Name: Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando Mycobacterium tuberculosis transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a técnica de mesodissecação para extração de RNA de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina. Este método permite analisar a expressão gênica de Mycobacterium tuberculosis em granulomas pulmonares.

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Os autores gostariam de agradecer aos seguintes prêmios NIH / subawards para o apoio a esta pesquisa: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, e P51OD011104.

1. Calibrar Mesodissection Instrumento com 2id Software Imaging O software de imagem 2id será referido como o software ou o programa para o restante deste artigo. Esta etapa é necessária para monitorar corretamente a imagem, bem como alinhar vários quadros de slides. <ol><li> Ligue instrumento eo computador. </li><li> Abra o software e selecione &quot;instrumento calibrar&quot;. </li><li> Calibrar viagem etapa, utilizando o joystick. Mover para a posição de fase superior esquerdo. Pressione o botão &quot;set&quot; no passo 1 em programa. </li><li> Mova etapa para baixar posição correta. Pressione o botão &quot;set&quot; no passo 2 no programa. </li><li> Calibrar aspiração pressionando primeiro &quot;botão Z&quot; para levantar a montagem cabeça. Pressione o botão &quot;pulso aspirado&quot; eo botão &quot;dissecação&quot; no joystick até haste de controle êmbolo atinge primeira posição. Pressione o botão &quot;set&quot; na etapa 3 do programa. </li><li> Pressione &quot;aspirado de reset &amp;# 8221; botão. Uma vez que o êmbolo pára no fundo posição imprensa &quot;set&quot; no passo 4. </li><li> Clique na guia &quot;escala&quot;. </li><li> Coloque governante calibração no lado em branco. </li><li> Concentre-se microscópio, se necessário. </li><li> Desenhar linha entre as duas barras de escala usando mouse. </li><li> Introduza a distância na caixa passo 2 Pressione o botão. &quot;Compute&quot; rotulados. </li><li> Clique na aba &quot;mira&quot;. Gire a velocidade do motor a 1. </li><li> Insira xScisor em conjunto da cabeça. Conjunto de cabeça inferior em posição pronta eixo z, premindo o botão &quot;eixo z&quot;. NOTA: O conjunto da cabeça é a grande estrutura na parte superior do instrumento de dissecação. O xScisor será referida como uma ponta de fresagem consumível para o resto do artigo. </li><li> Clique em &quot;dissecação envolver&quot; botão no joystick. NOTA: Este botão está localizado na parte superior do joystick. </li><li> Definir centro de rotação visualmente. Para fazer isso, mover o centro da cruz sobre o centro de rotação usando definird parâmetro no passo 1 do programa. Use o para cima e para baixo setas no &quot;x&quot; e &quot;bares do eixo y&quot; para ajustar os pixels para alinhar mira. Clique na guia &quot;feito&quot;. </li><li> Clique no ícone de &quot;casa&quot;. NOTA: Este é representada uma imagem casa localizada no canto superior direito por. </li></ol> 2. Criar Imagem de referência <ol><li> Coloque H &amp; E de slides no palco. Coloque tampa opaca em cima de slide. Dirija o instrumento, movendo o joystick para a área desejada da H &amp; E slide. Salve a imagem gerada. NOTA: Ou o guia &quot;captura de referência&quot; ou guia &quot;dissecar&quot; pode ser usado para concluir esta etapa. </li></ol> 3. Alinhe Tissue para Dissecção <ol><li> Clique na opção &quot;dissecar tecido&quot; na tela inicial. </li><li> Preencha o &quot;operador&quot;, &quot;número