Name: O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a sequenciar genes 16S rRNA de amostras ambientais usando um sequenciador de bancada. Este método permite caracterizar comunidades microbianas com alta eficiência.

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O desenvolvimento do método apresentado aqui foi realizado com várias fontes de financiamento, incluindo Genome Canada e Genome Quebec, programa Environment Canada STAGE e fundos internos do NRC.

1 16S rRNA gene amplicon Biblioteca Preparação pelo método de fusão <ol><li> Descongele os primers (Atacante, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; reverter, R533-IonP1: 5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG GTG TCG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; negrito: adaptadores específicos Ion Torrent, itálico: chave de seqüenciamento para calibrar a intensidade do sinal no início do seqüenciamento prazo; fonte normal: os iniciadores específicos do modelo, X ... X: 10 pb de código de barras, ver Tabela 1 para algumas sequências de código de barras), a mistura principal 2x HotStartTaq Plus e as amostras. Misture bem antes de usar, exceto para a mistura principal que deve ser misturado delicadamente. </li><li> Prepara-se uma mistura de PCR (20 reacções ul) com 0,5 uM de iniciador inverso, 0,4 mg / ml de Albumina de Soro Bovino (BSA) e mistura mestre 1x HotStartTaq Plus. Adicionar 18,5 mL da mistura principal para eada tubo de PCR. </li><li> Adicionar um iniciador directo (0,5 uL, a 20 mM) com um código de barras diferente para cada uma das amostras que serão sequenciadas conjuntamente. Adicionar 1 ml de amostra (1-10 ng / ul) para o tubo de PCR. </li><li> Colocar os tubos num aparelho de PCR e executar o seguinte programa: desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 min; 25 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 45 seg; alongamento final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR podem ser mantidas a 4 ° CO / N ou congeladas até serem utilizadas. </li></ol> 2. Amplicon Purificação, Quantificação e Pooling <ol><li> Preparar um gel de agarose a 2% utilizando as maiores pentes disponível. Adicionam-se 5 ul de corante de carga de gel de 6x para a reacção e carga sobre o gel, que separa cada amostra por um poço vazio. Submeter o gel a 70 V durante 50 min. </li><li> Tire uma foto do gel e cortar as bandas (tamanho esperado em torno de 250 pb: 190 bp produto mais 63 adaptadores pb e códigos de barras), utilizando um bisturi limpo. </li><li&gt; Pesar as bandas excisadas e proceder à extracção e purificação em gel dos produtos de PCR (com, por exemplo, kit Qiaquick Gel Extraction). </li><li> Quantificação de cada produto de PCR com PicoGreen e fazer diluições para se obter uma solução de estoque a 5 x 10 moléculas de 9 / l (cerca de 1 ng / mL). Se algumas amostras mostram uma menor amplificação, ajustar as diluições de uma concentração mais baixa, mantendo em mente que a concentração mais baixa, apropriado para procedimentos subsequentes é de 1,57 x 10 7 moléculas / mL (26 pM). </li><li> Piscina de 10 uL de cada produto de PCR diluídos para obter uma piscina equimolar de amostras. Prepare uma piscina separada para cada uma corrida sequenciamento planejado. Os produtos de PCR reunidos pode ser mantido no congelador, até ser utilizado. </li></ol> 3. Emulsão PCR e seqüenciamento <ol><li> Realizar PCR emulsão: <ol><li> Dilui-se os produtos de PCR combinados para 26 pM num volume de 25 ul. Descongele reagentes de um kit de modelo Ion PGM. </li><li> Prepare a emulsão mix PCR (reagentes fornecidos no kit) em uma capa da PCR e adicionar os produtos de PCR em pool e as partículas esfera (fornecidas) no banco. Misturar bem e inserir-se a mistura em um cartucho de filtro de topo e cuidadosamente com emulsão de óleo (fornecida). </li><li> Lentamente reverter o cartucho de filtro e carga sobre o aparelho PCR emulsão automatizado (por exemplo, Ion One Touch 2 instrumento). Selecione o programa apropriado e iniciar o procedimento. </li></ol></li><li> Depois de a emulsão de PCR automatizado tenha completado, remover o sobrenadante a partir dos tubos de recolha e de recuperar as partículas da esfera na parte inferior dos tubos. Ressuspender as esferas em 100 ul de solução de lavagem (fornecido com o kit) e tomar uma aliquota 2,0 ul para quantificação biblioteca. </li><li> Realizar a quantificação biblioteca. <ol><li> Misturar 100 mL de tampão SSPE (NaCl 150 mM, NaPO4 10 mM, 1 mM de Na 2 EDTA) com 2 ul de adaptador B&#39;-Fam (5&#39;-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) da sonda e 2 ul de adaptador A-Cy5 (5&#39;-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;) da sonda. Adicionar 52 ul desta mistura para a aliquota 2,0 ul feita no passo 3.2 e adicionar 2 mL de solução de lavagem (a partir do kit de molde) para as restantes 52 ul como um branco para a quantificação. </li><li> Incubar a 95 ° C durante 2 min, em seguida a 37 ° C durante 2 min. Transferir as misturas em tubos de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 1,0 ml de tampão de TEX (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,01% de Triton X-100, pH 8,0), misturar e centrifugar a 15.500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e deixar 20 ul em cada tubo. