Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar os efeitos mediados pelo receptor GABA B em neurônios inter positivos para parvalbumina hipocampal identificados. Isso é feito produzindo primeiro fatias agudas de hipocampo de alta qualidade. O segundo passo é usar um microscópio de vídeo para selecionar neurônios com base na expressão venosa de YFP e características conhecidas de neurônios positivos para albumina paral.

Em seguida, são obtidas gravações de patch clamp de células inteiras e a estimulação extracelular ou gravações pareadas são usadas para examinar os efeitos mediados pelo receptor GABA B. A etapa final é visualizar os neurônios e confirmar que os neurônios registrados são de fato positivos para paralbumina e são neurônios inibitórios parassomáticos ou dendríticos. Em última análise, este método permite a caracterização dos efeitos inibitórios mediados pelo receptor GABA B e permite a classificação inequívoca dos interneurônios registrados.

Este método pode responder a perguntas-chave no campo interneurônio. Por exemplo, como os interneurônios se comunicam entre si, como sua excitabilidade, sua saída sináptica é controlada por sistemas neuromoduladores. Embora esse método forneça informações sobre o GABAérgico, controle do hipocampo em neurônios, ele também pode ser aplicado a outras regiões do cérebro, sistemas neuromoduladores ou tipos de células.

Pegue o cérebro de um rato transgênico de 17 a 24 dias expressando YFP venoso fluorescente mantido em sacarose carbogênica semicongelada, um LCR usando um bisturi, remova o terço frontal do córtex, o cerebelo e separe os hemisférios. Remova a superfície dorsal do córtex para fornecer uma superfície plana para colar o cérebro para seccionamento. Cole os hemisférios no estágio de vioma com o banho de viome preenchido com sacarose nativa de carbogênio rozen.

Um LCR cortou fatias transversais de 300 micrômetros da formação hipocampal. Transfira cada fatia para uma câmara de retenção submersa contendo carbogênio sacarose, A CSF a 35 graus Celsius. 30 minutos Depois de colocar a última fatia na sacarose aquecida, um LCR transfere as fatias para a temperatura ambiente para armazenamento.

Puxe pipetas de remendo dos capilares de vidro para que uma resistência da pipeta de dois a quatro mega ohms seja alcançada. Quando cheio, transfira uma fatia do hipocampo para a câmara de gravação, segurando-a no lugar com um anel de platina amarrado com fibras simples de seda. Coloque a câmara na configuração de gravação e inicie a perfusão com um LCR de gravação A aquecido por carbógeno a uma taxa de fluxo de cinco a 10 mililitros por minuto.

Use uma câmera de vídeo para avaliar a qualidade do corte sob óptica IRDIC com ampliação objetiva de 40x. Suponha que a fatia seja de boa qualidade. Se um grande número de células parametálicas redondas moderadamente contrastadas pode ser visto no parâmetro de estrato em profundidades de 20 a 30 micrômetros abaixo de uma superfície lisa e levemente craterada.

Usando iluminação epifluorescente, identifique os neurônios inter de pico rápido putativo como aqueles que expressam YFP venoso com grande somático multipolar dentro ou próximo ao parama do estrato. Em seguida, encha as pipetas de adesivo com uma solução contendo uma concentração de cloreto baixa e fisiologicamente relevante para identificação de correntes pós-sinápticas e coloque-a no porta-pipetas no estágio principal. Em seguida, aplique uma pressão positiva baixa através da linha do tubo.

Abaixe a pipeta até a superfície da fatia, ligeiramente deslocada para o centro do neurônio selecionado. Aumente a pressão para 70 a 80 milibares e abaixe rapidamente a pipeta através da fatia até um pouco acima do soma da célula selecionada. Pressione a pipeta contra a membrana celular para produzir uma covinha nela.

Execute esta etapa rapidamente. Para evitar a marcação de biotina de células vizinhas, crie uma vedação de giga ohm liberando a pressão e aplicando simultaneamente um comando de tensão negativa de 20 milivolts à pipeta. Assim que a vedação começar, reduza o comando de tensão para o potencial de membrana em repouso esperado, normalmente entre 70 e 60 milivolts negativos.

Agora aplique um pulso curto de pressão negativa para romper o adesivo de membrana, alcançando assim toda a configuração da célula. Usando o modo de pinça de corrente, identifique neurônios inter de pico rápido por sua resposta a uma família de pulsos de corrente hiperpolarizantes a despolarizantes. Para observar as respostas evocadas sinapticamente, posicione um eletrodo de estimulação extracelular na fatia na borda do estrato rádio e do registro molecular do estrato laun oum.

No modo de grampo de tensão, use um estimulador de tensão constante isolado para fornecer trens de um ou 200 hertz de cinco estímulos elétricos de 50 volts aos axônios pré-sinápticos a cada 20 segundos. Em seguida, aplique antagonistas do receptor de glutamato ionotrópico ao banho para revelar os monos isolados. IPSC sináptico.

Isole ainda mais o IPSC mediado pelo receptor GABA B com a aplicação de um antagonista do receptor GABA a. Para iniciar gravações emparelhadas. Primeiro, estabeleça um registro de células inteiras de um interneurônio pré-sináptico como antes e confirme o fenótipo de pico rápido.

