitro de tampão homogeneizador.
Agora comece coletando duas amostras de tecido fresco usando um punção de amostra de biópsia de seis milímetros e armazene-as em um XPBS no gelo em um tubo de centrífuga de 50 litros. Quando estiver pronto, transfira o tecido para um tubo C de dissociação contendo cinco mililitros de tampão homogeneizador gelado. Em seguida, homogeneizar o tecido encaixando o tubo na dissociação do tecido e selecionando o ciclo de isolamento mitocondrial predefinido.
Quando terminar, coloque o tubo de volta no gelo e adicione 250 microlitros de sub para lyin uma solução estoque. Misture isso por inversão. Quando a mistura parecer uniformemente distribuída, incubar o homogeneizado no gelo durante 10 minutos.
Em seguida, coloque um filtro de malha de 40 mícrons em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros e coloque-o no gelo. Umedeça o filtro com tampão homogeneizador e descarte o tampão em um recipiente de resíduos. Então, quando tudo estiver pronto, despeje o homogeneizado no filtrado.
Adicione 250 microlitros de solução estoque BSA e misture por inversão. No entanto, esta etapa deve ser ignorada para análise de proteínas mitocondriais. Agora prepare mais dois.
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mililitros em gelo encaixam um com um filtro de 40 mícrons e o outro com um filtro de 10 mícrons. Molhe os dois filtros com um pouco de tampão homogeneizador e descarte esse tampão. Em seguida, despeje o homogeneizado primeiro através do filtro de 40 mícrons e depois através do filtro de 10 mícrons.
Essas etapas de filtração melhoram significativamente a pureza das mitocôndrias. Agora divida o filtrado entre dois tubos de micro fuge de 1,5 mililitro pré-resfriados e centrifugue-os a 9.000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda e combine os dois pellets mitocondriais purificados.
Em um mililitro de tampão de respiração gelada, é vital que todo o procedimento seja realizado a quatro graus Celsius. As mitocôndrias purificadas agora podem ser testadas para determinar a atividade metabólica das mitocôndrias isoladas. Um ensaio de luminescência A TP pode ser realizado usando um kit de ensaio A TP.
Primeiro, leve os reagentes do kit à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução estoque HT P e coloque-a no gelo. O próximo passo é adicionar cinco mililitros de tampão de substrato à solução de substrato liofilizado.
Misture delicadamente e coloque no escuro. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão respiratório a cada poço de uma placa de 96 poços que é preta opaca. Adicione 10 microlitros das mitocôndrias preparadas aos poços abaixo dos padrões A TP.
Cada amostra mitocondrial única deve ser semeada em três poços de tampão respiratório isolado como controle negativo. Continue adicionando 50 microlitros de solução de lise de células de mamíferos a cada poço depois de carregado. Incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos em um agitador orbital a 120 RPM.
Durante a incubação, preparar diluições do padrão A TP variando de um 10º milimolar a um 10º micromolar. Após a incubação, adicione 10 microlitros de cada um dos padrões A TP aos poços correspondentes indicados no mapa de placas. Em seguida, adicione 50 microlitros da solução de substrato reconstituído a cada um.
Bem, então incube a placa novamente, como antes, por cinco minutos. Prossiga examinando as placas no leitor de placas. Abra o software em.
Crie um novo item. Clique em experimento. Em seguida, clique no protocolo padrão e clique em OK.
Na coluna da esquerda, selecione protocolo. Em seguida, procedimento Próximo, selecione atraso e defina-o como 10 minutos. Então, tudo bem, a entrada.
Agora selecione, leia e escolha luminescência no menu suspenso. Ajuste as outras configurações da seguinte maneira. Tempo de integração do ponto de extremidade do tipo de leitura.
Um segundo. O filtro define uma posição óptica do orifício de emissão, sensibilidade superior 100, deslocamento vertical da sonda superior um milímetro. Depois de fazer essas alterações de configuração, clique em OK.
Clique no layout da placa e configure-o de acordo. Clique em OK. Agora, com tudo definido, clique no ícone da placa de leitura na linha superior e clique em ler.
Quando o espectrofotômetro abrir, coloque a placa na bandeja com o poço A um no canto superior esquerdo. Agora uma caixa exibindo a temperatura será aberta, clique em OK e prossiga com a análise dos dados. Amostras de músculo esquelético pesando cerca de 0,18 gramas de umidade produziram cerca de 24 bilhões de mitocôndrias com base na contagem do tamanho das partículas.
Amostras de fígado do mesmo tamanho deram alguns bilhões a mais. As leituras do hemocitômetro mitocondrial foram subestimadas usando o contador de partículas. Um rastreamento representativo foi obtido, o que mostra que as mitocôndrias isoladas estão localizadas sob um pico com um diâmetro médio de cerca de quatro décimos de mícron.
Isso está de acordo com relatos anteriores usando o ensaio de ácido bi. A proteína mitocondrial foi medida em alguns miligramas por grama de tecido do músculo esquelético e do fígado. O produto era viável e competente em respiração.
