Name: Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: Aprenda a estudar os efeitos das proteínas do fluido seminal no comportamento de postura de ovos em Lymnaea stagnalis, um gastrópode hermafrodita. Este protocolo demonstra dissecação, inseminação artificial e bioensaio para investigar seleção sexual.

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Agradecemos MR Helmus para o voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg e C. Levesque para assistência técnica. Esta pesquisa é financiada pela Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO), a Academia Real Holandesa de Artes e Ciências (KNAW) ea Organização Student Services Japan (JASSO). Esta publicação foi apoiada por uma bolsa de Acesso Aberto de NWO para JMK.

1. Criatório <ol><li> Obter espécimes adultos de Lymnaea stagnalis (L.) a partir de uma cultura de laboratório como o da Universidade VU. </li><li> Manter a água baixo teor de cobre a 20 ° C, tanto no criatório (molluscarium) e tanques experimentais, que têm troca de água contínuo. </li><li> Definir o ciclo claro / escuro de 12 horas: 12 horas. </li><li> Para reprodução, alimentar os caramujos adultos sem pesticidas ad libitum alface, alimentar os jovens juvenis com TetraPhyll (alimentos peixes) flocos. Manter caramujos em tanques separados de acordo com sua idade, a partir de massas de ovos que são colocados dentro de um prazo de 24 horas. </li><li> Uma vez que os caracóis são removidas dos tanques de criação não são devolvidas, para evitar os efeitos de terem sido mantidos em condições ligeiramente diferentes, bem como para prevenir pseudoreplicação. </li></ol> 2. Dissecção <ol><li> Isolar os caracóis por 1 semana, e alimentá-los à vontade, para garantir that têm esperma completo e lojas fluido seminal. </li><li> Prepare um microscópio estéreo, uma placa de dissecação com pinos, pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps finos e grossos, uma seringa de 10 ml preenchida com uma solução de MgCl2 50 mM, agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm) e algumas toalhas de papel. </li><li> Eutanásia um caracol através da injeção de solução de MgCl2 (geralmente de 3 ml ou mais para caramujos adultos com um comprimento de concha de 31,6 ± 2,1 mm e peso úmido de 2,89 ± 0,55 g). Penetrar o pé com a agulha de injecção em um ângulo de 45 ° e injectar através da aplicação de uma pressão suave de forma contínua até o caracol relaxa e permanece estendida (em segundos). Retire a agulha de injeção e verifique se o caracol é sacrificado (por exemplo, verificar se o reflexo de retirada tentáculo está ausente). </li><li> Com cuidado, retire a casca após a sua curvatura, usando uma pinça grossa. No meio do caminho, retire delicadamente o músculo columela da concha, raspando com a pinça. Gire suavemente tele caracol fora de seu escudo, seguindo a direção do enrolamento da concha. </li><li> Coloque o caracol na placa de dissecação e de definir a extremidade traseira do pé. Em seguida, coloque um alfinete através da cabeça e coloque um pouco de tensão sobre o caracol para facilitar a dissecção. </li><li> Localize o gonóporo feminino, que irá, mais tarde, ser um ponto de referência para dissecção. </li><li> Usando a tesoura cirúrgica e uma pinça fina, fazer a primeira incisão, logo abaixo da borda do manto e cortou para o gonóporo feminino. Quando uma das lâminas das tesouras é empurrado para debaixo da parede do corpo, levante um pouco para garantir que apenas a parede do corpo, e nenhum dos órgãos internos, é cortado. Continue cortando acima da gonóporo para a cabeça e cortar em uma linha reta. </li><li> Localize a próstata (posterior) e vesículas seminais (anterior). Dissecar estes para fora com cuidado e mantê-los no gelo. Use-os para fazer as soluções de ensaio contendo fluido e / ou esperma seminal. Use fisiológico sal Lymnaeaina (5,83 mmol / L de CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L de MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L de NaCl, 37,53 mmol / L de KCl) como um meio de suporte. </li><li> Recolhe-se o fluido seminal que está presente no lúmen da glândula da próstata, bem como o