Em seguida, remende uma célula parametálica CA one a uma distância de 20 a 100 micrômetros do interneurônio que contém o interneurônio pré-sináptico. No modo de pinça de corrente. Aplique breves pulsos de corrente despolarizante de limiar SRA para eliciar potenciais de ação no interneurônio.

Se uma conexão sináptica estiver presente, os potenciais de ação no interneurônio resultam em IPCs na voltagem presa em uma célula parametálica. Uma vez que uma conexão é estabelecida, elimine pares de potenciais de ação no interneurônio pré-sináptico de pico rápido com um protocolo de pulso emparelhado típico de dois estímulos despolarizantes com um intervalo de 50 milissegundos. Depois de coletar os traços de controle, aplique o baclofeno agonista seletivo do receptor GABA B no LCR A perfundido, ativando assim os receptores GABA B.

Em seguida, aplique o antagonista CGP 55 8 45 para bloquear totalmente os efeitos mediados pelo receptor. Quando a gravação estiver concluída, retire lentamente a pipeta do corpo da célula em voltage clamp. À medida que a resistência medida em série aumenta, reduza a tensão da membrana para 40 milivolts negativos para selar a membrana somática formando um remendo de fora para fora.

Após as gravações, fixe as fatias por imersão em formaldeído a 4% com tampão fosfato molar 0,1 durante a noite a quatro graus Celsius lavando o tampão fosfato, depois em solução salina tamponada com fosfato e bloqueie com soro de cabra normal a 10% 0,03% TRITTON X 100 e 0,05% de azida de sódio por uma hora em temperatura ambiente para rotular a expressão de par albumina, use um anticorpo monoclonal de camundongo anti-parvalbumina diluído em uma solução contendo 5% de soro de cabra normal, 0,3% TRITTON X 100 e 0,05% de azida de sódio em PBS, incube os anticorpos primários por dois a três dias a quatro graus Celsius. Após a incubação, enxágue bem as fatias em PBS, aplique anticorpos secundários anti-US fluorescentes junto com uma proteína de ligação à biotina, strippin conjugada a um fluorocromo e incube em uma solução contendo 3% de soro de cabra normal, 0,1% tritton X 100 e 0,05% de sódio diluído em PBS, incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave generosamente as fatias duas a três vezes com PBS, seguido de dois a três enxágues em tampão fosfato.

Monte as fatias em lâminas de vidro e use um espaçador de ágar de 300 micrômetros para evitar que a fatia desmorone. Em seguida, cubra as fatias com um meio de montagem fluorescente e sele com esmalte. Avalie a imunorreatividade da par albumina do interneurônio com alta ampliação e abertura numérica.

As células do cristalino objetivo são consideradas imunorreativas para a par albumina. Se a imunomarcação estiver alinhada com as estruturas marcadas com biotina, obtenha uma série de imagens do eixo Z com um microscópio confocal de varredura a laser, imagem fluorescente de Aden para identificação morfológica e reconstrução tridimensional. Em seguida, reconstrua a imagem em neurônio em três dimensões, incorporando arborização dendrítica e axonal.

A resposta sináptica composta de um interneurônio de pico rápido em resposta a um único estímulo extracelular é mostrada aqui. Aplicação dos antagonistas ionotrópicos do receptor de glutamato, isolados de DNQX e A PV, a corrente pós-sináptica inibitória monos sináptica ou aplicação IPSC do antagonista do receptor de gabaa. Gazin aboliu o componente rápido do IPSC.

Uma sequência de cinco estímulos revelou um IPSC mediado pelo receptor GABA B lento, que foi bloqueado pela aplicação subsequente de CGP. Esses traços mostram potenciais de ação nas PSCs pré-sinápticas, interneurônios de pico rápido e I unitárias de curta latência em células parametálicas CA um sob condições de controle após banho, aplicação de baclofeno e subsequente aplicação de CGP. Observe que o baclofeno reduz a amplitude do IPSC em aproximadamente 50%, enquanto o antagonista do receptor GABA B resultou em uma recuperação quase total da amplitude do IPSC.

Um gráfico de curso de tempo da amplitude IPSC mostra o efeito do baclofeno e do CGPA de pico rápido interneurônio mostrado com ampliação de 20 x tinha um somata localizado na borda do estrato rádio e boneca parama da área ca um com dendritos correndo verticalmente e abrangendo todas as camadas. Embora a maior parte do axônio seja encontrada dentro e ao redor da camada do corpo celular, como típico das células em cesta, uma imagem de ampliação de 60 x mostra cestas típicas de axônios se formando em torno de uma salata parametálica putativa, que são marcadas pelo asterisco laranja. Uma reconstrução tridimensional do mesmo interneurônio é mostrada aqui com o soma e os dendritos em preto e o axônio em vermelho.

As camadas do ca são delineadas em azul Uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada em um dia com análise morfológica de pós-doutorado realizada em várias fatias ao mesmo tempo após seu desenvolvimento. Essa abordagem combinada abriu caminho para pesquisadores de microcircuitos hipocampais e corticais explorarem a diversidade fisiológica morfológica, bem como a inter-relação estrutura-função dos tipos interneurais.