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. </li><li> Adicionar 180 mL de tampão TEX, voltar a suspender as partículas peletizadas e transferir para tubos de 500 mL qubit. </li><li> Medida de fluorescência para FAM e Cy5 usando um aparelho Qubit e calcular a relação das esferas positivas de usar a calculadora disponível no site da Ion Comunidade. </li></ol></li><li> Enriquecer o restante das partículas de esfera para as esferas positivas (que contêm ADN amplificado), utilizando um sistema automatizado de enriquecimento (por exemplo, iões One Touch Sistema enriquecimento). <ol><li> Reagentes pipeta nas cavidades apropriadas do previsto tira de 8 poços: Poço 1: partículas esfera do passo 3.2; Bem 2: pré-lavado contas MyOne Streptavidin C1 (13 ul); Bem 3, 4 e 5: solução de lavagem (fornecido no kit de molde); Bem 6: vazio; Bem 7: derretem-off (NaOH 125 mM, 0,1% de Tween 20); Bem 8: vazio. </li><li> Instale uma ponta no braço de pipetagem e um tubo de 0,2 ml para coleta de amostras. Iniciar o instrumento. No final do enriquecimento, adicionar 10 ul de solução (fornecida) neutralização. Os grânulos enriquecidos podem ser mantidas a 4 ° C durante até 15 dias. </li></ol></li><li> Inicializar o instrumento seqüenciamento: <ol><li> Conecte-se ao instrumento de seqüenciamento e preparar um plano de seqüenciamento de execução, especificando os detalhes do sequenciamento de execução. </li><li> Install na solução de lavagem # 2 (fornecido com o kit de sequenciação Ion PGM), a solução de lavagem # 1 (350 ul de NaOH a 100 mM) e a solução tampão de pH automático (fornecido). </li><li> Inicie o procedimento de inicialização e, quando solicitado a adicionar dATP, dGTP dCTP e nucleotídeos dTTP (fornecido) em seus respectivos tubos de 50 ml. Parafuso os tubos na máquina de sequenciamento e continuar o processo de inicialização. Quando a inicialização estiver concluída, iniciar o procedimento de execução imediatamente. </li></ol></li><li> Preparar amostras para seqüenciamento e carregar o chip: <ol><li> Recolher as esferas enriquecidos a partir do passo 3.4, na parte inferior do tubo por centrifugação a 15.500 xg, durante 1,5 min. Retirar o sobrenadante deixando exactamente 3 ul. </li><li> Adicionar 3 mL de iniciador de sequenciação (fornecido no kit de sequenciamento), misture bem, pipetando para cima e para baixo para voltar a suspender as partículas. Incubar a 95 ° C durante 2 min, em seguida a 37 ° C durante 2 min. </li><li> Adicionar 1 ml de polimerase (fornecido), misture bem e incubComeram a TA durante 5 min. Continuar para carregar a mistura da enzima-esfera sobre o chip de sequenciamento dentro de 30 min. </li><li> Durante a incubação, coloque o chip de sequenciamento no sequenciador e executar uma verificação de qualidade dos cavacos. Remover o líquido a partir do chip através de centrifugação e colocar a amostra no chip por pipetando lentamente para baixo a mistura de enzima-esfera (7 mL) e evitar a introdução de bolhas no chip. </li><li> Centrifuga-se o chip de três vezes durante 1 minuto numa microcentrífuga. Altere a orientação do chip em cada centrifugação e misture pipetando para cima e para baixo entre cada execução. </li><li> Coloque o chip no aparelho e começar a correr. </li></ol></li></ol> Análise 4 Básica Dados de Sequência <ol><li> Conecte-se ao servidor de dados de sequenciamento e baixar o arquivo fastq. Crie um arquivo delimitado por tabulação &quot;oligos&quot; contendo o primer eo código de barras da informação (ver exemplo no quadro 1). Faça o download dos arquivos de referência GreenGenes do Motwebsite hur ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Lançamento Mothur e realizar análises: <ol><li> Converter o arquivo para um fastq fasta e um arquivo de qualidade usando o seguinte comando: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li> Determinar a associação de grupo de cada seqüência e aparar as seqüências usando o seguinte comando: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T) </li><li> As várias opções pode ser modificado de acordo com o rigor pretendido </li><li> Classifique as seqüências na taxonomia GreenGenes usando o seguinte comando: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, grupo = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, taxonomia = gg_99_otus.tax, corte = 50) </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

