Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

O objetivo do experimento a seguir é gerar uma réplica de carbono e platina de materiais biológicos ou outros para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Para isso, espécimes preparados como réplicas simples e duplas são submetidos a taxas de congelamento ultrarrápidas para limitar a formação de cristais de gelo. Em seguida, o espécime congelado é fraturado por manipulação remota a temperaturas chamadas de nitrogênio líquido, sob alto vácuo, o que divide a membrana através da bicamada lipídica, produzindo uma face extracelular e uma face próxima ao aspecto citoplasmático.

Como um passo adicional opcional. Características subjacentes podem ser reveladas quando a água é removida da superfície da amostra fraturada posicionando o braço do micrótomo refrigerado sobre a platina da amostra, criando um gradiente de temperatura que faz a água sublimar da superfície. Em seguida, uma réplica é gerada pela evaporação de carbono e platina sobre a superfície fraturada.

O espécime original é digerido a partir da réplica, a qual é recuperada sobre uma grade para espécime de microscopia eletrônica de transmissão. Em última instância, a técnica de fratura por congelamento e ataque por congelamento é utilizada para mostrar detalhes estruturais tridimensionais de membranas celulares, arranjos moleculares e nanomateriais ao serem examinados por microscopia eletrônica de transmissão. A principal vantagem deste método em relação a técnicas existentes, como o exame de seções ultrafinas, é que os objetos de interesse podem ser visualizados em três dimensões com resolução de microscopia eletrônica.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia celular e molecular e nanotecnologia, como as características dimensionais e estruturais das membranas celulares e a organização de arranjos moleculares e de nanomateriais. Tive pela primeira vez a ideia para este método ao perceber que estudos semelhantes haviam sido realizados em protozoários eucarióticos com descobertas importantes, mas que temas relevantes para a saúde humana haviam recebido pouca atenção. Inicie este procedimento com o preparo de espécimes biológicos para fratura congelada e borda congelada, conforme descrito no protocolo textual.

Selecione hastes de espécime de ouro ou cobre de tamanho e forma apropriados para o espécime sendo processado, utilizando pinças de grau fino e/ou agulhas de seringa de pequeno calibre. Posicione pequenos fragmentos do espécime na parte superior de uma haste metálica. Reduza o conteúdo líquido do espécime a uma consistência pegajosa, ligeiramente semelhante à cola, removendo o líquido da borda da haste com papel de filtro para réplicas únicas.

Use agulhas de seringa de pequeno calibre para criar um montículo de tecido no suporte para réplicas duplas. Inverta outro suporte, posicione-o exatamente sobre o suporte e coloque-o levemente sobre a superfície da amostra. Formando um sanduíche.

Não pressione a amostra para fora entre os dois suportes. Em seguida, encha dois recipientes duplos isolados com nitrogênio líquido. O primeiro recipiente acomoda um suporte metálico contendo um pequeno poço, que é usado para liquefazer um pequeno volume de gás propano proveniente de um cilindro comercialmente disponível.

O segundo recipiente é um reservatório com divisão para armazenamento, utilizado para manter brevemente espécimes congelados em nitrogênio líquido. Utilize propano somente em capela química certificada para esse fim. Tenha cuidado para evitar fontes de ignição adventícias, use vestimentas protetoras contra temperaturas mais baixas e mantenha ventilação adequada, pois o propano é explosivo.

Pode causar lesão por congelamento ao contato e é um agente asfixiante. Com o bico do cilindro posicionado no propano, abra bem a válvula do cilindro e permita que o gás flua para o interior do primeiro recipiente, onde se liquefazerá o mais rapidamente possível. Pegue o suporte do espécime com pinças de precisão e mergulhe-o no gás liquefeito no primeiro recipiente por vários segundos.

Em seguida, transfira rapidamente para o segundo recipiente contendo nitrogênio líquido. Uma vez que os espécimes estejam congelados, armazene-os sob nitrogênio líquido até o momento de transferi-los para a unidade de fratura por congelamento. Carregue os suportes de espécime de ouro em um suporte ou dispositivo de fixação tipo caderno, para réplica dupla, sob nitrogênio líquido, e mantenha-os nessa condição até o momento de posicioná-los na câmara de espécimes.

Quando a câmara atingir alto vácuo e o estágio for resfriado à temperatura do nitrogênio líquido, desligue a bomba, abra a câmara e posicione os suportes com as amostras montadas sobre a mesa de espécimes o mais rapidamente possível. Em seguida, ligue a bomba para restabelecer o alto vácuo e use os controles eletrônicos de temperatura do estágio e do braço para ajustar a temperatura da mesa de espécimes a menos 100 graus Celsius. Além disso, direcione nitrogênio líquido ao braço do micrótomo para levá-lo à temperatura do nitrogênio líquido.

