Name: Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação de células aderentes em lâminas de óxido de índio-estanho para estudar comunicação intercelular e função das junções comunicantes em biologia celular.

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Agradecemos a Lowell Cochran pela assistência especializada em videografia. A assistência financeira dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), da Fundação Canadense do Câncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontário), do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), da Aliança Canadense de Pesquisa do Câncer de Mama, dos Centros de Excelência de Ontário, da Breast Cancer Action Kingston e do fundo de legado Clare Nelson por meio de doações ao LR é reconhecida com gratidão. SG recebeu uma bolsa de estudos do NSERC. MG foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Programa de Câncer de Mama do Exército dos EUA, do Ministério de Pesquisa e Inovação da Província de Ontário e do Comitê Consultivo de Pesquisa da Queen's University.

1. plaqueamento das células do Eletroporação Chambers <ol><li> Numa capela de fluxo laminar, as células trypsinize usando uma técnica estéril, como de costume. NOTA: É muito importante para eliminar por centrifugação todos os vestígios de tripsina, porque eles podem prejudicar propagação das células no vidro, daí a formação de adherens e junções comunicantes. </li><li> Pipetar 1 mL da suspensão de células nas câmaras de electroporação estéril fornecido com o electroporador em situ (Figura 1), e em lugar de um de 37 o C, incubadora de CO 2. NOTA: A adesão celular pode ser melhorada através de plaqueamento em fibronectina, colagénio, poli-lisina ou de células e tecido adesivo (ver Tabela Materiais). </li><li> Quando as células formaram uma camada confluente eles estão prontos para análise CIJH. </li></ol> 2. Eletroporação Procedimento Eletroporação para exame GJIC pode ser realizada fora de uma capela de fluxo laminar,uma vez que leva apenas alguns minutos. Se forem necessários tempos de incubação mais longos para uma experiência específica, em seguida, pode ser realizado inteiramente num exaustor de fluxo laminar. Em todos os casos, as câmaras onde são cultivadas as células têm de ser estéreis. <ol><li> Prepara-se uma / ml solução amarelo Lucifer 5 mg: Dissolver 10 mg de pó de LY (fornecida com o electroporador) em 2 ml de meio de crescimento isento de cálcio. Para os experimentos que requerem tempos de incubação mais longos, filtro de esterilizar a solução e armazenar a 4 ° C. </li><li> Aspirar o meio de crescimento e lavar as células com meio livre de cálcio, tendo o cuidado para não arranhar a monocamada ou secar as células. Se as células são secas têm geralmente núcleos mais escuras e pegar LY sem electroporação. O efeito é mais pronunciado no meio do slide que está mais exposto a correntes de ar (Figura 4F). </li><li> Com uma pipeta de Eppendorf, pipetar a solução corante para as células (400 ul para o conjunto da câmara), na extremidade da câmara, being cuidado para não tocar a camada de células. </li><li> Coloque a câmara no suporte fornecido com o electroporador e aplicar um impulso de força adequada (ver discussão). </li><li> Aspirar cuidadosamente um pouco da solução LY. Ele pode ser reutilizada uma segunda vez para experiências menos importantes. </li><li> Adicionar DMEM livre de cálcio com 10% de soro dialisado. </li><li> Incubar as células durante 3-5 minutos na incubadora para permitir a transferência de corante através de junções de hiato. NOTA: A inclusão de soro dialisado, neste ponto ajuda encerramento dos poros. </li><li> Lavar o corante não incorporado com DMEM isento de cálcio para a observação de células vivas. Alternativamente, as células podem ser fixadas nesta fase, por meio da adição de 4% de formaldeído para o bem, em seguida, lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato). Em todos os casos, a lavagem deve remover todo o fundo. NOTA: Em experimentos preliminares para determinar as condições ideais, se a tensão é muito baixa, então é possível para permitir que as células se recuperar no incubator durante alguns minutos e electroporate mesma lâmina uma segunda vez, para economizar no custo de lâminas. </li></ol> 3. exame microscópico <ol><li> Observar as células sob iluminação de fluorescência, utilizando um microscópio invertido equipado com o filtro apropriado para o corante a ser utilizado. Para Lúcifer amarelo, excitação é 423nm, emissão de 555nm, filtro VCI para um microscópio Nikon IX70. </li><li> Eliminar efeitos de menisco, colocando uma lamela de vidro na parte superior do poço de plástico, depois do enchimento ele para o topo com o líquido, para examinar a morfologia das células sob contraste de fase. Para melhores imagens, o poço pode ser isolada a partir da lâmina, e a lamela colocada sobre a moldura. Para as células fixas, o poço pode ser preenchido com glicerol para observação microscópica, enquanto para as células vivas, deve ser preenchido com o meio de crescimento. NOTA: Lavagem e fotografando é mais fácil se as células são fixadas com formaldeído após a transferência do corante (passo 2.7 acima). Se as células não sãot fixo, a fluorescência é eliminada das células dentro de aproximadamente 60 min, dependendo do tipo de célula, da tensão e da quantidade de LY introduzido enquanto em células fixas fluorescência é mantida durante várias horas. No entanto, a fluorescência ou dissipa após se desvanece O / N a incubação, até mesmo em células fixadas. Por esta razão, deve ser feita fotografias logo após a electroporação (Figura 2). </li></ol> 4. quantificação de comunicação intercelular <ol><li> Fotografar as células com uma objectiva de 20x sob contraste de fase e fluorescência (Figura 3). </li><li> Identificar e marcar com uma estrela as células eletroporados na fronteira com a área não-electroporados (Figura 2, seta, borda eletroporação). </li><li> Identificar e marcar com um ponto de células fluorescentes no lado não-electroporado, em que o corante foi transferida através de junções de hiato (Figuras 3A e 3B). </li><li> Dividir o número total decélulas fluorescentes na área de não-electroporado pelo número de células electroporadas ao longo da borda (Figuras 3A e 3B). NOTA: A transferência de, pelo menos, 200 células de fronteira electroporadas contíguos é calculado para cada experiência. O valor obtido é o valor CIJH. </li></ol>