esperma das vesículas seminais. Subsequentemente, suspende, tanto em solução salina, em frascos separados, expressando suavemente o seu conteúdo e removendo o tecido do órgão com uma pinça. Manter em gelo e usar o mesmo dia. Mais tarde, misturar estas suspensões para criar as diferentes soluções de tratamento. </li></ol> 3. Intravaginal Injeção <ol><li> Antes de iniciar o procedimento de injeção intravaginal, prepare um silício shell-molde (feito para caber a ponta do shell), seringas de 1 mm, 10-12 cm tubos de silicone com um diâmetro de 1 mm, embotada agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm ), fórceps grosseiras e da mesma seringa de 10 ml cheio com uma solução de 50 mM de MgCl 2 equipada com uma agulha de injecção afiada. </li><li> Recolhe-se o esperma, necessário adicionar ao líquido seminal (ou proteínas de fluidos seminais individuais) em alguns tratamentos; uma dose biologicamente relevante é igual a 1/3 de uma glândula da próstata e vesícula seminal por injecção. NOTA: Na seção representante resultados (Figura 1) os resultados de um experimento com três tratamentos diferentes são mostrados: controle (meio transportador, ou seja, solução salina), Ovipostatin (uma das proteínas do líquido seminal identificados) sozinho e Ovipostatin acompanhado com esperma. Além disso, para calcular a dose biologicamente relevante em outras espécies, determinar a diferença no peso da glândula da próstata de indivíduos que foram recentemente acasaladas e indivíduos que permaneceram sexualmente isolado 16. </li><li> Prepare seringas de 1 ml para cada uma das soluções de teste preparadas. Encha cada seringa com uma solução e garantir que não há bolhas de ar no interior. </li><li> Coloque uma agulha de injeção embotada em cada seringa. </li><li> Para injecção utilizar um 1tubo de silicone mm de diâmetro, com um comprimento mínimo de 10 cm. </li><li> Deslize cuidadosamente o tubo de silicone ao longo da agulha de injecção, tendo cuidado para não furar o tubo e remover o ar a partir do tubo, aplicando suavemente a pressão no êmbolo da seringa. </li><li> Anestesiar um caracol, seguindo o mesmo protocolo que no ponto 2.3. Desta vez, certifique-se não injetar mais de 2-3 ml de 50 mM de MgCl2. </li><li> Coloque o caracol no shell-mold para mantê-lo em uma posição estável. </li><li> Localize o gonóporo feminina, que é claramente visível como uma mancha branca no lado direito do animal, anterior ao tentáculo direito e gonóporo masculino (este local também se aplica a outras espécies de caramujos de água doce). Certifique-se de ter acesso livre. </li><li> Use uma pinça de segurar a extremidade do tubo de silicone e suavemente inserir cerca de 2-4 mm do tubo de silicone para o gonóporo fêmea. </li><li> Cuidadosamente aplicar pressão para a seringa e injectar 0,03 ml da solução de teste. Espere meia minute para permitir que a pressão no tubo para se propagar no tracto fêmea antes da remoção do tubo. </li><li> Devolver o caracol tratada para o seu recipiente de isolamento, em que ele pode ser monitorizada, e permitir a recuperação a partir de sedação no tanque experimental. </li></ol> 4. Bioensaio <ol><li> Identifique cada caracol para a identificação e medir o seu comprimento de concha. Este último é um bom indicador do tamanho, o que é relevante ao quantificar a produção de descendência. </li><li> Mantenha cada caracol isolado em um recipiente de 460 ml que é perfurado para permitir a troca de água dentro do tanque experimental. É importante colocar todos os recipientes na orientação correcta, com as perfurações na direcção do fluxo de água, para permitir a troca de água eficiente. </li><li> Durante o ensaio biológico, alimentar os caracóis regularmente com uma quantidade padronizada de alface. Use uma rodada, perfurador de metal para cortar alface. Neste protocolo são usados ​​discos de alface de 19,6 cm 2, que se aproxima a umamontar eles máximo pode comer em um dia. </li><li> Coletar uma massa de ovos usando o lado liso de uma espátula e raspe a massa de ovos da parede do recipiente. Use o lado da colher para recolher a massa de ovos. NOTA: massas de ovos opacas que