<html> O método aqui apresentado é simples e barato, e deve permitir que muitos laboratórios para acessar o poder de seqüenciamento metagenômica. Embora varia de acordo com a plataforma de sequenciamento utilizado, uma vez que as bibliotecas são construídas é necessário muito pouco hands-on do tempo, com a maior parte do processo que está sendo automatizada. Para a plataforma de sequenciamento utilizado aqui (Ion Torrent PGM), o procedimento completo pode ser realizada dentro de dois dias de trabalho. No momento da escrita (Setembro de 2013), os custos de reagentes relacionados com o exemplo descrito acima foram como se segue: Amplificação por PCR de 36 amostras: $ 25, a purificação do gel e o DNA PicoGreen quantificação de 36 amostras: $ 125, emulsão de PCR para uma amostra amplicão agrupada : US $ 150 e reagentes de seqüenciamento: US $ 250, para um total de US $ 550 ou US $ 15 por amostra ou $ 0,0015 por leitura filtrada qualidade. Este preço não inclui contrato instrumento de serviço, depreciação instrumento, salário técnico e uso de espaço de laboratório. tenda &quot;&gt; Um dos passos mais importantes é o de reunir todos os produtos numa proporção equimolar, com a finalidade de recuperar o número similar de leituras para cada uma das amostras. PicoGreen quantificação foi utilizada aqui, mas outros métodos podem ser apropriados, embora menos exacto (por exemplo, quantificação de UV, à base de gel de quantificação). Mesmo fazendo a quantificação mais precisa e de agrupamento, existe alguma variabilidade do número de leituras por amostra, e, no ensaio típico descrito na Tabela 2, que varia de 4.380 a 32.750 lê, com uma média de 10,338 leituras. Se o processamento de grande número de amostras (mais de 40-50), única coluna de purificação em gel pode ser substituído por purificação em gel em placa ou purificação usando grânulos com um tamanho de corte rigorosas (por exemplo, grânulos AMPure) . Até o momento, a tecnologia de sequenciamento de próxima geração mais utilizado para o gene 16S rRNA é 454 A Ion Torrent tecnologia de sequenciamento utilizado neste protocolo é conceitualmente muito semelhantea 454, e ambas as tecnologias são propensos ao mesmo tipo de erros de sequenciação. Não surpreendentemente, foi demonstrado que a Ion Torrent sequenciamento resultou em resultados de sequenciamento muito semelhantes a 454 seqüenciamento 10. Recentemente, muitos pesquisadores têm explorado o uso da tecnologia Illumina para 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento 18,19. Em qualquer caso, seria fácil de adaptar o protocolo corrente para outros sequenciadores de bancada como o Ilumina MiSeq ou a 454 GS Júnior alterando as sequências de iniciadores de fusão para coincidir com os códigos de barras e placas necessárias para estas tecnologias de sequenciação, como no método descrito recentemente para o Ilumina MiSeq 19. Como alternativa, os pesquisadores poderiam seguir os passos 1 e 2 do protocolo detalhado aqui e envie os amplicons reunidos para um centro de sequenciamento onde a emulsão PCR e sequenciamento seria realizada. O gene 16S rRNA leituras foram aparadas e classificados utilizando Mothur, mas muitas outras análises podem ser realizadas emAmplicons do gene 16S rRNA. Por exemplo, beta diversidade pode ser avaliada pelo cálculo das distâncias Unifrac entre cada par de amostra, utilizando o procedimento descrito no <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Índices de diversidade alfa e número de unidades taxonômicas operacionais de cada amostra pode ser calculada usando ferramentas dentro QIIME como AmpliconNoise 21 ou usando o procedimento descrito por Huse et al. 22 e disponível dentro Mothur. Os iniciadores utilizados aqui amplificado das regiões variáveis ​​3 e 4 a partir do gene de rRNA 16S, mas em muitas outras regiões pode ser alvejado. No presente estudo, os genes de rRNA 16S foram amplificados a partir de material vegetal e a escolha de iniciador foi feito para evitar a amplificação do gene de ARNr 16S cloroplasto 23,24. Há uma grande variedade de outros iniciadores disponíveis, que variam em termos do comprimento do produto, de potência e utilidade taxonómica 25,26. No entanto, em todos os casos 200-400 bp lê do gene 16S rRNA não pode ser classificado de forma confiável em nível de espécie, e as análises são limitados ao gênero e os níveis taxonômicos superiores. Outros genes poderia ser mais apropriado se a informação nível de espécie é necessária, assim como os cpn60 e rpoB genes 27,28. Gotas drásticas futuras no custo do sequenciamento e aumentos no poder de ferramentas de análise pode torná-lo viável para substituir seqüência do gene 16S rRNA por metagenômica espingarda, mas até então seqüência do gene 16S rRNA continua sendo o padrão ouro de microbiologia ambiental.

