Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando Mycobacterium tuberculosis transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

Microdissecção tem sido extensivamente utilizada para a análise de DNA, RNA e proteínas dentro do tecido. Microscopia captura a laser (LCM) é o método mais comumente utilizado, mas uma nova técnica de fresagem, mesodissection, é recentemente disponível. Demonstramos extração de RNA a partir de mesodissected formalina parafina fixo lâminas de tecido embebidos de Mycobacterium tuberculosis granulomas.

O objetivo geral deste procedimento é microdissecar o tecido a partir de lâminas formais e fixas embebidas em parafina. Isso é feito criando primeiro uma imagem de referência a partir de uma lâmina representativa de coloração de Hematin e Eoin. O segundo passo é colocar uma lâmina embutida em parafina formal e fixa não corada correspondente no instrumento stage e alinhar a área de dissecação desejada com a imagem de referência.

Em seguida, a área de dissecação é anotada e uma broca macho consumível é carregada com buffer e carregada no instrumento. A etapa final é dissecar o tecido anotado. Em última análise, uma combinação de amplificação de extração de RNA e RTPC é usada para mostrar como o tecido dissecado pode ser usado para análise da expressão gênica global de Mycobacterium tuberculosis em granulomas pulmonares de Reeses Maca infectados.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa da tuberculose, como a identidade dos genes que o mycobacterium tuberculosis expressa dentro de nichos in vivo semelhantes aos humanos durante diferentes estados infectados de tuberculose. Além disso, esses dados ajudarão a explicar a regulação dos patógenos, diferenças metabólicas e fisiológicas dentro desses estados distintos da doença. Gerando assim alvos específicos de drogas.

O instrumento de dissecção meso está equipado com o microscópio digital integrado com os dois softwares de imagem ID e um joystick para controlar as posições da platina XY. Antes de iniciar este procedimento, calibre o instrumento com o software de imagem conforme descrito no manuscrito que acompanha para criar uma imagem de referência. Primeiro coloque uma lâmina manchada de hematina e eoína ou h e e no palco e coloque uma tampa opaca em cima da lâmina.

Em seguida, dirija o instrumento movendo o joystick para a área desejada da corrediça h e d. Salve a imagem gerada usando a guia de referência de captura Para alinhar o tecido a ser dissecado. Clique na opção dissecar tecido na tela inicial.

Na guia de configuração, preencha o número de acesso de dissecação do operador, número de acesso de referência exci ou número de código de barras fluido de dissecação, número de lote, tamanho exci e descrição. Clique na guia encontrar tecido. Importe a imagem de referência salva anteriormente.

Coloque uma parafina formal e fixa não corada embutida ou FFPE. Deslize uma espessura de cinco mícrons no palco. Mova o palco para a mesma área representada na imagem de referência.

Clique na guia alinhar. Use o mouse e as setas associadas para alinhar a imagem de referência à imagem não manchada. Por fim, anote o slide clicando na guia de anotação.

Use o mouse para desenhar um círculo ao redor da área desejada do slide que será micro dissecado. Comece este procedimento preenchendo a broca de correio consumível com o buffer desejado neste exemplo Buffer PKD puxando o êmbolo para cima e para baixo em um movimento fluido várias vezes. Certifique-se de excluir bolhas de ar.

Levante o eixo Z pressionando o botão do eixo Z. Carregue a broca de correio consumível no instrumento. Deslize a broca macho consumível na parte superior da máquina para que a linha branca no instrumento se alinhe com a linha preta na broca macho consumível.

Pressione o botão de reinicialização por aspiração para permitir que o êmbolo seja abaixado para a posição correta. Abaixe o eixo Z pressionando o botão do eixo Z novamente para iniciar a dissecção do tecido primeiro, abra a guia de dissecação. Em seguida, gire as velocidades do motor e da aspiração para um.

Marque a caixa de rastreamento de exibição. Isso permite que o usuário visualize a área dissecada durante o processo de dissecação a ser dissecado. Segure o botão de engate, bem como o botão de aspiração, enquanto move o joystick no sentido anti-horário.

Continue a dissecar no sentido anti-horário até que o aspirado esteja cheio e a aba fique vermelha. Para coletar a amostra dissecada primeiro, pressione o botão do eixo Z para elevar o eixo, depois coloque um tubo de micro fuge de 0,5 microlitro sob a ponta da broca macho consumível e pressione a haste de controle de aspiração rapidamente para ejetar a amostra no tubo de micro fuge. O fragmento de tecido agora estará contido no tubo de microfuga.

Pressione a haste de controle de aspiração com força aumentada para ejetar a broca de material consumível usada. O protocolo demonstrado neste vídeo foi usado para microdiseccionar granulomas pulmonares de Resus Maca infectados com Mycobacterium tuberculosis ou MTB em vários estágios infecciosos. A imagem de referência mostra um granuloma corado com h e D de uma maca reus ativamente infectada com a área de interesse a ser dissecada delineada em verde.

A imagem do meio mostra a lâmina FFPE não corada correspondente de cinco mícrons de espessura antes da dissecação. As áreas foram alinhadas usando o software e a área de interesse correspondente é delineada em verde. A imagem à direita mostra a mesma dissecção pós-slide FFPE não corada com a área dissecada representada em azul.

O RNA foi posteriormente extraído dos granulomas meso dissecados em cada estado infeccioso, e esta tabela mostra os resultados. A concentração de RNA foi obtida usando um NanoDrop. O RNA foi então amplificado, purificado e transcrito reversamente para CD N-A-R-T-P-C-R os resultados em relação à subunidade ribossômica 16 s confirmam a presença da subunidade ribossômica MTB 16 s e, portanto, MTB.

Nas amostras de microdisect DNA genômico da cepa CDC 1551, o MTB foi usado como padrão após este procedimento. Outros métodos como D-N-A-R-N-A e extração de proteínas podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre genômica, transcriptômica e proteômica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microdisectar amostras FFPE de granulomas pulmonares.

Este procedimento não se limita apenas a granulomas pulmonares infectados por MTB, mas também pode ser aplicado a lesões de outros patógenos.