acabam de ser definidos não pode ser usado para a digitalização (que se tornem transparentes dentro de algumas horas após a postura). Para as espécies modelo neste protocolo, stagnalis Lymnaea, verifique se há massas de ovos todos os dias, uma vez que produzem 2-3 massas de ovos por semana. Isto pode variar em outras espécies. </li><li> Digitalize as massas de ovos coletadas digitalmente, utilizando um (laptop) computador que contém o driver do scanner, um scanner de mesa, uma escala de milímetros standard, uma espátula, transferir placas e telhas de vidro. </li><li> Coloque cada massa de ovos sobre as placas de transferência e repetir até que as placas estão cheios. Posteriormente, dab as massas de ovos secar em papel toalha e transferi-los para as telhas de vidro na mesma ordem como nas placas de transferência. </li><li> Vire cada telha de cabeça para baixo (omassas de ovos vai ficar com a telha de vidro) e colocá-lo cuidadosamente no scanner de mesa, logo abaixo da escala milimétrica. Aplique um pouco de pressão para achatar as massas de ovos, que irá distribuir os ovos uniformemente para todos eles são visíveis dentro do mesmo plano de foco. Coloque os azulejos com uma quantidade padronizada de fita em torno de dois gumes para assegurar que todos os ovos são achatados de forma igual. </li><li> Ajuste as configurações do scanner. É importante para ajustar a resolução para o máximo, fazer uma digitalização de visualização, corte a área de trabalho, e ajustar o brilho eo contraste. Digitalize as massas de ovos. </li><li> Coloque cada massa de ovos em seu próprio rotulado frasco de vidro de 20 ml para o desenvolvimento e eclosão. </li><li> Atualize a água em frascos de incubação todos os dias para mantê-lo devidamente oxigenado. Faça isso de acordo com números hatchling e tamanho, na seguinte ordem: decantação / escorrendo (sem filhotes), transbordando (início da incubação), e extrair a água com uma pipeta (muitos filhotes). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Medição e Contagem Eggs <ol><li> Instale o software de análise de imagens ImageJ livremente disponível (NIH, EUA) eo contador de células plugin. </li><li> Abrir ImageJ, bem como um programa de folha de cálculo para transferir os dados. Em seguida, abra a imagem digitalizada de massas de ovos em ImageJ. </li><li> Defina a escala usando a ferramenta de zoom para navegar até a escala milimétrica. Zoom e ajustar a janela de um milímetro para encher a tela. Desenhar uma linha usando a ferramenta de linha entre as duas linhas que indicam um milímetro. Navegue para Analisar e Definir escala. No menu pop-up a opção comprimento medido torna-se visível, ajuste a distância conhecida a 1 ea unidade de comprimento para mm. Marque a caixa Global, e fechar a janela. </li><li> Defina as medidas preferenciais (comprimento, largura, circunferência), navegando para Analisar e definir medidas a seleção de Área e Diâmetro de Feret (comprimento e largura). Clique em OK para confirmar e continuar com a análise da imagem. </li><li> Para medir os ovos, zoom em em um ovo da primeira massa de ovos que precisa ser medido. Recomenda-se um zoom de 800%. Em seguida, usando a ferramenta elíptica desenhar um oval exatamente em torno do ovo, pressione Ctrl + D para desenhar a circunferência na imagem (para evitar que a medição do mesmo ovo duas vezes). Em seguida, pressione Ctrl + M para gravar a medida das propriedades do oval (comprimento, largura, circunferência); uma tela pop-up é aberto exibindo as medições. NOTA: O uso da ferramenta elíptica para medir os ovos não se aplica a todas as espécies. Para as espécies com ovos em forma de maneira não uniforme, use as seleções à mão livre em seu lugar. </li><li> Meça quantos ovos necessários e, em seguida, salvar as medidas planilha xls.. Opcionalmente, copiar os dados diretamente em uma planilha. </li><li> Posteriormente contar os ovos dentro de uma massa de ovos, usando a janela do balcão e colocou a contagem manualmente na planilha. </li><li> Alternativamente, contar os ovos individuais por massa de ovos, com a ajuda da célula contra plug-in. Para isso, vá até Plug-ins,em