Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial
6 de setembro de 2014
Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é <30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.
O objetivo geral deste procedimento é isolar rapidamente mitocôndrias puras e com capacidade respiratória a partir de tecido de rato. Isso é realizado primeiramente associando e homogeneizando as amostras de tecido. Os próximos passos são misturar a subin A ao homogeneizado e incubá-lo no gelo.
Em seguida, realiza-se a filtração da mistura homogeneizada com BSA e uma nova filtração. Os passos finais consistem em centrifugar o filtrado e ressuspender os pellets mitocondriais no tampão de respiração. Por fim, os resultados podem demonstrar que as mitocôndrias isoladas são viáveis e possuem competência respiratória por meio da análise de respiração e de um ensaio de luminescência de ATP.
A principal vantagem desta técnica em comparação com os métodos existentes, que relatam tempos de isolamento mitocondrial variando de 60 a cem minutos, é que mitocôndrias viáveis e com capacidade respiratória podem ser isoladas em menos de 30 minutos. Allison Mackay, uma técnica de um laboratório colaborador, demonstrará o ensaio de luminescência de ATP logo antes do início. Dissolva a subin A em um mililitro de tampão de homogeneização e dissolva também a BSA em um mililitro de tampão de homogeneização.
Agora, inicie coletando duas amostras frescas de tecido utilizando uma punção de biópsia de seis milímetros e armazene-as em um XPBS com gelo em um tubo de centrífuga de 50 litros. Quando estiver pronto, transfira o tecido para um tubo de dissociação C contendo cinco mililitros de tampão homogeneizante gelado. Em seguida, homogeneíze o tecido encaixando o tubo no dissociador de tecidos e selecionando o ciclo predefinido de isolamento de mitocôndrias.
Quando finalizado, coloque o tubo novamente no gelo e adicione 250 microlitros de sub para lyin em uma solução estoque. Misture por inversão. Quando a mistura parecer uniformemente distribuída, incube o homogenato no gelo por 10 minutos.
Em seguida, coloque um filtro de malha de 40 micrômetros em um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros e coloque-o sobre gelo. Umedeça o filtro com tampão de homogeneização e descarte o tampão em um recipiente de resíduos. Depois que tudo estiver pronto, despeje o homogeneizado através do filtro para obter o filtrado.
Adicione 250 microlitros da solução estoque de BSA e misture por inversão. No entanto, este passo deve ser ignorado na análise de proteínas mitocondriais. Prepare agora mais duas.
Tubos cônicos de centrífuga de 50 mililitros sobre gelo, equipados um com filtro de 40 micrômetros e o outro com filtro de 10 micrômetros. Umedeça ambos os filtros com um pouco de tampão de homogeneização e descarte esse tampão. Em seguida, despeje o homogeneizado primeiro através do filtro de 40 micrômetros e depois através do filtro de 10 micrômetros.
Essas etapas de filtração melhoram significativamente a pureza das mitocôndrias. Agora, divida o filtrado entre dois tubos microcentrífugos pré-resfriados de 1,5 mililitro e centrifugue-os a 9.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda e combine os dois pellets mitocondriais purificados.
Em um mililitro de tampão de respiração gelado, é fundamental que todo o procedimento seja conduzido a quatro graus Celsius. As mitocôndrias purificadas podem agora ser testadas para determinar a atividade metabólica das mitocôndrias isoladas. Um ensaio de luminiscência de ATP pode ser realizado utilizando um kit de ensaio de ATP.
Primeiro, aqueça os reagentes do kit até a temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução estoque de HT P e coloque-a no gelo. O próximo passo é adicionar cinco mililitros de tampão de substrato à solução de substrato liofilizada.
Agite suavemente esta mistura e coloque no escuro. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de respiração a cada poço de uma placa de 96 poços opaca e preta. Adicione 10 microlitros das mitocôndrias preparadas aos poços abaixo dos padrões de ATP.
Cada amostra mitocondrial única deve ser semada em três repetições, com três poços contendo apenas tampão de respiração como controle negativo. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de lise de células de mamífero a cada poço após o carregamento. Incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos em um agitador orbital a 120 RPM.