de dissecção adesão&quot;, &quot;referência número de acesso&quot;, &quot;xScisor número de código de barras&quot;, &amp; #8220; dissecção número muito fluida &quot;,&quot; tamanho xScisor &quot;e&quot; descrição &quot;na aba&quot; Configuração &quot;. </li><li> Clique no botão &quot;encontrar tecido&quot; tab. </li><li> Importação salvo anteriormente imagem de referência. </li><li> Coloque um slide de FFPE imaculada de 5 mícrons de espessura no palco. Mover fase para a mesma área que o descrito na imagem de referência. Clique na guia &quot;Inserir imagem&quot;. </li><li> Clique na aba &quot;align&quot;. Use o mouse e as setas associadas para alinhar a imagem de referência para a imagem imaculada. </li></ol> 4. Anotar Deslize <ol><li> Clique na aba &quot;anotar&quot;. </li><li> Use o mouse para desenhar um círculo ao redor da área desejada do slide que será microdissectados. </li></ol> 5. Carregar consumíveis Moinho Bit <ol><li> Preencha consumível pouco moinho com tampão desejado, aqui tampão PKD, puxando o êmbolo para cima e para baixo em um movimento fluido várias vezes. Certifique-se de excluir o arbolhas. </li><li> Levante-eixo Z pressionando botão &quot;eixo Z&quot;. </li><li> Carregar consumível pouco moinho em máquina. Para fazer isso, deslizando a broca de fresagem consumível para a parte superior da máquina, de modo que a linha de branco sobre as linhas de instrumentos com a linha preta na broca de fresagem consumível. Pressione o botão &quot;redefinição de aspiração&quot; para permitir que o êmbolo de ser rebaixada para a posição correta. NOTA: Deve ser fácil para deslizar a pouco moinho consumível. Se não for, verifique se os encaixes estão corretamente alinhados. </li><li> Eixo Z inferior em vez de pressionar o botão &quot;eixo Z&quot;. </li></ol> 6. Dissecar tecidual (Figura 4) <ol><li> Abra guia &quot;dissecar&quot;. </li><li> Vire velocidades do motor e aspiração a 1. </li><li> Marque a caixa &quot;show de rastreamento&quot;. Nota: Isso permite que o usuário visualize a área dissecados durante o processo de dissecação. </li><li> Uma vez pronto para dissecar, continuar a manter o botão &quot;engajar&quot;, bem como &quot;aspirado &amp; #8221; botão enquanto move joystick em sentido anti-horário para dissecar tecidos. </li><li> Continue a dissecar em sentido anti-horário até que o aspirado é guia &quot;completo&quot; fica vermelho. </li></ol> 7. Esvazie e remover consumíveis Moinho Bit <ol><li> Coloque um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL sob a ponta da broca de fresagem consumível. </li><li> Haste de controle da &quot;aspiração&quot; rapidamente para ejetar amostra em tubo de microcentrífuga. </li><li> Imprensa com maior força para ejetar usado consumível pouco moinho. </li><li> Enxágüe fragmento de tecido, puxando o êmbolo para trás. Empurre o êmbolo para a frente para expressar amostra restante em consumível pouco moinho. O fragmento de tecido vai agora ser contido no interior do tubo de microcentrífuga. </li></ol> 8. Lyse Amostra com Proteinase K Digestão de um tratamento térmico <ol><li> Adicionar 70 ul de TE, pH 8,5, contendo 5 mg de proteinase K e recuperado da amostra de tecido. </li><li> Colocar a amostra em programável aquecedor-shaker. </li><li> Digestão completa usando programável aquecedor-shaker com a seguinte programação: 60 ˚ C por 30 min a 1.500 rpm; 82 ˚ C durante 15 min a 1500 rpm; e 25 ˚ C durante 1 min a 450 rpm. A amostra está pronto para aplicações a jusante. </li></ol>