Sequenciação metagenômico é uma tecnologia poderosa, uma vez que tem como alvo a totalidade da informação genética contida numa amostra ambiental. Existem diferentes sabores de sequenciamento metagenômica, incluindo seqüenciamento shotgun, bibliotecas de grande inserção e amplicon seqüenciamento. Amplicon sequenciação oferece a vantagem de ser relativamente barato, rápido e capaz de produzir leituras de uma região genómica que pode ser geralmente alinhado. Além disso, o fluxo de trabalho para a análise dos dados de sequenciação do amplicon é principalmente padronizado. No entanto, uma vez que é baseada na PCR, que tem todos os preconceitos relacionados com a especificidade incompleta, uma cobertura incompleta e iniciador influencia 1,2, o que torna esta abordagem semi-quantitativa na melhor das hipóteses. Várias regiões do genoma podem ser direcionados para o seqüenciamento amplicon incluindo genes funcionais, mas as opções mais populares são o uso de genes marcadores, tais como o gene 16S rRNA para gerar um perfil da comunidade. Tradicionalmente, 16S rRNA gene amplicon Sequencing foi realizada utilizando técnicas intensivas de trabalho que incluiu a clonagem em E. coli, a colheita de colónias e de extracção do plasmídeo seguido por Sanger de sequenciação nos plasmídeos isolados, e, consequentemente, a maioria dos estudos analisadas menos de 100 clones por amostra. Sequenciamento de próxima geração trouxe dois grandes avanços: a paralelização massiva das reações de sequenciamento e, mais importante, a separação clonal de modelos sem a necessidade de inserir fragmentos de genes em um host. Isso simplificou enormemente o seqüenciamento de amplicons do gene 16S rRNA, que agora está de volta como uma característica de rotina de muitos estudos de microbiologia ambiental, resultando em um &quot;renascimento&quot; para 16rRNA amplicon gene seqüenciamento 3. Desde o advento da Roche 454 seqüenciamento em 2005 4, várias outras tecnologias de sequenciamento de próxima geração têm aparecido no mercado (por exemplo, Illumina, Sólido, PacBio). Mais recentemente, a introdução da sequência de bancadars trouxe para pequenos laboratórios a capacidade de sequenciamento, uma vez exclusivo para os grandes centros de sequenciamento. Cinco máquinas de bancada estão disponíveis atualmente: o 454 GS Junior, a Ion Torrent Pessoal Genome Machine (PGM) e Proton, ea Illumina MiSeq e NextSeq 500 Embora todos estes sequenciadores oferecem menos lê por corrida e menos bases por dólar do que a maioria full- sequenciadores escala, são mais flexíveis, rápidas, e seus baixos custos de aquisição e de execução torna-los acessíveis para pequenos laboratórios acadêmicos. Sequenciadores de bancada são particularmente adequados para o amplicon, genoma pequeno e de baixa complexidade metagenome seqüenciamento em estudos de microbiologia ambiental, porque este tipo de estudos geralmente não requer uma profundidade extrema de seqüenciamento. Por exemplo, é geralmente aceite que a seqüência do gene 16S rRNA estuda o número de leituras por amostra não é primordial, como ~ 1000 lê pode gerar os mesmos padrões como vários milhões de conjuntos de dados lê 5. Dito isto, bancada próxima generatio<html> n sequenciadores ainda geram grandes quantidades de dados de sequência, com rendimentos máximos de ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 EUR (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 EUR (Ion Torrent Proton), ~ 10 EUR (Illumina MiSeq) e ~ 100 EUR (Illumina Próxima Seq 500), que é mais do que suficiente para a maioria dos estudos de microbiologia ambiental. Sequenciamento de próxima geração de amplicons 16S rRNA usando seqüenciadores de bancada foi recentemente aplicado a uma grande variedade de ambientes. Por exemplo, o Ion Torrent PGM tem sido usada para a comunidade análises de rejeitos de minas de urânio que tinham particularmente elevado pH e baixa permeabilidade 6, de sistemas de recirculação de aquicultura 7, de contaminados com hidrocarbonetos solos árticos 8,9, de areias de petróleo de mineração sedimentos afetados e biofilmes do rio Athabasca 10,11, da rizosfera de salgueiros plantadas em solos contaminados 12, dos corpos humanos e animais 13-16 e de digestores anaeróbicos 17. jove_content &quot;&gt; Neste contribuição que detalhe a nossa abordagem para sequenciar fragmentos amplificados do gene 16S rRNA em casa usando uma bancada sequenciador de última geração (o Ion Torrent PGM). Após a extração do DNA, os genes 16S rRNA são amplificados utilizando-level domain primers bacterianos que contêm adaptadores de sequenciação e as sequências originais, específicos de amostragem (códigos de barras). Os produtos de amplificação foram purificados, quantificadas e reunidas numa relação equimolar. As amostras combinadas são então amplificado por clonagem em uma emulsão de PCR e sequenciado. sequências resultantes são analisados ​​utilizando ferramentas da bioinformática publicamente disponíveis ( por exemplo, Mothur).