Durante a incubação, prepare diluições do padrão de ATP variando de um décimo de milimolar a um décimo de micromolar. Após a incubação, adicione 10 microlitros de cada um dos padrões de ATP aos poços correspondentes indicados no mapa da placa. Em seguida, adicione 50 microlitros da solução de substrato reconstituída a cada poço.
Em seguida, incubar novamente a placa, como antes, por cinco minutos. Prossiga examinando as placas no leitor de placas. Abra o software em.
Crie um novo item. Clique em experimento. Em seguida, clique em protocolo padrão e clique em ok.
Na coluna esquerda, selecione o protocolo. Em seguida, selecione o procedimento. Depois, selecione o atraso e defina-o para 10 minutos. Então, confirme a entrada.
Agora selecione, leia e escolha luminescência no menu suspenso. Ajuste as outras configurações conforme a seguir. Tipo de leitura: tempo de integração no ponto final.
Um segundo. Defina o conjunto de filtros para uma posição óptica do orifício de emissão, sensibilidade máxima em 100 e deslocamento vertical da sonda superior em um milímetro. Após realizar essas alterações nas configurações, clique em OK.
Clique no layout da placa e configure-o adequadamente. Clique em OK. Agora que tudo está configurado, clique no ícone de leitura da placa na linha superior e clique em ler.
Quando o espectrofotômetro abrir, coloque a placa na bandeja com o poço A1 no canto superior esquerdo. Agora, uma caixa exibindo a temperatura será aberta; clique em OK e, em seguida, prossiga com a análise dos dados. Amostras de músculo esquelético pesando cerca de 0,18 gramas úmidas renderam cerca de 24 bilhões de mitocôndrias com base na contagem por tamanho de partícula.
Amostras de fígado de mesmo tamanho apresentaram alguns bilhões a mais. As leituras do citômetro de hemácias mitocondriais foram subestimadas com o uso do contador de partículas. Foi obtido um traçado representativo, que mostra que as mitocôndrias isoladas estão localizadas sob um único pico com diâmetro médio de cerca de quatro décimos de mícron.
Isso está de acordo com relatos anteriores que utilizam o ensaio com ácido biácido. A proteína mitocondrial foi medida em algumas miligramas por grama de tecido de músculo esquelético e fígado. O produto era viável e capaz de respiração.
Mitocôndrias isoladas em um período de tempo compatível com intervenção terapêutica clínica e cirúrgica. Micrografias eletrônicas de transmissão indicaram que as mitocôndrias isoladas eram todas densas ao elétron, com dano em menos de uma em 10.000, e contaminação em menos de uma em cem mil no ensaio de ATP. Os resultados revelaram que as mitocôndrias estavam viáveis e que o conteúdo de ATP era de aproximadamente 11 a 15 nanomols por miligrama de proteína mitocondrial.
A análise da respiração mitocondrial foi realizada utilizando um eletrodo do tipo Clark e revelou que o consumo de oxigênio foi de cerca de 180 MLEs de oxigênio por minuto por miligrama de proteína mitocondrial, enquanto os valores de RCI foram cada um em torno de 2,5, com uma pontuação ligeiramente mais alta no fígado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de 30 minutos, se for executada corretamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método rápido para isolar mitocôndrias puras e com capacidade respiratória a partir de biópsias de tecido de rato. O procedimento reduz significativamente o tempo de isolamento para menos de 30 minutos em comparação com métodos tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa Mitochondrial
Antecedentes
- As mitocôndrias são essenciais para a respiração celular e a produção de energia.
- Métodos tradicionais de isolamento mitocondrial podem ser demorados.
- Técnicas de isolamento rápido podem aumentar a eficiência experimental.
- Mitocôndrias viáveis são fundamentais para estudos metabólicos precisos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método mais rápido para o isolamento de mitocôndrias de tecidos de mamíferos.
- Garantir que as mitocôndrias isoladas sejam puras e funcionalmente competentes.
- Facilitar análises subsequentes de respiração e ensaios de ATP.
Métodos Utilizados
- Homogeneização de amostras de fígado de rato ou músculo esquelético.
- Uso de um dissociador de tecidos comercial para mistura eficiente.
- Filtração sequencial através de filtros de malha de náilon.