<ol><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques%3A+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li>
<li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li>
<li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li>
<li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+what+we+don%27t+know+can%2C+and+does%2C+hurt+us%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+fibrous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22AvanSciBio%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li>
<li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penitentiary+or+penthouse+condo%3A+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li>
<li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li>
<li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor%2C+SigH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li>
<li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li>
<li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li>
<li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro%2C+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li>
<li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li>
</ol>

Os autores revelam que não existem interesses financeiros concorrentes.

Mesodissection é uma técnica que pode ser aplicada para a extracção de ARN a partir de lâminas de lesões patológicas causadas por uma vasta gama de agentes patogénicos. É uma necessidade que o usuário acompanha a imagem e se alinha a imagem corretamente. Para conseguir isso, o instrumento deve ser calibrado de acordo com as instruções sobre o software de imagem. Ao dissecar, se o slide e área de interesse a ser dissecado não se alinham, o usuário deve recalibrar o instrumento. Outro passo importante no processo de disse...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

As amostras foram tradicionalmente microdissecado manualmente a partir de qualquer tecido ou conjunto lâminas usando uma agulha e bisturi. Isto exige uma separação clara entre a secção de tecido de interesse e tecidos circundantes pontos 2. Com os avanços na tecnologia actual perfil molecular, tem havido uma necessidade cada vez maior para avaliar tecidos ao nível celular. Devido às limitações de microdissecção manual, foram estabelecidas técnicas, incluindo LCM para permitir uma maior precisão isolamento. Esta técnica permite ao investigador para isolar populações de células específicas a partir de vários tipos de células e de deslizamento, que podem então ser utilizadas para ensaios a jusante, tais como a expressão do gene de perfil. Embora muito eficaz para ensaios a jusante, GCV não é sem limitações. Primeiro, LCM é um processo caro e demorado. Além disso, devido à natureza instável do ARN, que é muitas vezes difícil obter o RNA de alta qualidade a partir de amostras de LCM 2. Devido ao disadvantages de LCM, novos avanços na tecnologia microdissection ainda são necessários para torná-lo mais acessível a um maior número de pesquisadores, de forma sensível a preços acessíveis e de tempo. Um tal avanço da tecnologia microdissection agora está disponível uma técnica conhecida como mesodissection. Nesta técnica uma máquina é usada para moer a secção de tecido anotada de juros e aspira-lo em um consumível pouco moinho 3. Em seguida, essa amostra pode ser aspirado para dentro de um tubo de coleta e usado para aplicações a jusante. As vantagens deste sistema são que é significativamente menos dispendioso e sensíveis ao tempo. Em nossa experiência, o sistema permite a dissecação de uma secção de tecido granuloma pulmonar em dez minutos. Por outro lado, o LCM tradicional seria provável exigir horas para completar o processo. O sistema permite que o operador carregar uma lâmina de referência a ser usado como uma comparação, bem como ferramenta para anotação. Além disso, um relatório é gerado descrevendo ªárea e do slide que foi dissecado. Há duas principais desvantagens para mesodissection. Embora eficaz na extração de várias células, é um desafio para isolar uma única célula. Além disso, a precisão da imagem gerada não é tão clara como se estivesse usando outros microscópios de imagem. A tuberculose (TB) é um grande assassino de doenças infecciosas da humanidade em todo o mundo e resulta de infecção por M. tuberculosis. Na maioria dos indivíduos expostos a aerossóis de Mtb, a infecção é latente limitado. Em pelo menos 10 milhões de pessoas por ano, que resulta em doença tuberculose ativa 4. Durante a infecção latente, Mtb está contido dentro de lesões pulmonares patológicos conhecidos como granulomas. Por isso, tem-se argumentado que o resultado de infecção por M. tuberculosis é decidido ao nível do granuloma 5. Aqui demonstramos como mesodissection pode ser usado para microdissect granulomas provocadas por M. tuberculosis. Os slides utilizadossão de FFPE tecido pulmonar de macacos rhesus infectados. Para o propósito desta demonstração, vamos dissecar granulomas na sua totalidade. Também demonstramos que o RNA pode ser extraído a partir do tecido recuperado. Esta técnica pode ser aplicada a amostras de tecidos de várias outras amostras e, em seguida, utilizados para uma variedade de ensaios a jusante.

