Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

O objetivo geral deste protocolo é caracterizar os efeitos das proteínas do fluido seminal no comportamento de postura de ovos de uma espécie hermafrodita simultânea. Isso é feito primeiro isolando os indivíduos de uma cultura de laboratório padronizada, seguida pela dissecção dos órgãos-alvo. Em segundo lugar, os espermatozoides coletados e uma solução de tratamento é feita.

Depois disso, os caracóis são inseminados artificialmente. Em seguida, eles são colocados em um ensaio biográfico. Em condições padrão, as massas de ovos são coletadas, escaneadas e colocadas em BS individual para eclodir.

Após algumas semanas, os filhotes são contados e escaneados, após o que todas as fotos podem ser analisadas usando software livre. Este protocolo pode ajudar a responder a perguntas sobre processos de seleção sexual que são mediados por proteínas de fluido seminal. Como estamos aqui olhando para hermafroditas simultâneos, também podemos abordar se esses processos funcionam de maneira semelhante ou diferente em espécies sexuais separadas.

Para este protocolo, usamos o grande IL em les, que mantemos na VU University em Amsterdã. Usamos esta espécie para estudar questões sobre seleção e reprodução sexuada. Em hermafroditas, por causa de seu tamanho corporal relativamente grande, é experimentalmente muito acessível.

Além disso, por ser usado em muitas disciplinas biológicas diferentes como espécie modelo, sabemos muito sobre a biologia básica desses animais. Meu nome é Yumi. Sou doutor no Departamento de Ciências Ecológicas.

Na universidade plena, demonstrarei os seguintes protocolos. Vamos começar. Para realizar uma biosa confiável, uma cultura de laboratório é mais comumente usada para excluir variáveis ocultas.

A água com baixo teor de cobre é mantida a 20 graus Celsius e o ciclo claro e escuro é de 12 por 12 horas. Na Universidade VU, a cultura de laboratório é mantida em tanques de criadouro com troca contínua de água. Em condições padrão, os caracóis adultos são alimentados com alface na libido e separados de acordo com sua classe de idade.

Uma vez que os caracóis são removidos do criadouro, eles serão considerados em uso e não poderão ser devolvidos aos tanques de criação. Antes de iniciar o procedimento, você precisará de um microscópio estéreo, uma placa de dissecção com pinos, pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps, uma seringa cheia de solução de cloreto de magnésio e algumas toalhas de papel para sacrificar o caracol, penetrar no pé com a agulha de injeção em um ângulo de 45 graus e aplicar pressão suavemente continuamente até que o caracol relaxe e permaneça estendido. Remova a agulha de injeção e certifique-se de que o caracol seja sacrificado.

Em seguida, pegue a pinça e remova cuidadosamente a casca. Seguindo a curvatura até a metade, raspe suavemente o músculo ular da concha. Em seguida, gire suavemente o caracol para fora de sua concha seguindo a direção sinuosa da concha.

Agora o caracol foi removido de sua concha e a concha pode ser descartada. Em seguida, coloque o caracol na placa de dissecação e coloque um pino na extremidade posterior do pé. Em seguida, coloque um alfinete na cabeça.

Coloque um pouco de tensão no caracol e coloque o pino na placa. Agora o caracol está pronto para dissecação. Acenda a luz do microscópio estéreo e ajuste o microscópio.

Antes de fazer a primeira incisão, é importante Localize o po feminino. Este será mais tarde um ponto de referência. Faça uma primeira incisão logo abaixo da borda do manto E corte em direção ao Feminino por.

Faça uma volta ao redor do poro do bonno em direção à cabeça. Certifique-se de cortar apenas a pele e não atingir nenhum órgão e corte em linha reta. Para este estudo, vamos dissecar a próstata e as vesículas seminais para fluido seminal e esperma, respectivamente.

Observe que, para estoques completos de esperma e fluido seminal, os caracóis devem ser isolados por uma semana sendo alimentados ad libido. A dissecção é a mesma explicada anteriormente. As vesículas seminais estão localizadas na parte posterior do animal.

Em seguida, a próstata será suspensa em solução salina E colocado no gelo. Mais tarde. Estes serão misturados com as soluções de tratamento.

Antes da injeção intravaginal, o esperma coletado será adicionado ao fluido seminal ou proteínas individuais em uma dose relevante. Para esta técnica de inseminação artificial, Você precisará de uma seringa de um mililitro Contendo a solução de teste, coloque uma agulha de injeção nas seringas, certificando-se de que não haja bolhas presas nas seringas para injeção, use o tubo de silicone com cuidado. Deslize o tubo de silicone sobre a agulha de injeção.

Certifique-se de que o tubo esteja perfurado e remova o ar do tubo. Antes da injeção, o caracol deve ser sedado. Isso seguirá o mesmo protocolo do capítulo dois.

O caracol receberá uma dose de dois a três mililitros de 50 micro molares de cloreto de magnésio. Quando o caracol estiver devidamente sedado e relaxado, Deite-o no molde para mantê-lo em uma posição estável. Em seguida, pegue a extremidade do tubo de silicone com um par de pinças finas e empurre-o suavemente no porro feminino.

Em seguida, aplique pressão suavemente na seringa e injete cuidadosamente o volume prescrito da solução de teste. Aguarde meio minuto para que a pressão no tubo se espalhe para o órgão feminino. Depois disso, remova cuidadosamente o tubo e coloque o caracol em seu próprio recipiente específico.

