In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

O objetivo geral deste procedimento é obter pilhas 3D de alta resolução contendo células-tronco hematopoiéticas e progenitoras e monitorá-las ao longo do tempo por meio de imagens de lapso de tempo de vários pontos. Isso é feito rotulando primeiro as células-tronco hematopoiéticas e progenitoras ou HSCs com um corante lipofílico. Os HSCs são então injetados em um camundongo receptor.

O mouse é preparado para microscopia usando um capacete personalizado e suporte de amostra para posicionamento estável do animal. Em seguida, as pilhas de alta resolução de nichos de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras são obtidas e a imagem de lapso de tempo de vários locais da medula óssea contendo HS PCs é realizada em última análise, microscopia confocal intravital e duas fótons são usadas para mostrar a localização e o movimento de HSCs no espaço da medula óssea. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a imunofluorescência em seções da medula óssea, é que somos capazes de capturar informações em uma escala quadridimensional, três dimensões mais o tempo.

As implicações desta técnica se estendem à terapia de doenças hematológicas, pois ajuda a entender para onde precisamos direcionar as células-tronco hematopoiéticas dentro da medula óssea para garantir seu correto funcionamento. Tivemos essa ideia para esse método pela primeira vez quando percebemos o quão crucial era poder seguir os PCs HS ao longo do tempo. Este método nos ajuda a responder a quaisquer perguntas que tenhamos sobre o campo de nicho de células-tronco, onde queremos saber onde as células-tronco residem e como elas se comportam ao longo do tempo.

Para começar a colher as células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, conforme demonstrado por este laboratório em um vídeo geográfico anterior e referenciado no protocolo de texto. Em seguida, adicione o corante lipofílico DID à suspensão celular em uma concentração final de cinco micromolares. Vortex a suspensão imediatamente para garantir que o corante não precipite para fora da solução e não rotule as células.

Incube as células por 10 minutos a 37 graus Celsius para lavá-las. Primeiro gire a 500 vezes G por cinco minutos e transvase o líquido. Em seguida, ressuspenda as células em 200 microlitros de PBS e colete-as em uma seringa de insulina.

Uma seringa de insulina é recomendada em vez de uma seringa convencional porque não tem espaço morto na agulha. Permitindo a administração de toda a suspensão celular ao camundongo para injetar células em um camundongo letalmente irradiado por injeção na veia da cauda. Primeiro coloque o mouse em uma câmara quente.

Assim que a veia da cauda aparecer, vasodilatada, mova o mouse para o limitador. Deslize cuidadosamente a agulha na veia da cauda. Injete as células na veia.

Nenhuma resistência à injeção deve ser encontrada. Deixe o mouse durante a noite. Para permitir que as células migrem para os espaços da medula óssea, anestesiar o camundongo e monitorar o início da anestesia profunda por meio do reflexo da pétala.

Limpe a parte superior do couro cabeludo com 70% de etanol em um lenço de papel. Tomando cuidado para não deixar nenhum etanol entrar nos olhos do rato. Para expor a área da calvária a ser fotografada, faça uma pequena incisão na parte de trás da cabeça entre as orelhas, levantando a pele com a pinça enquanto segura a pele.

Deslize a tesoura sob a pele e corte suavemente ao longo da parte externa da área de imagem desejada. Limpe o osso exposto com um cotonete estéril umedecido com PBS estéril para manter o osso úmido. Isso evita ressecamento excessivo e cicatrizes, o que pode afetar a qualidade da imagem.

Em seguida, misture uma quantidade adequada de cimento dental em um barco de soro de leite até formar uma pasta. Aplique-o rapidamente na superfície inferior do capacete da autoclave que se fixará ao crânio. Antes que o cimento endureça, coloque o capacete no crânio do camundongo, certificando-se de não deixar nenhum cimento dental na área de imagem e espere que ele endureça.

Aplique uma pequena quantidade de hidrogel intra, que mantém o crânio úmido, tomando cuidado para não perturbar o cimento à medida que seca. Em seguida, prenda o capacete ao suporte e prenda-o no lugar. Usando o parafuso certificando-se de que as ranhuras se encaixem nos entalhes do suporte.

Remova o hidrogel com cotonetes estéreis antes de transferir para o microscópio. Em seguida, insira o suporte no microscópio stage e posicione a esteira de aquecimento sob o mouse. Insira a sonda do termômetro retal e prenda tudo no lugar no palco com fita adesiva.

Coloque uma pequena gota de pomada oftálmica nos olhos do camundongo para garantir que eles não sequem enquanto estiverem sob anestesia. O mouse não deve ser deixado sem vigilância em nenhum momento durante o processo de imagem enquanto estiver sob anestesia. Para focar no crânio através das oculares.

Primeiro, preencha a janela de imagem da calvária com água estéril purificada usando uma lente de imersão em água. Abaixe-o para que toque na gota de água. Concentre-se no topo do crânio usando as oculares do microscópio.