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O autor correspondente é o inventor de uma patente detida pela Queen's University, que foi licenciada para a Cell Projects Inc. A empresa ou a Universidade não tiveram influência sobre o conteúdo do artigo.

As etapas críticas no protocolo Material de electroporados A pureza do material a ser electroporada é muito importante. Se as células são muito plana, então as concentrações mais elevadas do corante de rastreio devem ser usados ​​(até 20 mg / ml para LY) e em tais casos, a pureza é mais importante do que em células com uma forma mais esférica 1. Além LY uma grande variedade de outros corantes ou moléculas nonpermeant têm sido empregues, tais como uma série de...

A aplicação de corrente eléctrica para uma célula provoca a formação de poros na membrana da célula, por um processo denominado electroporação. Os poros permitem a passagem de uma variedade de moléculas nonpermeant através da membrana. O campo eléctrico pode ser controlada com precisão, de modo a que os poros que se formam são muito pequenas e religar-se rapidamente, com uma perturbação mínima para a fisiologia celular. Interessantemente, as células aderentes podem ser cultivadas numa lâmina de vidro revestido com óxido de índio-estanho condutora e transparente (ITO) e electroporado in situ, isto é sobre a superfície de onde elas crescem, sem ser retirado para ser electroporada em suspensão. As células podem crescer muito bem nesta superfície, e como eles estão ligados e ampliado, a observação microscópica detalhada é possível. Utilizando esta técnica, as pequenas moléculas nonpermeant pode ser introduzido imediatamente e essencialmente em 100% das células, o que faz com que esta técnica especialmente adequado para estudos sobre a activação do components de um caminho a seguir a estimulação do ligando de um receptor (revisto em 1). A electroporação foi usado principalmente para a introdução de ADN (também chamada electrotransfection). No entanto, a electroporação in situ pode ser valiosa para a introdução de uma grande variedade de moléculas, tais como péptidos 2-4, oligonucleótidos, tais como ARN anti-sentido, oligonucleótidos de cadeia dupla de DNA de engodo para inibir a ligação do factor de transcrição, ou siRNA 3,5, 6, nucleotídeos radioativos 7-10, proteínas 11 12 ou pró-drogas 13. Após a electroporação, as células podem ser lisadas para análise bioquímica ou fixadas e coradas com anticorpos. O revestimento condutor de ITO é muito fina, 800-1,000Å, de modo que o crescimento celular não é perturbado pela diferença em altura das duas superfícies, como as células crescem em toda a borda do revestimento condutor. Isto oferece a vantagem de que não electropAs células podem ser cultivadas orated lado a lado com os electroporadas, para servir como controlos. A mesma abordagem pode ser usada para o exame de junções de hiato, a comunicação intercelular (CIJH), como descrito no vídeo. Junções comunicantes são canais que ligam o interior das células adjacentes 14. Das junções de hiato, a comunicação intercelular desempenha um papel importante na formação de tumores e metástases, enquanto que os oncogenes tais como Src suprimir CIJH 15,16. Para examinar a CIJH um corante fluorescente, tal como amarelo Lucifer (LY) é muitas vezes introduzido em células cultivadas através de microinjecção ou raspar-carregamento 17 e a difusão do corante para as células vizinhas é observada microscopicamente sob luz de fluorescência. Estas técnicas contudo invariavelmente causar dano celular. Descreve-se agora uma técnica em que as células são cultivadas sobre uma lâmina de vidro, que é parcialmente revestida com ITO 18. Um impulso eléctrico foi aplicada na presença de LY (ou outros corantes) cautilizando a sua penetração nas células que