<table><tbody><tr><td>MeSectr</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mesodissector</td></tr><tr><td>400 nm xScisors</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Outros tamanhos disponíveis</td></tr><tr><td>THOR</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Programmable Heater-Shaker</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE kit de extração&nbsp;</td><td>Sistema FFPE Qiagen</td><td>73504</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq&nbsp;</td><td>Kit de Purificação de PCR Nugen</td><td>7150</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

uma nova abordagem para microdissecção recuperando<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo parafina incorporado lung granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissecção foi usado para o exame de tecidos em ADN, ARN, e os níveis de proteína de mais de uma década. Microscopia captura a laser (LCM) é a técnica de microdissecção mais comum usado hoje. Nesta técnica, um laser é usado para fundir focalmente uma membrana termoplástica que se sobrepõe uma secção de tecido 1 desidratado. O compósito secção de tecido é então levantada e separada da membrana. Embora esta técnica pode ser utilizada com sucesso para a análise de tecido, que é demorado e caro. Além disso, a conclusão bem sucedida de procedimentos que utilizam esta técnica requer a utilização de um laser, limitando assim o seu uso. Uma nova abordagem microdissection mais acessível e prático chamado mesodissection é uma possível solução para as armadilhas da LCM. Esta técnica utiliza o sistema de MESO-1/MeSectr moer o tecido desejado a partir de uma amostra de tecido montada deslizante, enquanto simultaneamente a distribuição e aspiração de fluido para recuperar a amostra de tecido desejado emum pouco moinho consumível. Antes do processo de dissecação começa, o usuário alinha a parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) deslizar com hematoxilina e eosina (H &amp; E) referência slide. Depois disso, o operador anota a área de dissecção desejada e prossegue para dissecar o segmento apropriado. O programa gera uma imagem arquivada da dissecção. A principal vantagem do mesodissection é a curta duração necessária para dissecar um slide, tendo uma média de 10 minutos de set up para provar geração neste experimento. Além disso, o sistema é muito mais rentável e fácil de usar. Um pequena desvantagem é que não é tão precisa como a microscopia de captura laser. Neste artigo, vamos demonstrar como mesodissection pode ser usado para extrair RNA de slides de granulomas FFPE causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

O referido protocolo mostra como usar uma nova técnica mesodissection extrair RNA a partir de lâminas de tecido FFPE. Eficácia deste protocolo é mostrado através de slides FFPE de granulomas pulmonares de NHP infectados com Mtb em vários estágios infectantes. Figuras 1-3 são imagens do instrumento. Figura 4 mostra como ocorre o processo de dissecação ea imagem resultante gerado pelo software. Tabela 1 mostra os resultados de extração de RNA com um granuloma de ...

Microdissecção tem sido extensivamente utilizada para a análise de DNA, RNA e proteínas dentro do tecido. Microscopia captura a laser (LCM) é o método mais comumente utilizado, mas uma nova técnica de fresagem, mesodissection, é recentemente disponível. Demonstramos extração de RNA a partir de mesodissected formalina parafina fixo lâminas de tecido embebidos de Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