<table><tbody><tr><td>Kit de Chip Ion 314 v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482261</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Sequenciamento PGM de Íon v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482006</td><td></td></tr> Modelo <tr><td>PGM de Íon OT2 200 Life</td><td>Technologies</td><td>4480974</td><td></td></tr><tr><td>Kit Master Mix Qiagen</td><td></td><td></td> 203646 <td></td></tr><tr><td>Primers e sondas</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Kit de extração</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BSA 20 mg/ml</td><td>Roche</td><td>10.711.454.001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr></tbody></table>

o sequenciamento de próxima geração de 16s rna ribossomal gene amplicons

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Uma das principais questões em ecologia microbiana é &quot;Quem está aí?&quot; Esta pergunta pode ser respondida usando várias ferramentas, mas um dos padrões de ouro de longa duração é a seqüência amplicons 16S ribossomal RNA de genes (rRNA) gerados pelo nível de domínio PCR As reacções de amplificação de ADN genómico. Tradicionalmente, esta foi realizada por clonagem e Sanger (eletroforese capilar) sequenciamento de fragmentos amplificados por PCR. O advento do sequenciamento de última geração tem tremendamente simplificada e aumento da profundidade de sequenciamento para o seqüenciamento do gene 16S rRNA. A introdução de seqüenciadores de bancada agora permite que pequenos laboratórios para realizar seu 16S rRNA seqüenciamento em casa em questão de dias. Aqui, uma abordagem para 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento usando uma bancada sequenciador de última geração é detalhado. O ADN ambiental é primeiro amplificado através de PCR utilizando os iniciadores que contêm os adaptadores de sequenciação e os códigos de barras. Eles são, em seguida, acoplado a partículas esféricas através da emulsão de PCR. As partículas são loaded num chip descartável e o chip é inserido na máquina de sequenciação após o que a sequenciação é realizada. As sequências são obtidas em formato fastq, filtrada e os códigos de barras são usados ​​para estabelecer a adesão amostra da lê. O filtrado e, em seguida, lê binned são analisados ​​utilizando ferramentas disponíveis publicamente. Uma análise exemplo, onde as leituras foram classificadas com um algoritmo de descoberta taxonomia dentro do pacote de software Mothur é dado. O método descrito aqui é simples, barato e simples e deve ajudar laboratórios menores para tirar proveito da revolução genômica em curso.