crescem na parte condutora da lâmina, enquanto que a migração do corante para as células adjacentes, não electroporadas foi observada microscopicamente através de iluminação de fluorescência. Para evitar as células sensíveis perturbadores que possam tender a separar da monocamada, foi concebido um conjunto que não requerem um eléctrodo a ser colocado no topo das células para aplicar a corrente eléctrica 19. Esta abordagem oferece a possibilidade de quantificar a CIJH em ​​um grande número de células, sem qualquer perturbação detectável para o metabolismo celular, como indicado pela ausência de um efeito sobre a duração da fase G1 seguindo estimulação sérica 12, em aumentar os níveis de fos proteína proto-oncogene (Raptis, não publicado) ou duas quinases associadas ao estresse celular, o porco p38 ou JNK / SAPK quinase 1. Esta abordagem possibilitou a análise da relação entre os níveis de oncogene expressão, transformação e GJIC 18, bem como o efeito da Src e Stat3 sobre CIJH em ​​uma variedade de tipos de células, incluindo as células cultivadas de fresco a partir de espécimes de tumor de pulmão de 20-23. Além disso, em electroporação in situ com a configuração descrita, a qual não tem um eléctrodo de topo tem sido empregue com sucesso para a demonstração de fecho das junções de hiato na diferenciação dos adipócitos, embora a adesão celular ao substrato é reduzido, nessa fase, 19,24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sem Hiclona de Cálcio</td><td>(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Bezerro Doador&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroporação</td><td>Cell Projects Ltd Reino Unido: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd Reino Unido</td><td>ACE-04-CC</td><td>4 poços</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd Reino Unido</td><td>ACE-08-CC</td><td>8 poços</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-25-LY</td><td>Alta pureza</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Adesivo celular e tecidual</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F1141</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poli-Lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio funcional para juncional exame; eletroporação de aderentes em células no Índio-tin oxide

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

Nesta técnica, as células são cultivadas em uma lâmina de vidro que é parcialmente revestida com óxido de índio-estanho (ITO), um material transparente e eletricamente condutor. Uma variedade de moléculas, como peptídeos ou oligonucleotídeos, pode ser introduzida em essencialmente 100% das células de maneira não traumática. Aqui, descrevemos como ele pode ser usado para estudar a comunicação intercelular e juncional comunicativa. O amarelo de Lúcifer penetra nas células quando um pulso elétrico, aplicado à superfície condutora em que estão crescendo, faz com que os poros se formem através da membrana celular. Isso é eletroporação. As células que crescem na superfície de vidro não condutora imediatamente adjacente à região eletroporada não absorvem o amarelo de Lúcifer por eletroporação, mas adquirem o corante fluorescente à medida que é passado para elas por meio de junções comunicantes que as ligam às células eletroporadas. Os resultados da transferência de corante de célula para célula podem ser observados microscopicamente sob iluminação de fluorescência. Esta técnica permite a quantificação precisa da comunicação da junção comunicativa. Além disso, pode ser usado para a introdução de peptídeos ou outras moléculas não permeadas, e a transferência de pequenos peptídeos eletroporados através de junções comunicantes para inibir o sinal nas células adjacentes não eletroporosas é uma demonstração poderosa de inibição de sinal.