O objetivo geral deste procedimento é microdissectar tecido de cortes em parafina fixados e embebidos em formalina. Isso é realizado primeiramente criando uma imagem de referência a partir de um corte representativo corado com hematoxilina e eosina. O segundo passo é posicionar um corte correspondente não corado, fixado e embebido em parafina, sobre a platina do instrumento e alinhar a área desejada para dissecção com a imagem de referência.Em seguida, a área de dissecação é anotada e uma ponteira masculina descartável é carregada com tampão e inserida no instrumento. O passo final é dissecar o tecido anotado. Em última análise, uma combinação de extração de RNA, amplificação e R-T-P-C-R é utilizada para demonstrar como o tecido dissecado pode ser usado na análise global da expressão gênica de Mycobacterium tuberculosis em granulomas pulmonares de Macaca mulatta infectados.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa da tuberculose, como a identidade dos genes que o Mycobacterium tuberculosis expressa em nichos in vivo semelhantes aos humanos durante diferentes estados infectados da tuberculose. Além disso, esses dados ajudarão a explicar a regulação dos patógenos, bem como as diferenças metabólicas e fisiológicas dentro desses estados distintos da doença. Assim, gerando alvos específicos para fármacos.O instrumento de dissecação meso é equipado com um microscópio digital integrado ao software de imagem com dois IDs e um joystick para controlar as posições do estágio XY. Antes de iniciar este procedimento, calibre o instrumento com o software de imagem conforme descrito no manuscrito suplementar para criar uma imagem de referência. Primeiro, coloque uma lâmina corada com hematina e eosina ou H&E sobre o estágio e posicione uma tampa opaca sobre a lâmina.Em seguida, conduza o instrumento movendo o joystick até a área desejada do lâmina de h e d. Salve a imagem gerada utilizando a aba capturar referência para alinhar o tecido a ser dissecado. Clique na opção dissecar tecido na tela inicial.No separador de configuração, preencha o número de acesso do operador para a dissecação, número de acesso de referência exci ou número de código de barras, fluido de dissecação, número do lote, tamanho exci e descrição. Clique no separador encontrar tecido. Importe a imagem de referência previamente salva.Coloque uma lâmina não corada com tecido formalina-fixado e emblocado em parafina, ou FFPE. Deslize uma espessura de cinco mícrons sobre a platina. Mova a platina para a mesma área mostrada na imagem de referência.Clique na guia alinhar. Use o mouse e as setas associadas para alinhar a imagem de referência com a imagem não corada. Por fim, anote o lâmina clicando na guia anotar.Use o mouse para desenhar um círculo ao redor da área desejada do lâmina que será microdissecada. Inicie este procedimento preenchendo o compartimento descartável com o tampão desejado, neste exemplo o Tampão PKD, puxando o êmbolo para cima e para baixo várias vezes com um movimento fluido. Certifique-se de excluir bolhas de ar.Eleve o eixo Z pressionando o botão do eixo Z. Carregue o bico macho descartável no instrumento. Insira o bico macho descartável na parte superior da máquina de modo que a linha branca no instrumento fique alinhada com a linha preta no bico macho descartável.Pressione o botão de reinicialização da aspiração para permitir que o êmbolo seja abaixado até a posição correta. Abaixe o eixo Z pressionando novamente o botão do eixo Z para iniciar a dissecação do tecido; primeiro, abra a guia de dissecação. Em seguida, ajuste as velocidades do motor e da aspiração para um.Marque a caixa mostrar rastreamento. Isso permite ao usuário visualizar a área dissecada durante o processo de dissecação. Mantenha pressionado o botão ativar e o botão aspirar enquanto move o joystick em direção contrária ao sentido horário.Continue a dissecção no sentido anti-horário até que o aspirado esteja cheio e a aba fique vermelha. Para coletar primeiro a amostra dissecada, pressione o botão do eixo Z para elevar o eixo, coloque então um tubo microfuga de 0,5 microlitro sob a ponta do bico macho descartável e pressione rapidamente a haste de controle de aspiração para ejetar a amostra no tubo microfuga. O fragmento de tecido estará agora contido dentro do tubo microfuga.Pressione a haste de controle de aspiração com força aumentada para ejetar a broca descartável usada. O protocolo demonstrado neste vídeo foi utilizado para microdissecar granulomas pulmonares de Resus Maca infectados com Mycobacterium tuberculosis ou MTB em diversos estágios infecciosos. A imagem de referência mostra um granuloma corado com hematoxilina e eosina (H&E) de um Resus Maca com infecção ativa, com a área de interesse a ser dissecada delimitada em verde.A imagem central mostra o lâmina FFPE não corada correspondente, com espessura de cinco mícrons, antes da microdiseção. As áreas foram alinhadas utilizando o software, e a área de interesse correlacionada está delimitada em verde. A imagem à direita mostra o mesmo lâmina FFPE não corado após a microdiseção, com a área dissecada representada em azul.O RNA foi posteriormente extraído dos granulomas dissecados a partir do meso em cada estado infeccioso, e esta tabela mostra os resultados. A concentração de RNA foi obtida utilizando um NanoDrop. O RNA foi então amplificado, purificado e transcrito reversamente para os resultados de RT-PCR em relação ao subunidade ribossomal 16 s, confirmando a presença do subunidade ribossomal 16 s do MTB e, portanto, do próprio MTB.Nas amostras microdissecadas, o DNA genômico da cepa CDC 1551 do MTB foi utilizado como padrão, seguindo este procedimento. Outros métodos, como extração de DNA-RNA e de proteínas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre genômica, transcriptômica e proteômica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como microdissecar amostras de FFPE de granulomas pulmonares.Este procedimento não se limita exclusivamente a granulomas pulmonares infectados por MTB, podendo ser aplicado também a lesões causadas por outros patógenos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo descreve a detecção de qPCR de citomegalovírus em tecido de biópsia fixado em formalina e embebido em parafina, que é rápido, sensível, específico e útil para interpretar padrões de coloração ambíguos de hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