Após purificação em gel, com 25 ciclos de amplificação por PCR, os produtos de amplificação são geralmente numa concentração de 0,2-10,0 ng em 50 ul de água. Isto pode variar amplamente, dependendo da concentração de DNA de partida, o tipo de amostra e o kit de purificação utilizado. Recomenda-se para manter o número de ciclos de PCR para o mais baixo possível para evitar a formação de quimeras e diminuir vieses amplificação, tendo em conta que todas as amostras devem ser amplificados utilizando o mesmo número de ciclos. Para minimizar o número de leituras e policlonal esferas vazias e maximizar o número de leituras, o rácio Qubit deve situar-se entre 0,1 e 0,3 e a fluorescência de FAM deve ser acima de 200 Usando um chip 314 de um Ion Torrent PGM, a produção média é de cerca 0,3-0,5 M de boa qualidade lê depois da filtragem dos resultados em Mothur. Tabela 2 apresenta a composição típica do número de leituras após cada passo do processo para uma corrida contendo 36 environ multiplexadoamostras mentais amplificado com primers visando região V3-4 dos 16S e analisados ​​utilizando Mothur. Em Mothur, o procedimento trim.seqs gerar um arquivo &quot;* .trim.fasta&quot; contendo as sequências que passaram os filtros de qualidade e um &quot;* .scrap.fasta&quot; que contém as seqüências que não passar pelos filtros de qualidade, juntamente com a razão para rejeição no cabeçalho de sequência. Quando fornecido com códigos de barras no arquivo &quot;oligos&quot;, este comando também irá gerar um arquivo &quot;* .Grupos&quot; que contém a associação de grupo de cada seqüência com base na seqüência de código de barras. O procedimento classify.seqs gera um &quot;.tax.summary&quot;, que pode ser aberto no Excel. Este arquivo contém o resumo da afiliação taxonômica (em linhas) para cada uma das amostras (em colunas). Este arquivo pode ser usado para análises estatísticas jusante e visualizar a composição da comunidade em vários níveis taxonômicos. O arquivo &quot;.taxonomy&quot; contém o taxonômico detalhadofiliação para cada sequência. A composição média comunidade ao nível filo / classe em todas as 36 amostras é mostrado na Figura 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Composição média comunitária em nível filo / aula em todas as amostras. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> para a frente </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Exemplo de arquivo &quot;oligos&quot; para uso em Mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # De leituras </td><td style="width:123px;"> % Do passo anterior </td><td style="width:107px;"> Médio. por amostra </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Número de poços </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Wells com miçangas </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88,20% </td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Contas com modelos </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99,90% </td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Contas monoclonais </td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74,30% </td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Boa qualidade lê (saída do sequenciador) </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94,60% </td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Passe Mothur filtros (min. Média. Índice de qualidade de 20 sobre uma janela 50pb, min. Comprimento de 150bp) </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47,60% </td><td align="center"> 10338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificadas no nível de filo em GreenGenes (50% limite de confiança) </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificadas no nível de família em GreenGenes (50% limite de confiança) </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92,50% </td><td align="center"> 8792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificadas no nível de gênero em GreenGenes (50% limite de confiança) </td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91,60% </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> Tabela 2 Número de leituras produzido a partir de uma corrida típica de 36 amostras ambientais multiplexados em um Ion Torrent 314 chips.

Caracterizar a comunidade microbiana tem sido um objetivo de longa data na microbiologia ambiental. Os métodos de sequenciamento de última geração agora permitem a caracterização de comunidades microbianas em uma profundidade sem precedentes, com custo e mão de obra mínimos. Detalhamos aqui nossa abordagem para sequenciar genes de RNA ribossômico 16S bacteriano usando um sequenciador de bancada.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