Mitocôndrias isoladas em um período de tempo compatível para intervenção terapêutica clínica e cirúrgica. As micrografias eletrônicas de transmissão indicaram que as mitocôndrias isoladas eram todas dentes de elétrons com danos a menos de um em 10.000, a contaminação foi inferior a um em cem mil A TP ensaio. Os resultados revelaram que as mitocôndrias eram viáveis e que o conteúdo de TP era de cerca de 11 ou 15 nanomoles por miligrama de proteína mitocondrial.
A análise da respiração mitocondrial foi realizada usando um eletrodo do tipo Clark e revelou que o consumo de oxigênio foi de cerca de 180 MLEs de oxigênio por minuto. Para cada miligrama de proteína mitocondrial, enquanto os valores de RCI estavam em torno de 2,5 com uma pontuação hepática ligeiramente mais alta Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 30 minutos se for executada corretamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método rápido para isolar mitocôndrias puras e competentes para respiração de biópsias de tecido de rato. O procedimento reduz significativamente o tempo de isolamento para menos de 30 minutos em comparação com métodos tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa Mitocondrial
Fundo
- As mitocôndrias são essenciais para a respiração celular e produção de energia.
- Métodos tradicionais para isolamento mitocondrial podem ser demorados.
- Técnicas de isolamento rápido podem aumentar a eficiência experimental.
- Mitocôndrias viáveis são cruciais para estudos metabólicos precisos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método mais rápido para isolar mitocôndrias de tecidos mamíferos.
- Garantir que as mitocôndrias isoladas sejam puras e funcionalmente competentes.
- Facilitar análises subsequentes de respiração e ensaios de ATP.
Métodos Utilizados
- Homogeneização de amostras de fígado de rato ou músculo esquelético.
- Uso de um dissociador de tecido comercial para mistura eficiente.
- Filtração sequencial através de filtros de malha de nylon.
- Ressuspensão dos pellets mitocondriais em tampão de respiração.
Principais Resultados
- Tempo de isolamento reduzido para menos de 30 minutos.
- As mitocôndrias isoladas demonstraram viabilidade e competência respiratória.
- Resultados validados por meio de análise de respiração e ensaios de luminescência de ATP.
- O método mostra potencial para aplicações mais amplas em pesquisas metabólicas.
Conclusões
- O método de isolamento rápido é eficaz para obter mitocôndrias funcionais.
- Esta técnica pode simplificar processos de pesquisa em estudos mitocondriais.
- Estudos futuros podem explorar sua aplicação em vários tecidos de mamíferos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Rapid mitochondrial isolation under 30 minutes enables timely functional assessment for preclinical metabolic studies and therapeutic screening. This method supports target validation by providing respiration-competent mitochondria from tissue biopsies, reducing biological variability in early discovery. The standardized tissue dissociation and filtration workflow improves reproducibility across labs, facilitating consistent data generation for go/no-go decisions in mitochondrial-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial function as a therapeutic target in metabolic disease models.
- Operational Value: Replaces manual homogenization with standardized tissue dissociation for uniform sample preparation.
- Predictive Value: Yields viable mitochondria for respiration and ATP assays, supporting mechanistic de-risking of lead compounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides purified mitochondria suitable for high-content respiration and luminescence-based assays.
- Operational Value: Eliminates repetitive centrifugation steps through differential filtration, increasing throughput.
- Assay Readiness: Delivers consistent mitochondrial yields (~2x10^10 per 0.18g tissue) for reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains mitochondrial integrity and respiration competence, critical for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Compatible with clinical timelines, enabling isolation within surgical intervention windows.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment via ATP content and oxygen consumption metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical mitochondrial assessment, offering a rapid, reproducible step before compound screening or efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mitochondrial dysfunction in disease models through functional readouts.
- Screening: Enables assay-ready mitochondrial preparations with improved purity via sequential 40µm and 10µm filtration.
- Analytics: Generates quantitative outputs for respiration analysis (oxygen consumption) and ATP luminescence, facilitating condition comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via respiration-competent mitochondria suitable for ex vivo testing.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol using commercial tissue dissociator allows cross-lab adoption and workflow integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial target engagement through validated respiration and ATP assays.
- Operational Value: Reduced isolation time (<30 min) and elimination of gradient centrifugation steps increase lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead identification by providing timely mitochondrial functional data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing false positives in mitochondrial-targeted screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and mitochondrial assay techniques.
- Dependent on access to a commercial tissue dissociator with preset mitochondrial isolation cycle.
- Necessitates sterile nylon mesh filters (40µm and 10µm) and temperature-controlled centrifugation (4°C, 9,000 x g).
- Standardization across tissue types (e.g., skeletal muscle, liver) may require optimization of dissociation parameters.
- Practical limitation: Method validated in rat tissues; extrapolation to human or other mammalian tissues requires additional validation.