Posicione a área de imagem na sutura central e mova-se em direção à parte traseira da cabeça para encontrar a sutura coronal. Como posição inicial, coloque o software em um modo para capturar imagens XY, bem como uma pilha de três DZ. Defina a velocidade de imagem para 400 hertz e a resolução para 512 por 512 pixels.

Defina o software para que vários canais sejam capturados e defina o método de coleta para alterar as configurações entre pilhas ou entre quadros. Configure três configurações de captura independentes. Desligar a iluminação do laser no final da aquisição de cada pilha.

Em seguida, configure a primeira varredura sequencial para o sinal ósseo de geração de dois fótons do segundo harmônico. Abra o obturador do laser multifóton e certifique-se de que o ganho e o deslocamento do laser multifóton estejam configurados corretamente. Além disso, certifique-se de que a potência do laser seja de 12.5 a 25% e que o laser esteja ligado.

Selecione um PMT apropriado como o único detector e altere a cor para branco. Repita o procedimento de configuração do canal para autofluorescência combinada e DID na segunda configuração. Digitalize utilizando dois p mts apropriados.

Altere a cor do canal para verde para a autofluorescência e vermelho para o DID. Por fim, configure a terceira e última verificação para detecção de GFP. Defina a potência do laser da linha de laser de 488 nanômetros para cerca de 15%Selecione um tubo fotomultiplicador apropriado ou PMT como o único detector ativo e altere sua pseudo cor para verde.

Ative um modo de imagem ao vivo para iniciar uma varredura de visualização do canal selecionado e ajuste o ganho e o deslocamento do detector para uma exposição ideal. Repita isso para cada varredura na janela sequencial e salve as configurações dessas varreduras multicanal para facilitar a reutilização. Em seguida, ative a captura de várias posições conhecida como marcar e localizar neste software e redefinir os pontos de coordenadas.

Em seguida, escaneie a área de imagem óssea a partir da interseção entre a sutura central e coronal. Escaneie a profundidade da área da medula óssea usando autofluorescência e DID com uma visão composta. Quando uma célula for detectada, marque-a como uma nova posição de coordenada clicando no ícone adicionar nova posição no lado esquerdo da marca e da janela.

Quando o campo de visão atual tiver sido examinado, mova o palco para a distância de um campo de visão. Repita esse processo para cada campo de visão. Trabalhando gradualmente em torno de toda a janela de imagem à esquerda da sutura central, movendo-se em direção ao nariz do camundongo.

Assim que a bifurcação da sutura central estiver à vista, mova-se para o lado direito da sutura e repita o procedimento. Escaneando o lado esquerdo na direção inversa. Marque as coordenadas de quaisquer novas células de interesse usando a ferramenta de marcação e localização.

Para revisar os pontos, defina a parte superior e inferior de uma pilha de Zs ao redor de cada célula para cada posição. Para cada ponto, concentre-se para cima e para baixo e defina as posições Z superior e inferior para captura de pilha de três DZ. Atualize o ponto individual na marca e na localização, defina o intervalo Zack para cinco micrômetros e a média de cada canal de varredura sequencial para uma qualidade apropriada.

Adquira uma pilha de referência de alta qualidade para cada ponto de interesse iniciando todo o procedimento de verificação. Depois de concluir a verificação de alta qualidade, ative uma configuração de lapso de tempo para a captura e as configurações de lapso de tempo. Defina o intervalo de tempo para cinco minutos e o tempo de execução geral para a duração desejada.

Aplique essas configurações à verificação geral. Este exemplo mostra como a aquisição de mais de três pontos pode ser realizada Ao modificar essas configurações, o tempo de varredura pode ser reduzido para permitir um intervalo de lapso de tempo de cinco minutos, reduzindo o número de varreduras usadas para calcular a média, limitando a resolução a 512 por 512 pixels. Converter a digitalização em bidirecional e/ou aumentar a velocidade de digitalização para 600 hertz ou mais inicia a imagem como antes clicando no botão Iniciar e no software demonstrado.

Quando a imagem estiver concluída, execute a eutanásia do camundongo conforme detalhado no protocolo de texto. O suporte de mouse de alta precisão feito sob medida, incluindo uma janela de imagem de calvário, permite imagens prolongadas de PCs HS rotulados injetados em camundongos receptores letalmente irradiados mostrados aqui são fatias 2D de pilhas 3D de resolução de célula única 3D de HSPC contendo áreas de medula óssea de aproximadamente 90 a 120 micrômetros de espessura sinal de colágeno. O osso é mostrado em branco, as células marcadas com TDI são mostradas em vermelho.

As células autofluorescentes são mostradas em amarelo e as células osteoblásticas são mostradas em verde. Aqui é mostrado um filme de lapso de tempo 40 dos PCs HS identificados mostrando um HSC rotulado como DID em vermelho, migrando na proximidade de células osteoblásticas em verde Uma vez dominado. Esta técnica deve poder ser realizada em aproximadamente uma hora para a cirurgia e a imagem inicial, seguida do tempo adequado para a imagem com lapso de tempo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve estar bastante confiante em ser capaz de configurar a imagem do mouse e olhar para vários PCs HS ao longo do tempo.