Afinal, os caracóis foram inseminados artificialmente. Eles podem ser transportados para seus tanques experimentais e o bioensaio bios pode começar. Os caracóis se recuperarão da sedação Depois de algumas horas. Bioensaios.

Para seleção sexual, os experimentos normalmente levam duas semanas antes que a biosa possa ser iniciada. É importante colocar todos os indivíduos em seus próprios recipientes e rotulá-los. Em seguida, meça o comprimento da concha de cada caracol.

Este é um bom indicador de seu tamanho, que pode afetar o comportamento sexual. Depois disso, os caracóis são colocados em um tanque experimental. Este tanque tem as mesmas condições padrão que o criadouro.

Conforme discutido no capítulo um, é importante colocar os recipientes na orientação correta para que as aberturas sigam o fluxo de água no tanque. Durante os bioensaios, os caracóis devem ser alimentados regularmente. Uma quantidade padrão de discos de alface é cortada com um furador de metal.

Uma dosagem suficiente é de dois discos em dias alternados. Com a espécie modelo, lumia stauss, Os caracóis devem ser verificados quanto a massas de ovos a cada dois dias. Essas massas de ovos serão coletadas para medições.

Para a digitalização dos ovos, você precisará de um laptop contendo o driver do scanner, um scanner de mesa, uma escala milimétrica padrão, uma colher de transferência de massa de ovo e placas de vidro para colocar em cima das massas de ovos. Primeiro, pegue a colher e raspe as massas de ovos das paredes do recipiente. As massas de ovos opacas acabaram de ser postas e não podem ser usadas.

Neste evento de medição, coloque as massas de ovos nas placas de transferência e repita essas etapas até que as placas estejam cheias. Depois disso, coloque as massas de ovos nas telhas de vidro na mesma ordem das placas de transferência. As massas de ovos grudam no ladrilho de vidro, viram-no de cabeça para baixo e colocam-no cuidadosamente no scanner de mesa logo abaixo da balança.

Em seguida, aplique pressão nas placas para esmagar as massas de ovos. Isso ainda adicionará todos os ovos para que sejam digitalizados igualmente bem. Antes de digitalizar, é aconselhável ajustar as configurações para obter o melhor resultado.

Para digitalização, é importante ajustar a resolução ao máximo para fazer uma digitalização de visualização Para cortar posteriormente a área de trabalho e, finalmente, ajustar o brilho e o contraste antes de fazer a digitalização final. Após a digitalização, as massas de ovos serão colocadas em seus próprios frascos rotulados para amadurecer e eclodir. Esses frascos têm sua água refrescada a cada dois dias para manter o oxigênio em um nível adequado.

À medida que mais caracóis eclodem, diferentes técnicas devem ser usadas para refrescar a água. A melhor ordem é derramar ou transbordar no início e depois sugar a água com um programa de planilha JA de imagem aberta de pipeta. Para gravar os dados e uma foto da imagem J primeiro, use a ferramenta de zoom Para navegar até a escala milimétrica.

Aumente o zoom e ajuste a janela para que um milímetro preencha a tela. Desenhe uma linha usando a ferramenta de linha entre as duas linhas indicadoras. Em seguida, navegue até analisar e defina a escala.

No menu pop-up, você verá o ajuste do comprimento medido para um e a unidade de para milímetros. Marque a caixa global e feche a janela. Agora que a escala foi definida, podemos ampliar as primeiras massas de ovos Até 800%Use a ferramenta elíptica para desenhar a circunferência dos ovos.

Pressione D para desenhar a circunferência. Isso ajudará a evitar medir o mesmo ovo duas vezes. Pressione M para medir a circunferência.

Uma janela aparecerá depois que dados suficientes forem coletados. A janela de dados pode ser salva como um arquivo Excel. Os dados também podem ser copiados diretamente para uma planilha.

Se as medidas preferidas não aparecerem na janela pop-up, isso pode ser ajustado e analisado. Definir medidas, contar os ovos individuais por massas de ovos também pode ser feito com a ajuda do plugin do contador de células. Navegue até plug-ins.

Em seguida, analise e selecione o contador de células. A janela do contador de celular aparecerá. Marque a caixa manter original e pressione inicializar.

Uma nova janela de contador apareceu. Selecione a ferramenta cruzar aqui na barra de ferramentas. Em seguida, selecione um tipo de contador no menu do contador de células.

Ao clicar na janela do contador de células, os ovos serão contados. A contagem total pode ser encontrada ao lado do tipo de contador no menu do contador de células. Várias massas de ovos podem ser contadas com o contador de células.

Os tipos de contador podem ser adicionados e removidos, se desejado, Este número deve ser copiado manualmente para uma planilha ou pressionar os resultados, e uma janela aparecerá. Mostrando todos os resultados. Com este método, mostramos como coletar proteínas fluidas seminais, como testá-las de maneira significativa.

Mostramos isso usando o extrato completo da próstata, mas é claro que as proteínas individuais do fluido seminal podem ser testadas da mesma maneira. Além disso, é possível observar outros processos e postura de ovos. Os resultados de nossos experimentos mostraram que existe uma única proteína de fluido seminal chamada estatina avios que medeia uma redução na pista do ovo.

Além disso, descobrimos que a transferência de fluido seminal aumenta o tamanho ou os postes. A estatina é a primeira proteína fluida seminal totalmente caracterizada em um hermafrodita simultâneo. Embora os efeitos do fluido seminal tenham sido frequentemente relatados em espécies com sexos separados, nossos resultados destacam que os fluidos seminais são igualmente importantes em hermafroditas.