seguida, analisar e selecionar Contador de células. A janela de contador de células irá aparecer, marque a opção &quot;manter original&quot; caixa e pressione &#39;inicializar&#39;. Uma nova janela do contador aparece, selecione a ferramenta mira da barra de ferramentas e selecione um tipo de contador no menu contador de células. Conte os ovos individuais clicando nos ovos individuais na janela do contador de células. Observe a contagem total ao lado do tipo de contador no menu contador de células. Copie esse número manualmente para uma folha de cálculo ou obter os resultados pressionando Resultados. </li><li> Contagem múltiplas massas de ovos dentro de um evento de contagem, adicionando tipos de contador, se necessário. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado mostra como coletar fluido seminal e como testar isso de uma forma biologicamente significativa. Embora este procedimento aqui é mostrada utilizando o extracto da glândula da próstata, o efeito de uma única proteína do fluido seminal purificado também podem ser testados seguindo o mesmo procedimento. Obviamente, em tais testes é sempre crucial incluir controlos adequados (tratamentos simulados) para assegurar que o processo e / ou o material de suporte não afecta os parâmetros de perguntas 14,16. Usando este método, que já foi demonstrado que existe uma única proteína de fluido seminal, nomeadamente Ovipostatin, que medeia uma redução na postura dos ovos, 14,16. Esta proteína, produzida na glândula da próstata e transferida durante o acasalamento, juntamente com os espermatozóides, representa o primeiro componente de fluido seminal totalmente caracterizados em hermafrodita simultânea e que, até agora, não mostra qualquer semelhança com as proteínas conhecidas. A constatação de que Ovipostalata reduz a produção de massa de ovos no recipiente corrobora trabalhos anteriores, indicando que as substâncias no sêmen pode influenciar oviposição 13-15. Ao transferir quantidades biologicamente relevantes (ver 3.2 16), pode-se convincentemente demonstrar que é uma proteína de fluido seminal, e não a presença de espermatozóides si, que medeia a redução observada na postura de ovos (Figura 1). Tendo em conta que o recebimento repetido de fluido seminal através de cruzamentos naturais aumenta o investimento por ovo 15, torna-se altamente relevante para quantificar outros parâmetros de postura de ovos. O protocolo apresentado agora fornece os métodos necessários para fazê-lo. Embora nenhum efeito foi encontrado de Ovipostatin sobre o sucesso de eclosão dos ovos postos por o recipiente 16, pode haver outras proteínas do líquido seminal que agem em conjunto com essa proteína. Por isso, os parâmetros que precisam ser quantificados neste contexto - ao lado, que os números de freqüência e de ovos - incluem o tamanho do ovo, hatctempo hing, desenvolvimento e tamanho hatchling hatchling. Além disso, é possível olhar para efeitos sobre outros processos sexo feminino do que a postura de ovos, como o armazenamento de esperma eo uso, bem como a alocação de recursos para a função reprodutiva feminina e masculina 14,17. Claramente, o método apresentado é fundamental para abordar estas questões de seguimento, tanto em Lymnaea stagnalis e em outros caramujos de água doce. Em suma, os experimentos que utilizam este protocolo mostram que transferidos proteínas do líquido seminal afetam o desempenho reprodutivo feminino do destinatário nestes hermafroditas simultâneos. Dado que poucos estudos têm abordado este, é provável que seja muito mais comum em fertilizar internamente hermafroditas que se reflete atualmente na literatura científica. Especialmente quando se percebe que a escolha do companheiro de pré-cópula e competição do esperma foram mostrados a desempenhar um papel importante nestes hermafroditas 14, que highlights o potencial de tais proteínas da glândula acessória masculina de ser sexualmente seleccionado neste sistema. Finalmente, a pesquisa ajuda a apoiar a noção de desenvolvimento que as proteínas do líquido seminal são de igual importância para hermafroditas simultâneos como eles são para espécies separadas-sexuado.