A infecção por tuberculose humana é um processo complexo, difícil de modelar in vitro. Aqui, descrevemos um novo modelo 3D de tecido pulmonar humano que recapitula a dinâmica que ocorre durante a infecção, incluindo a migração de células imunes e a formação precoce de granulomas em um ambiente fisiológico.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Este protocolo de extracção modificado melhora RNA e DNA rendimentos provenientes de regiões mais precisamente alvo de interesse nos blocos de tecido histopatológicos.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Aqui, descrevemos um protocolo usando laser captura microdissection juntamente com análise de LC/MS espacialmente-quantificar as distribuições de drogas dentro de granulomas de tuberculose pulmonar. A abordagem tem ampla aplicabilidade para quantificar as concentrações de droga dentro de tecidos em alto detalhe espacial.

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Descrevemos um teste de ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose realizado após a inativação do calor da escória. A inativação do calor torna as amostras de espelo não infecciosas e evita a necessidade de laboratórios de nível de contenção 3 para testes moleculares de tuberculose.

Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)

Desenvolvemos uma técnica de processamento tecidual utilizando tecido pulmonar embebido em vibratótomo e agarose para gerar cortes pulmonares, permitindo a aquisição de imagens de alta resolução da arquitetura pulmonar. Empregamos a coloração de imunofluorescência para observar a expressão proteica espacial usando marcadores estruturais pulmonares específicos.

Secção Automatizada por Vibratomo de Tecido Pulmonar Incorporado em Agarose para Imagem por Fluorescência Multiplex

Apresentamos um método para um modelo de patogênese fúngica que preserva o posicionamento natural dos esporos fúngicos nas vias aéreas pulmonares para análise por microscopia fluorescente.

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

A implementação de uma técnica de fotoirradiação versátil e de baixo custo com o método IBEX manual permite imagens ideais de tecido humano com autofluorescência nativa significativa. Este protocolo detalha como obter imagens multiplexadas de lâminas inteiras de amostras clínicas arquivadas usando um microscópio invertido, reagentes amplamente disponíveis e software de código aberto para alinhamento e processamento de imagens.

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

Este protocolo descreve métodos para cultivar, manipular e analisar CAFs murinos, incluindo ensaios funcionais in vitro / in vivo , transcriptômica e análise computacional. Além disso, descreve uma plataforma baseada na web desenvolvida para analisar os transcriptomas publicamente disponíveis de componentes estromais e epiteliais microdissecados por captura a laser de uma coleção de tumores de câncer de mama humano.

Fibroblastos Associados ao Câncer de Tumores Mamários de Camundongos como Ferramentas para Estudos Moleculares e Computacionais

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda a técnica de mesodissecação para extração de RNA de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina. Este método permite analisar a expressão gênica de Mycobacterium tuberculosis em granulomas pulmonares.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando Mycobacterium tuberculosis transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas (Vídeo) | JoVE Journal

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando

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