A Figura 2 mostra as células epiteliais de fígado de rato 22 T51B, electroporadas com LY e fotografadas sob fluorescência (painel A e B) ou de contraste de fase (C), na sequência de fixação de iluminação e de lavar roupa. No painel A, a borda da área de electroporação é marcado a vermelho. O gradiente de fluorescência para a direita da linha vermelha indica a transferência através de junções de hiato. Na Figura 3A e 3B, a quantificação da comunicação por junç...

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

A eletroporação é uma técnica na qual uma corrente elétrica é aplicada a células vivas para abrir poros transitórios na membrana celular. Através desses poros, corantes e outras moléculas que normalmente não atravessam a membrana celular podem entrar na célula; os poros se fecham rapidamente, sem causar danos à célula. Descreveremos como células aderidas podem ser eletroporadas enquanto crescem em uma lâmina revestida parcialmente com um material condutor de eletricidade e transparente.O material é o óxido de índio-estanho, e como ele conduz corrente elétrica, abre poros que permitem a entrada de um corante na célula. Em seguida, é possível verificar se as células possuem junções comunicantes ou não, e quantas junções comunicantes existem. Esses pequenos canais conectam os interiores de células vizinhas e permitem a passagem de moléculas pequenas. Há muito tempo se reconhece que a comunicação por junções comunicantes tem diversas funções importantes na célula, incluindo a transformação neoplásica e a metástase.Bem-vindo a esta apresentação de projetos celulares sobre como realizar eletroporação de células aderentes utilizando o Insitu. Esta imagem mostra o que será possível fazer: o corante fluorescente de cor amarela foi introduzido em células cultivadas sobre um vidro transparente e condutivo. Até esta linha, a linha é mais fácil de visualizar em contraste de fase.Aqui está. Pode-se observar que o corante difundiu-se através das junções comunicantes das células à esquerda, que foram carregadas com corante por eletroporação, para as células à direita. Resultando neste gradiente de fluorescência, as células são tripsinas.Em seguida, as células são transferidas para um tubo e centrifugadas. É muito importante que as células se espalhem bem, pois crescem na câmara. Por esse motivo, é melhor centrifugar as células para remover qualquer traço de tripsina.O meio com traços de tripsina é aspirado, as células são ressuspendidas em aproximadamente um mililitro de meio de crescimento e então semeadas na câmara. A pipeta contém a suspensão celular; remova a tampa da câmara e pipete as células gota a gota dentro da câmara para facilitar o transporte. A câmara é colocada em uma placa de Petri de seis centímetros.A câmara retorna à incubadora para que as células cresçam. As células plaqueadas se espalharão bem e crescerão até entrarem em contato umas com as outras e formarem junções comunicantes. Quando as células estiverem prontas para a eletroporação, configure o gerador de pulsos in situ nas condições desejadas.Consulte o manual para obter a descrição do processo simples de configuração. Quando a tensão no insitu for ajustada, a luz vermelha no teclado acenderá. Retire os dois frascos aquecidos de DMEM sem cálcio do banho-maria: um é DMEM sem cálcio, mas com soro dialisado, e o outro é DMEM.Sem cálcio, tenha as pipetas prontas com carga mais solta para amarelo no pipetador. Em vez do suspiro, retire as células do incubador. Remova o meio invertendo-o inicialmente no béquer de lavagem.Em seguida, aplique suavemente uma vez sobre o tecido com DMEM sem cálcio, sem tentar remover completamente todo o DMEM, pois as células podem secar. Adicione cuidadosamente o amarelo de luciferina sobre a barreira, de modo a não perturbar as células, mas com rapidez suficiente para que as células não sequem. Utilize 200 microlitros para cada metade da câmara.Coloque a tampa na câmara de insitu, depois carregue-a no porta-amostras. Certifique-se de que as abas na extremidade