O objetivo geral deste procedimento é sequenciar o RRNA 16S. Genes amplificados a partir de amostras ambientais utilizando uma máquina de sequenciamento de bancada. Isso é realizado primeiramente amplificando o gene do RRNA 16S utilizando primers modificados.O segundo passo é purificar os produtos da amplificação, quantificá-los e agrupá-los. Em seguida, o conjunto de amplicons é ligado a esferas de sequenciamento amplificadas de forma clonal durante a PCR em emulsão e sequenciado em um sequenciador de bancada. O passo final é analisar os conjuntos de dados de sequência resultantes.Em última análise, o sequenciamento de amplicons do gene 16S-RNA é utilizado para determinar a composição e diversidade da comunidade microbiana em uma amostra ambiental. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como DGG ou sequenciamento de clones, é que ela fornece uma perspectiva mais profunda e clara sobre a composição e diversidade da comunidade microbiana.Este método pode ajudá-lo a responder a uma das principais perguntas na ecologia microbiana: quem está presente? Para começar, os primers direto e reverso, a mistura mestra TwoX Hot Start Taq Plus e as amostras, a sequência dos primers direto e reverso corresponde ao modelo mostrado. A sequência contém adaptadores específicos para Ion Torrent.Uma chave de sequenciamento para calibrar a intensidade do sinal no início do sequenciamento. Execute um iniciador específico para o molde e um código de barras de 10 pares de bases. Em seguida, misture bem os iniciadores e as amostras antes do uso.Prepare uma reação de PCR. Misture 20 microlitros por reação contendo 0,5 micromolar do iniciador reverso, 0,4 miligramas por mililitro de BSA e um X de master mix hot start taq plus. Em seguida, pipete 18,5 microlitros do master mix em cada tubo de PCR e adicione 0,5 microlitros de uma solução estoque de iniciador direto de 20 milimolar contendo um código de barras diferente a cada uma das amostras que serão sequenciadas juntas.Em seguida, fora da cabine de PCR, adicione um microlitro de uma amostra com concentração de um a 10 nanogramas por microlitro ao tubo de PCR. Configure um programa com uma desnaturação inicial de 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, 25 ciclos de 95 graus Celsius por 30 segundos.55 graus Celsius por 30 segundos e 72 graus Celsius por 45 segundos. A elongação final deve ser realizada a 72 graus Celsius por 10 minutos. Coloque os tubos em uma máquina de PCR e inicie o programa.Os produtos finais de PCR podem ser armazenados a quatro graus Celsius ou a vinte graus negativos Celsius até serem utilizados. Prepare um gel de agarose a 2% utilizando os pentes maiores disponíveis. Em seguida, misture cinco microlitros de corante de carga para gel a 6 x com cada reação de PCR e carregue as amostras no gel, separando cada amostra por um espaço vazio.Execute o gel a 70 volts durante 50 minutos. Após a corrida eletroforética, tire uma foto do gel e recorte as bandas usando um bisturi. Cada banda deverá ter cerca de 250 pares de bases, contendo um produto de 190 pares de bases com 63 pares de bases que compõem os adaptadores e códigos de barras.Em seguida, pese as bandas ressecadas e prossiga com a extração e purificação dos produtos de PCR a partir do gel. Utilizando um kit como o kayak quick gel extraction kit, quantifique cada produto de PCR com pico green e prepare diluições para obter uma solução estoque com cinco vezes 10 à nona moléculas por microlitro, o que equivale aproximadamente a um nanograma por microlitro. Se algumas amostras apresentarem amplificação menor, ajuste a concentração conforme necessário, mas não reduza abaixo de 1,57 vezes 10 à sétima moléculas por microlitro.Combine 10 microlitros de cada produto de PCR diluído para obter um pool equimolar de amostras, preparando um pool separado para cada um dos sequenciamentos planejados. Os produtos de PCR em pool podem ser armazenados no congelador até o momento de realizar a emulsão. Primeiro, realize o PCR, dilua os produtos de PCR em pool para 26 picoMolar em um volume de 25 microlitros e prepare os reagentes de um kit de template Ion PGM.Em seguida, trabalhe em uma capela PCR e prepare a PCR em emulsão. Misture os produtos PCR em pool e as partículas esféricas podem ser adicionadas ao trabalhar na bancada. Misture bem a solução e, em seguida, insira a mistura em uma cartela de filtro e cubra cuidadosamente com óleo emulsificante.Em seguida, inverta lentamente o cartucho do filtro e coloque o cartucho no aparelho automatizado de PCR em emulsão. Então, selecione o programa apropriado e inicie o procedimento. Após a conclusão da PCR em emulsão automatizada, remova o sobrenadante dos tubos de coleta e recupere as partículas esféricas no fundo dos tubos.Resus.Suspenda as esferas em 100 microlitros de solução de lavagem e retire uma alíquota de dois microlitros para