- Ressuspendimento dos pellets mitocondriais em tampão de respiração.
Resultados Principais
- Tempo de isolamento reduzido para menos de 30 minutos.
- As mitocôndrias isoladas demonstraram viabilidade e competência respiratória.
- Resultados validados por meio de análise de respiração e ensaios de luminiscência de ATP.
- O método mostra potencial para aplicações mais amplas na pesquisa metabólica.
Conclusões
- O método de isolamento rápido é eficaz para obter mitocôndrias funcionais.
- Essa técnica pode agilizar os processos de pesquisa em estudos mitocondriais.
- Estudos futuros podem explorar sua aplicação em diversos tecidos de mamíferos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento rápido de mitocôndrias em menos de 30 minutos permite a avaliação funcional oportuna para estudos metabólicos pré-clínicos e triagem terapêutica. Este método apoia a validação de alvos ao fornecer mitocôndrias com capacidade respiratória a partir de biópsias de tecido, reduzindo a variabilidade biológica nas fases iniciais da descoberta. O protocolo padronizado de dissociação e filtração do tecido melhora a reprodutibilidade entre laboratórios, facilitando a geração de dados consistentes para decisões de avanço ou interrupção em programas direcionados a mitocôndrias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a função mitocondrial como alvo terapêutico em modelos de doenças metabólicas.
- Valor Operacional: Substitui a homogeneização manual pela dissociação padronizada de tecidos para um preparo uniforme das amostras.
- Valor Preditivo: Fornece mitocôndrias viáveis para ensaios de respiração e ATP, apoiando a desmistificação mecanicista de compostos líderes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece mitocôndrias purificadas adequadas para ensaios de respiração de alto conteúdo e baseados em luminescência.
- Valor Operacional: Elimina etapas repetitivas de centrifugação por meio de filtração diferencial, aumentando a produtividade.
- Prontidão para Ensaios: Fornece rendimentos consistentes de mitocôndrias (~2x10^10 por 0,18 g de tecido) para triagem confiável de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a integridade mitocondrial e a competência respiratória, essenciais para testes pré-clínicos de eficácia.
- Valor Operacional: Compatível com cronogramas clínicos, permitindo o isolamento dentro das janelas de intervenção cirúrgica.
- Continuidade Translacional: Permite o alinhamento de biomarcadores por meio de métricas de conteúdo de ATP e consumo de oxigênio.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a avaliação mitocondrial pré-clínica, oferecendo uma etapa rápida e reprodutível antes da triagem de compostos ou estudos de eficácia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre disfunção mitocondrial em modelos de doenças por meio de leituras funcionais.
- Triagem: Permite preparações mitocondriais prontas para ensaios com pureza aprimorada por meio de filtração sequencial em 40µm e 10µm.
- Análises: Gera resultados quantitativos para análise de respiração (consumo de oxigênio) e luminiscência de ATP, facilitando comparações entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio de mitocôndrias com capacidade respiratória adequadas para testes ex vivo.
- Reutilização Corporativa: Protocolo padronizado utilizando dissociação comercial de tecidos permite adoção entre laboratórios e integração de fluxos de trabalho.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no engajamento mitocondrial por meio de ensaios validados de respiração e ATP.
- Valor Operacional: Redução do tempo de isolamento (<30 min) e eliminação de etapas de centrifugação em gradiente aumentam a eficiência do laboratório.
- Valor Estratégico: Permite iterações mais rápidas na identificação de compostos ativos ao fornecer dados funcionais mitocondriais em tempo hábil.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco mediante redução de resultados falso-positivos em triagens direcionadas às mitocôndrias.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manipulação de tecidos e técnicas de ensaio mitocondrial.
- Depende do acesso a um dissociador de tecidos comercial com ciclo pré-definido de isolamento mitocondrial.
- Necessita filtros estéreis de malha de náilon (40µm e 10µm) e centrifugação com controle de temperatura (4°C, 9.000 x g).
- A padronização entre diferentes tipos de tecidos (por exemplo, músculo esquelético, fígado) pode exigir otimização dos parâmetros de dissociação.
- Limitação prática: método validado em tecidos de rato; a extrapolação para tecidos humanos ou de outros mamíferos requer validação adicional.
