Produção de Haplóide embriões Zebrafish por In Vitro Fertilização

O objetivo geral deste procedimento é produzir embriões de peixe-zebra haplo por fertilização in vitro. Isso é feito primeiro isolando o esperma maduro do peixe-zebra macho adulto e, em seguida, realizando a irradiação ultravioleta para desativar os genomas paternos presentes nas amostras de esperma. O segundo passo é isolar ovos não fertilizados de um peixe-zebra fêmea adulta.

Em seguida, o XR fertilizado com a amostra de esperma inativada por UV. A etapa final é criar a embreagem haplóide até a análise do desenvolvimento, como um ensaio de morfologia ou análise de expressão gênica usando hibridização de montagem inteira C dois. A principal vantagem do uso de embriões de peixe-zebra haplo é que essa técnica permite triagens genéticas avançadas eficientes que usam menos gerações, economizando tempo e espaço animal.

Este método pode ajudar a responder a questões fundamentais no campo do desenvolvimento, como a identificação de genes essenciais para a formação do rim. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a coleta de gametas de peixe-zebra pode ter desafios técnicos. A demonstração visual desse método é fundamental porque ajudará os pesquisadores a aprender a lidar com peixes-zebra adultos para coletar animais maduros.

Para começar, prepare as soluções de estoque de Hank e a solução pré-misturada de Hank. Em seguida, selecione o número desejado de fêmeas adultas de peixe-zebra para a coleta da embreagem haplo. Uma vez selecionado, prepare gaiolas de acasalamento colocando cada fêmea adulta de peixe-zebra com um macho adulto de peixe-zebra em uma câmara de água do sistema para que sejam separados por uma divisória durante a noite.

Primeiro, faça a solução estoque Hank fresca número seis, adicionando 0,35 gramas de bicarbonato de sódio a 10 mililitros de água destilada. Misture bem para dissolver. Em seguida, faça a solução final de trabalho de Hanks tamponada em um tubo sobre gelo.

Após a mistura, prepare alíquotas de 500 microlitros em tubos de microcentrífuga e coloque-os no gelo para coletar espermatozóides suficientes para a fertilização. Selecione de quatro a cinco peixes-zebra machos para cada colheita de esperma. Uma vez sacrificado, seque cuidadosamente o excesso de líquido do macho para evitar o desencadeamento da ativação do esperma.

Depois de decapitar e limpar a cavidade abdominal, localize os testículos ao longo da parede dorsal do corpo lateral à bexiga natatória. Eles têm uma aparência branca opaca quando vistos sob este microscópio estéreo. Uma vez localizado, use uma pinça fina para remover os testículos, tomando cuidado para mantê-los intactos.

Coloque os testículos na solução de esperma e guarde no gelo. Repita essas etapas até que todos os machos tenham sido dissecados. Depois que todas as amostras forem coletadas, homogeneizar os testículos moendo suavemente o tecido com um pilão de microtubo estéril.

Transfira o sobrenadante para uma pequena placa de Petri com gelo. Evite transferir detritos de tecido junto com a solução sobrenadante. Uma vez que isso criará sombras e comprometerá a ativação UV do esperma.

Enxágue o tubo com entre 300 a 400 microlitros de solução adicional de trabalho espinhal de hank e adicione esta lavagem sobrenadante à pequena placa de Petri. Em seguida, exponha o prato aos raios UV de uma lâmpada de bancada por um total de dois minutos a uma distância de 15 polegadas da fonte. Retorne o prato ao balde de gelo e, em seguida, transfira o esperma inativado por UV para um tubo de microcentrífuga fresco armazenado em gelo.

Comece confirmando a profundidade da anestesia em mulheres selecionadas para uma coleta. Depois de anestesiado, remova cuidadosamente o excesso de solução para evitar desencadear a ativação do óvulo. Antes da adição de esperma, coloque a fêmea de lado em uma placa de Petri limpa e visualize sua barriga sob o microscópio estéreo enquanto apoia as costas da fêmea colocando um ou dois dedos de uma mão atrás da parede dorsal do corpo.

Acaricie a barriga suavemente por aproximadamente 10 a 20 segundos usando um ou dois dedos da outra mão para espremer os ovos do abdômen. Os ovos devem sair com muita facilidade ao acariciar o abdômen da fêmea. Se os ovos não emergirem com facilidade, não é aconselhável empurrar com mais força e forçar os ovos da fêmea, pois isso pode causar danos à fêmea.

Uma vez extraído, use uma sonda fina ou uma pequena espátula para retirar o X da fêmea. Levante suavemente a fêmea e coloque-a de volta em um tanque de isolamento devidamente rotulado contendo água do sistema de peixes. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de esperma inativada por UV à ninhada de óvulos e incube em temperatura ambiente por 30 segundos.

Durante esse tempo, cole um rótulo correspondente ao prato para rastreá-lo com o número atribuído à mãe do sexo feminino. Em seguida, adicione um mililitro de solução E três aos ovos e incube em temperatura ambiente por um minuto. Por fim, adicione uma solução suficiente de E três para encher o prato no meio do caminho e coloque os embriões a 28 graus Celsius para posterior incubação.

Após quatro a oito horas, recupere o prato e remova todos os embriões não fertilizados. Embriões não fertilizados podem exibir uma aparência branca opaca ou uma aparência transparente com uma única célula deformada. Em seguida, lave os embriões restantes substituindo o meio de embriões E três por uma solução fresca de E três.

Os embriões são então incubados até o momento desejado, ponto de interesse, e podem ser usados em uma variedade de aplicações de pesquisa. Esta imagem mostra embriões diplóides do tipo selvagem produzidos por desova natural e depois incubados até aproximadamente 30 HPF. Aqui, os embriões haplo foram produzidos por fertilização in vitro e exibem uma série de anormalidades no desenvolvimento.

Os haplos relativamente normais tinham um corpo mais encurtado análogo ao esquema de classificação de um haplo A, enquanto os haplos com anormalidades grosseiras exibiam um eixo corporal severamente truncado correspondente a um grau de B. E, finalmente, o grau C representa má qualidade. Os tipos selvagens haplos haplo exibiram um padrão normal na estrutura renal embrionária em comparação com mutantes diplóides. O padrão segmentado de tipos de células discretas é visualizado visando transcritos de genes que são exclusivos dos tipos de células de néfrons diferenciados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir embriões de peixe-zebra haplo por fertilização in vitro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear o peixe-zebra adulto com cuidado, principalmente ao coletar ovos das fêmeas. Seguindo este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como a hibridização Mountain C dois inteiros, a fim de avaliar o desenvolvimento de tipos de células, como os segmentos do pro naro.

Não se esqueça de que trabalhar com fontes de radiação ultravioleta pode ser extremamente perigoso, e precauções como proteção para os olhos devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.