Após a transferência, os espermatozóides são geralmente acompanhadas de líquido seminal produzido por glândulas acessórias masculinas. Enquanto alguns componentes ejaculação desempenham papéis em nutrir e ativar um esperma, outros influenciam a fisiologia feminina, a fim de aumentar o sucesso de fertilização do doador de esperma 2-4. Tais efeitos são especialmente selecionados para, através da seleção sexual, quando uma espécie é altamente promíscuo e tem capacidade de armazenamento de espermatozóides e eficiente digestão de esperma. Sob tais condições, os dadores de esperma competem fortemente para a fertilização de ovos 5. Embora não haja evidência correlacional abundante para a importância de substâncias do líquido seminal para o sucesso de fertilização masculino, prova direta é mais rara e poucos estudos investigou os detalhes da mudança fisiológica e / ou substâncias envolvidas 6. Nas espécies com sexos separados (ou seja, machos e fêmeas; gonochorists) há um modelo de poucos especi bem investigadoes quando se trata de composição de fluido seminal e os seus efeitos. Exemplos incluem a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, o mosquito da malária, o Anopheles gambiae 7, eo besouro de farinha vermelho, Tribolium castaneum 8. Tais estudos fluidos seminais são muito mais raros quando se trata de espécies que são, simultaneamente, hermafrodita (ou seja, os indivíduos são funcionalmente macho e fêmea ao mesmo tempo), mesmo que este modo de reprodução é comum em todo o reino animal 9. O exemplo mais notável hermafrodita da transferência de uma substância glândula acessória é, provavelmente, o tiroteio dos chamados dardos de amor em caracóis terrestres 2,10, onde a substância é transferido pelo doador de esperma através de injeção hipodérmica 11,12, ou seja, não juntamente com os espermatozóides. Mas há muitos hermafroditas simultâneos que transferem produtos glândula acessória masculina junto com seu esperma,como as espécies modelo usados ​​aqui, a grande lagoa caracol Lymnaea stagnalis. Pesquisa anterior já demonstrado que a recepção do fluido seminal influencia a produção de descendência feminina desta espécie 13-15, e várias das proteínas dos fluidos seminais envolvidos foram identificados 16,17. O objetivo geral deste protocolo, que é uma extensão dos métodos relatados em Koene et al 16, é testar os efeitos das proteínas do líquido seminal em vários parâmetros de postura de ovos em moluscos gastrópodes. Isto é conseguido por meio de dissecção da glândula da próstata (isto é, a glândula acessória masculina que produz o fluido seminal) de caracóis doadores sexualmente isolados a partir de uma cultura de laboratório padronizado. Em segundo lugar, o esperma do doador é coletado a partir das vesículas seminais e soluções de tratamento diferentes são feitas. Subsequentemente, os caracóis do teste são anestesiados e injectados por via intravaginal com uma solução de teste (por exemplo,extrato de próstata glândula sozinho, extrato de glândula da próstata com o esperma, esperma sozinho, meio transportador sozinho). Estes moluscos de teste são então monitorizados durante os dias seguintes, a semanas, sob condições padrão, para gravar a postura de ovos. Massas de ovos são coletados, digitalizados para a contagem e medição de vários parâmetros, e em seguida, colocar em frascos individuais para incubação. Após cerca de duas semanas, os filhotes são contados e digitalizados. Todos os exames, de ambos massas de ovos e filhotes, são então analisados ​​por meio de um pacote de software de análise de imagem livremente disponível. Para este protocolo a cepa de laboratório do grande caracol lagoa, stagnalis Lymnaea, é usado, que é produzido na Universidade VU de Amsterdã. Esta espécie serve como um sistema modelo para investigar perguntas sobre seleção sexual e reprodução em hermafroditas. Relativamente grande tamanho do animal faz com que seja muito acessível experimentalmente. Além disso, uma vez que é usado como uma espécie de modelo em muitos bdisciplinas iological já sabemos muito sobre a biologia básica destes animais. Este método vai ajudar a estudar questões sobre processos de seleção sexual que são mediadas através de proteínas do líquido seminal em geral. Além disso, porque estes são hermafroditas simultâneos, é possível tratar se estas proteínas actuam em formas semelhantes e / ou diferentes, como o fazem na espécie em que os sexos são separados 16,17.