quantificação da biblioteca. Para sequenciar os produtos de PCR, prepare um plano de corrida de sequenciamento que especifique os detalhes da corrida. Em seguida, abra o instrumento, clique em inicializar e, quando solicitado, instale a solução de lavagem número dois, a solução de lavagem número um e a solução tampão de pH automático no instrumento de sequenciamento.Em seguida, prossiga com o procedimento de inicialização e, quando solicitado, adicione os nucleotídeos D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P e DTTP nos respectivos tubos de 50 mililitros. Em seguida, parafuse os tubos na máquina de sequenciamento e continue o procedimento de inicialização. Após a conclusão do procedimento de inicialização, inicie imediatamente o procedimento de carregamento das amostras para preparar as amostras para o sequenciamento.Centrifugue as esferas enriquecidas da PCR em emulsão a 15.500 × g durante 1,5 minuto para recolher as esferas no fundo do tubo. Em seguida, remova o S natin e deixe exatamente três microlitros no tubo. A seguir, adicione três microlitros do iniciador de sequenciamento ao tubo e pipete para cima e para baixo para ressuspender as partículas e misturar a solução completamente.Incube o tubo por dois minutos a 95 graus Celsius e, em seguida, por dois minutos a 37 graus Celsius. Quando a incubação estiver concluída, adicione um microlitro de polimerase e misture bem; depois, incube a mistura à temperatura ambiente por cinco minutos. Enquanto a mistura estiver em incubação, carregue o chip de sequenciamento no sequenciador e realize uma verificação de qualidade do chip.Em seguida, remova o líquido do chip com uma breve centrifugação em centrífuga micro. Carregue a amostra no chip pipetando lentamente sete microlitros da mistura de esferas enzimáticas, evitando introduzir bolhas no chip. Uma vez que a amostra estiver carregada no chip, coloque o chip no instrumento e inicie a corrida de sequenciamento.Para iniciar a análise dos dados, conecte-se ao servidor de dados de sequenciamento e faça o download do arquivo fast Q. Em seguida, crie um arquivo de oligos delimitado por tabulação contendo as informações sobre o iniciador e o código de barras. Depois, baixe os arquivos de referência Green Genes do site principal, inicie o programa mother e realize a análise.Converta os arquivos FASTQ em um arquivo de qualidade FASTA utilizando o comando mostrado na parte inferior da tela. Determine a pertinência de cada sequência a um grupo e corte as sequências. Utilizando este comando, classifique então as sequências na taxonomia Green Genes.Utilizando este comando, a saída média ao realizar o sequenciamento com um chip 14 em três vezes em um Ion Torrent PGM é de aproximadamente 0,3 a 0,5 milhão. Leituras de boa qualidade após os resultados serem filtrados no Mothur. Abaixo, há uma divisão típica do número de leituras após cada etapa deste procedimento de sequenciamento de nova geração. É mostrada aqui a composição média da comunidade no nível de filo e classe de todas as 36 amostras ambientais multiplexadas que foram amplificadas com primers direcionados à região V3-V4 do ribossomo 16S e analisadas utilizando o Mothur One Master.Essa técnica pode ser realizada em dois dias, se executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sequenciar os candidatos do RNA ribossômico 16 s utilizando uma máquina de sequenciamento de bancada.

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

Um protocolo para quantificar genes bacterianos de rRNA 16S e transcritos de sedimentos costeiros por meio de PCR em tempo real é fornecido. A metodologia inclui a coextração de DNA e RNA; preparação de RNA livre de DNA; e quantificação do gene 16S rRNA e transcrito via RT-q-PCR, incluindo construção de curva padrão.

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

Metagenomics foi usada para investigar o microbioma da alimentação de bovinos para silagem. A análise foi realizada por sequenciamento shotgun. Essa abordagem foi utilizada para caracterizar a composição da comunidade microbiana na alimentação do gado.

Análise metagenômica de Silagem

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Este protocolo detalha uma abordagem abrangente para a montagem de um genoma híbrido de bactérias urinárias. Fornece um procedimento reprodutível para a geração de sequências completas de genomas circulares úteis no estudo de elementos genéticos cromossômicos e extracromosômicos que contribuem para a colonização urinária, patogênese e disseminação de resistência antimicrobiana.

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Aprenda a sequenciar genes 16S rRNA de amostras ambientais usando um sequenciador de bancada. Este método permite caracterizar comunidades microbianas com alta eficiência.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

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