Após atingir alto vácuo, ajuste a temperatura do estágio para menos 100 graus Celsius e, com o braço do micrótomo à temperatura de nitrogênio líquido, abra remotamente o porta-espécimes de réplica dupla, fraturando assim os espécimes sobre os suportes. Como etapa opcional adicional, os espécimes podem ser atacados para revelar estruturas subjacentes após a fratura. Para realizar o ataque, utilize uma lâmina de barbear mantida em um suporte no braço do micrótomo para raspar a superfície dos espécimes. Posicione o braço frio do micrótomo sobre as superfícies fraturadas por um a vários minutos para sublimar a água, revelando assim as superfícies celulares verdadeiras, a matriz extracelular e/ou os agregados moleculares.

Em seguida, ative a pistola de elétrons de platina-carbono ou pistola de resistência e permita que ela evapore uma fina camada de platina-carbono sobre a superfície fraturada a um ângulo de 30 graus a 45 graus. Isso geralmente exige aproximadamente 15 a 20 segundos. Ative a pistola de elétrons de carbono ou pistola de resistência da mesma maneira e evapore uma fina camada de carbono sobre a superfície do espécime fraturado diretamente de cima, a 90 graus, para dar suporte à réplica. Isso também geralmente exige aproximadamente 15 a 20 segundos após a conclusão da replicação, sombreamento e estabilização com carbono.

Desligue a bomba de vácuo e a câmara e remova o suporte da amostra do instrumento. Usando uma pinça de qualidade fina, remova cada suporte de ouro com a amostra do grampo de livro de réplica dupla e deixe descongelar por vários segundos antes de abaixar suavemente o suporte sobre uma superfície de água em uma placa de análise. Manipule as réplicas usando um laço de fio fino ou uma grade convencional de cobre para microscopia eletrônica segurada por pinça de qualidade fina e transfira para outra placa de análise contendo dicromato de sódio 5% em ácido sulfúrico 50% por uma a várias horas. Este banho digere o material biológico real da réplica.

Quando a digestão estiver completa, transfira a réplica de volta para uma superfície limpa de água e recupere-a sobre uma grade padrão de cobre para microscopia eletrônica. Armazene as grades de suporte das réplicas em caixas de grades comercialmente disponíveis, onde permanecerão estáveis por anos. Com manuseio cuidadoso ou exame ultraestrutural de fraturas congeladas, réplicas por ataque químico, visualize as réplicas em um microscópio eletrônico de transmissão com uma tensão aceleradora, tipicamente entre 50 e 80 quilovolts.

Registre as imagens relevantes em filme padrão de MET ou com uma câmera digital de alta resolução localizada na membrana celular na base de cada eucarioto. Cílio e flagelo são uma matriz de partículas associadas à membrana organizadas em filamentos ENC que circundam o eixo do cílio e são conhecidos como colar ciliar. Matrizes especializadas de partículas da membrana aparecem no limite luminal de células epiteliais em processo de Clio Gênese.

Essas matrizes de partículas representam colares ciliares em formação, que se localizam na base de cílios emergentes e maduros. Diversos estudos de fratura por congelamento em epitélios revelam uma organização sofisticada de estruturas anastomosadas de cordões e sulcos que circundam a região apical dos limites basolaterais. A fratura através das membranas das células epiteliais revela faces de fratura plasmáticas das junções íntimas que aparecem como cordões, enquanto as faces de fratura extracelulares exibem sulcos complementares.

As junções comunicantes aparecem em preparações por fratura por congelamento de uma variedade de tecidos e são representadas por arranjos densos de partículas nas faces de fratura plasmática e por fossas complementares na fratura extracelular. As faces mostradas aqui como exemplo de congelamento rápido com ataque profundo e sombreamento rotativo. A célula epitelial foi fraturada através do citoplasma e uma face de fratura plasmática é evidente atrás das cabeças de seta, podendo ser observada.

Uma verdadeira superfície celular revelada por etching subsequente, uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada em um ciclo com duração aproximada de três horas, produzindo um a três espécimes, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as etapas individuais são muito interdependentes e que um erro em uma etapa pode tornar o resultado inadequado para exame e avaliação após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia celular e molecular explorarem como mutações genéticas conferem anomalias estruturais nas células, de maneiras que provocam condições patológicas e doenças.