<table><tbody><tr><td>Flocos de comida para peixe</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>estéreo</tr><tr><td>Tesoura cirúrgica pequena</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças grossas e finas</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td></td><td></td><td></td>de 10 ml</tr><tr><td>Agulhas de injeção (0,3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5,83 mmol/L CaCl2&#183; 2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,76 mmol/L MgCl2&#183; 6H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42,69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37,53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silício de dois componentes</td><td>Seringas</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>1 mm</td></tr><tr><td>Tubo de silicone (diâmetro 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de injeção embotadas (0,3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml recipientes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>perfurados Perfurador de folha de metal (19,6 cm2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espátula/colher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td></td><td></td><td></td>de mesa</tr><tr><td>Escala</td> <td>milimétrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td><td></td>de transferência</tr><tr><td>Ladrilhos</td><td></td><td></td><td></td>de vidro</tr><tr><td>Frascos de</td><td></td><td></td><td></td> vidro de 20 ml</tr></tbody></table>

efeito do masculino acessório gland produtos em postura de ovos em gastrópode

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

Na adubação internamente animais, o fluido seminal é geralmente adicionado para os espermatozóides, que formam o sêmen ou ejaculação. Além esperma nutritivo e activação, os componentes no fluido seminal, também pode influenciar a fisiologia feminina para aumentar o sucesso de fertilização do esperma de um doador. Enquanto muitos estudos têm relatado tais efeitos em espécies com sexos separados, poucos estudos têm abordado este em animais simultaneamente hermafroditas. Este protocolo de vídeo apresenta um método para estudar os efeitos do fluido seminal em gastrópodes, usando um caramujo de água doce, simultaneamente, hermafrodita, o grande caracol lagoa stagnalis Lymnaea, como organismo modelo. Enquanto que o procedimento é mostrado utilizando extractos completos de glândula da próstata, os componentes individuais (isto é, proteínas, peptídeos e outros compostos) do fluido seminal pode ser testada do mesmo modo. Efeitos do recebimento dos componentes do ejaculado sobre a postura de ovos pode ser quantificado em termos de frequência de postura de ovos eestimativas mais sutis de desempenho reprodutivo feminino, tais como números de ovos dentro de cada ovo massas. Os resultados mostram que as proteínas do líquido seminal afetar reprodutivo das fêmeas neste hermafrodita simultâneo, destacando sua importância para a seleção sexual.

A Figura 1 mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al 16 para obter mais detalhes e estatísticas (Fonte: Figura 3 a partir de 2010 Koene et al, PLoS ONE.).. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Efeito de Ovipostatin na produção em massa de ovo de Lymnaea stagnalis. O gráfico mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al. 2,010 detalhes e estatísticas. Reimpressão com permissão de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

Este protocolo de vídeo demonstra um método para estudar os efeitos do fluido seminal em gastrópodes, usando o caracol hermafrodita de água doce Lymnaea stagnalis.

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

O objetivo geral deste protocolo é caracterizar os efeitos de proteínas do fluido seminal no comportamento de postura de ovos de uma espécie hermafrodita simultânea. Isso é realizado primeiramente isolando indivíduos de um cultivo laboratorial padronizado, seguido pela dissecação dos órgãos-alvo. Em segundo lugar, os espermatozoides são coletados e uma solução de tratamento é preparada.Após isso, os caramujos são inseminados artificialmente. Em seguida, são colocados em um bioensaio. Em condições padrão, as massas de ovos são coletadas, escaneadas e colocadas individualmente em BS para eclosão.Após algumas semanas, as crias são contadas e digitalizadas, após o que todas as imagens podem ser analisadas usando software gratuito. Este protocolo pode ajudar a responder perguntas sobre processos de seleção sexual mediados por proteínas do fluido seminal. Como estamos analisando heremafroditas simultâneos, também podemos investigar se esses processos funcionam de maneira semelhante ou diferente àquela observada em espécies de sexos separados.Para este protocolo, utilizamos o grande IL em les, que mantemos na Universidade VU em Amsterdã. Utilizamos esta espécie para estudar questões sobre seleção sexual e reprodução. Em Hermaphrodites, devido ao seu tamanho corporal relativamente grande, é experimentalmente muito acessível.Além disso, como é utilizada em muitas disciplinas biológicas diferentes como espécie modelo, sabemos muito sobre a biologia básica desses animais. Meu nome é Yumi. Sou doutora no Departamento de Ciências Ecológicas.Na universidade completa, demonstrarei os seguintes protocolos. Vamos começar. Para realizar uma biosa confiável, um cultivo laboratorial é o mais comumente utilizado para excluir variáveis ocultas.Água com baixo teor de cobre é mantida a 20 graus Celsius, e o ciclo claro-escuro é de 12 por 12 horas. Na Universidade VU, o cultivo laboratorial é mantido em tanques de reprodução com troca contínua de água. Em condições padrão, caracóis adultos são alimentados com alface ad libitum e separados de acordo com sua classe etária.Uma vez removidos da instalação de criação, os caramujos serão considerados em uso e não poderão ser devolvidos aos tanques de criação. Antes de iniciar o procedimento, você precisará de um microscópio estereoscópico, uma placa de dissecação com pinos, tesoura cirúrgica pequena, pinça, uma seringa contendo solução de cloreto de magnésio e algumas toalhas de papel. Para eutanizar o caramujo, introduza a agulha de injeção no pé em um ângulo de 45 graus e aplique pressão suavemente e continuamente até que o caramujo relaxe e permaneça estendido. Remova a agulha de injeção e certifique-se de que o caramujo foi eutanaziado.Em seguida, pegue a pinça e remova cuidadosamente a concha. Seguindo a curvatura, raspe suavemente o músculo pélvico da concha até a metade. Em seguida, gire suavemente o caracol para fora de sua concha, seguindo a direção espiral da concha.Agora o caracol foi removido de sua concha e a concha pode ser descartada. Em seguida, coloque o caracol na placa de dissecação e fixe um alfinete na extremidade posterior do pé. Depois, insira um alfinete pela cabeça.Aplicar alguma tensão sobre o caracol e fixar o alfinete na placa. Agora o caracol está pronto para a dissecação. Ligar a luz do microscópio estereoscópico e ajustar o microscópio.Antes de fazer a primeira incisão, é importante localizar o poro feminino. Este será posteriormente um ponto de referência. Faça uma primeira incisão logo abaixo da borda da manta e corte em direção ao poro feminino.Dê uma volta ao redor do poro bonno em direção à cabeça. Certifique-se de cortar apenas a pele e de não atingir nenhum órgão, fazendo um corte em linha reta. Para este estudo, vamos dissecar a glândula prostática e as vesículas seminais para obter, respectivamente, o fluido seminal e os espermatozoides.Observe que, para obter reservas completas de espermatozoides e fluido seminal, os caramujos devem ser isolados por uma semana e alimentados ad libitum. A dissecação é a mesma previamente descrita. Os vesículos seminais localizam-se na região posterior do animal.Em seguida, a glândula prostática será suspensa em solução salina e colocada sobre gelo. Posteriormente, serão misturadas com as soluções de tratamento.Antes da injeção intravaginal, os espermatozoides coletados serão adicionados ao fluido seminal ou a proteínas individuais em uma dose relevante. Para esta técnica de inseminação artificial, você precisará de uma seringa de um mililitro contendo a solução teste, com uma agulha de injeção adaptada à seringa, certificando-se de que não haja bolhas de ar presas na seringa. Para a injeção, use o tubo de silicone com cuidado. Deslize o tubo de silicone sobre a agulha de injeção.Certifique-se de que o tubo está perfurado e remova o ar do tubo. Antes da injeção, o caracol deve ser sedado. Isso seguirá o mesmo protocolo descrito no capítulo dois.O caracol receberá uma dose de dois a três mililitros de 50 micromolares de cloreto de magnésio. Quando o caracol estiver adequadamente sedado e relaxado, coloque-o no molde para mantê-lo em uma posição estável. Em seguida, segure a extremidade do tubo de silicone com uma pinça fina e empurre-o suavemente para dentro do poro feminino.Em seguida, aplique suavemente pressão à seringa e injete cuidadosamente o volume prescrito da solução-teste. Aguarde meio minuto para que a pressão no tubo se espalhe pelo órgão feminino. Após isso, remova cuidadosamente o tubo e coloque o caracol em seu recipiente específico.Afinal, os caracóis foram artificialmente inseminados. Eles podem ser transportados para seus tanques experimentais e o bioensaio pode começar. Os caracóis se recuperarão da sedação após algumas horas. Bioensaios.Para seleção sexual, os experimentos normalmente levam duas semanas antes de a biossa poder ser iniciada. É importante colocar todos os indivíduos em recipientes separados e rotulá-los. Em seguida, meça o comprimento da concha de cada caramujo.Este é um bom indicador do tamanho deles, o que pode influenciar o comportamento sexual. Após isso, os caracóis são colocados em um tanque experimental. Esse tanque possui as mesmas condições padrão da instalação de reprodução.Como discutido no capítulo um, é importante posicionar os recipientes na orientação correta para que as aberturas sigam o fluxo de água no tanque. Durante os bioensaios, os caramujos devem ser alimentados regularmente. Uma quantidade padrão de discos de alface é cortada com um furador metálico.Uma dose suficiente é de dois discos a cada dois dias. Com a espécie modelo, lumia stauss, os caramujos devem ser verificados quanto a massas de ovos a cada dois dias. Essas massas de ovos serão coletadas para medições.Para a digitalização dos ovos, você precisará de um laptop contendo o driver do scanner, um scanner de mesa, uma escala padrão em milímetros, uma colher para transferir massas de ovos e placas de vidro para colocar sobre as massas de ovos. Primeiro, pegue a colher e raspe as massas de ovos das paredes do recipiente. Massas de ovos opacas foram recém-postas e não podem ser utilizadas.Neste evento de medição, coloque as massas de ovos nas placas de transferência e repita esses passos até que as placas estejam cheias. Após isso, coloque as massas de ovos nos ladrilhos de vidro na mesma ordem das placas de transferência. As massas de ovos aderirão ao ladrilho de vidro; vire-o com a face para baixo e coloque-o cuidadosamente sobre o scanner de mesa logo abaixo da escala.Em seguida, aplique pressão sobre as placas para esmagar as massas de ovos. Isso fará com que todos os ovos fiquem expostos igualmente, permitindo que sejam escaneados com a mesma eficiência. Antes da digitalização, recomenda-se ajustar as configurações para obter o melhor resultado.Para a digitalização, é importante ajustar a resolução ao seu valor máximo para realizar uma varredura de pré-visualização, para posteriormente recortar a área de trabalho e, finalmente, ajustar o brilho e o contraste antes de realizar a varredura final. Após a digitalização, as massas de ovos serão colocadas em seus próprios frascos identificados para amadurecerem e eclodirem. Esses frascos têm a água renovada a cada dois dias para manter o oxigênio em nível adequado.À medida que mais caramujos eclodem, diferentes técnicas devem ser usadas para renovar a água. A melhor ordem é despejar ou transbordar inicialmente e, posteriormente, aspirar a água com uma pipeta. Abra uma imagem no programa de planilha eletrônica para registrar os dados e uma foto a partir do ImageJ. Primeiro, use a ferramenta de zoom para navegar até a escala de milímetros.Aproxime a imagem e ajuste a janela para que um milímetro preencha a tela. Desenhe uma linha usando a ferramenta de linha entre as duas linhas indicadoras. Em seguida, navegue até analisar e depois defina a escala.No menu pop-up, você verá o comprimento medido ajustar a distância conhecida para um e a unidade para milímetros. Marque a caixa global e feche a janela. Agora que a escala foi definida, podemos ampliar em direção aos primeiros grupos de ovos até 800%. Use a ferramenta elíptica para desenhar a circunferência dos ovos.Pressione D para desenhar a circunferência. Isso ajudará a evitar medir o mesmo ovo duas vezes. Pressione M para medir a circunferência.Uma janela aparecerá após a coleta de dados suficientes. A janela de dados pode ser salva como um arquivo do Excel. Os dados também podem ser copiados diretamente para uma planilha.Se as medições preferidas não forem exibidas na janela pop-up, isso pode ser ajustado e analisado. As medições podem ser definidas, e a contagem dos ovos individuais por massas de ovos também pode ser realizada com a ajuda do plugin contador de células. Navegue até plugins.Em seguida, analise e selecione o contador de células. A janela do contador de células será exibida. Marque a caixa "manter original" e pressione inicializar.Uma nova janela de contagem apareceu. Selecione a ferramenta de cruz aqui na barra de ferramentas. Em seguida, selecione um tipo de contagem no menu do contador de células.Ao clicar na janela do contador de células, os ovos serão contados. A contagem total pode ser encontrada ao lado do tipo de contador no menu do contador de células. Várias massas de ovos podem ser contadas com o contador de células.Os tipos de contadores podem ser adicionados e removidos, se desejado. Esse número deve ser copiado manualmente para uma planilha ou pressionar os resultados, e uma janela será exibida, mostrando todos os resultados. Com este método, demonstramos como coletar proteínas do fluido seminal e como testá-las de maneira significativa.Mostramos isso usando o extrato completo da glândula prostática, mas, é claro, as proteínas individuais do fluido seminal podem ser testadas da mesma maneira. Além disso, é possível analisar outros processos e a postura de ovos. Os resultados de nossos experimentos mostraram que existe uma única proteína do fluido seminal chamada avios statin que media uma redução na postura de ovos.Além disso, observamos que a transferência do fluido seminal aumenta o tamanho ou os pós. A statina é a primeira proteína do fluido seminal totalmente caracterizada em um hermafrodita simultâneo. Embora os efeitos do fluido seminal frequentemente tenham sido relatados em espécies com sexos separados, nossos resultados destacam que os fluidos seminais são igualmente importantes em hermafroditas.

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Research

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Biology

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