da câmara encaixam nas ranhuras do porta-amostras empurrando-o. Insira a câmara no suporte da câmara.Pressione o botão de pulso no teclado do gerador de pulsos. O LED no gerador de pulsos e no suporte da câmara piscará em vermelho durante o processo de eletroporação e, em seguida, piscará em verde para indicar que o ciclo de init foi concluído. Puxe o cursor de volta para baixo do suporte da câmara e remova a câmara.Aspire a maior parte do amarelo de luciferina para reutilizá-lo, mas tenha cuidado para não secar as células. Adicione DMEM sem cálcio. Com soro dialisado, o soro ajuda a fechar os poros; a câmara volta para o incubador para que ocorra a transferência do amarelo de luciferina através das junções comunicantes.O tempo deve ser consistente de experimento para experimento. O padrão é três minutos. Despeje o meio no béquer de resíduos.Adicione solução fixadora de formaldeído a 4% com uma pipeta ou bastão, espere à temperatura ambiente por pelo menos dois minutos. Descarte o formaldeído e lave algumas vezes. Como as células estão fixadas ao vidro com PBS, há pouco risco de elas se desprendem durante a lavagem.Para conseguir visualizar as células em contraste de fase, é importante colocar uma lamínula sobre a câmara. Encha a câmara com PBS, formando um menisco saliente. Evitando bolhas de ar, coloque a lamínula.Não se preocupe se o PBS transbordar. Basta absorver o excesso de PBS com papel absorvente. Você precisará de um microscópio fluorescente invertido, preferencialmente com contraste de fase e com um bloco de filtros para amarelo de luciferina. Em contraste de fase, procure a borda da área eletroporada.Você verá duas linhas sob fluorescência nas células. Na metade da lâmina, haverá fluorescência intensa. A linha mais próxima das células brilhantes corresponde à borda da área eletroporada.Qualquer fluorescência adicional é devida à transferência de lucifer yellow através das junções comunicantes. Por exemplo, esta imagem de células epiteliais mostra células que foram eletroporadas no lado esquerdo da imagem, transferindo o lucifer yellow para células vizinhas não eletroporadas, criando um gradiente de células fluorescentes a partir da borda do revestimento condutivo em direção à direita. Esta imagem mostra o mesmo campo de células em contraste de fase.Observe que é possível ver a linha X com muita clareza. Uma medida quantitativa da quantidade de transferência por junções comunicantes ocorrida pode ser realizada manualmente trabalhando com as imagens de fluorescência e de contraste de fase das células eletroporadas. As estrelas ao longo da borda da área condutora são consideradas células doadoras.Eles foram eletroporados e absorveram o gene para a cor amarela. Transmitem luc para a cor amarela a células vizinhas à direita, que o repassam adiante. Ainda mais longe, em quantidades decrescentes.A razão entre os pontos e as estrelas, 41 para oito neste caso, pode gerar um número para comparar o quão extensa é a transferência por junções comunicantes neste caso. 5,1 é o índice de junção comunicante. Uma alternativa à marcação e contagem manual de células é o uso de software de análise de imagem para medir as quantidades relativas de fluorescência ao longo do lado não eletroporado da borda de uma célula eletroporada.Essas células não possuem junções comunicantes. Aqui está a borda direita da área eletroporada. Observe que não há gradiente de fluorescência, o que indica a ausência de junções comunicantes sob contraste de fase.Você pode ver claramente todas as células. Observe que a linha X também é claramente visível. Neste exemplo.Todas as células na câmara foram estimuladas com fator de crescimento epidérmico EGF e, 10 minutos depois, fixadas e submetidas à detecção de phospho arc. Observe que as células coradas à direita não foram eletroporadas, enquanto as células à esquerda até esta linha foram eletroporadas. As células não eletroporadas apresentam coloração marrom com um anticorpo phospho irk e imunoperoxidase.As células eletroporadas não apresentam coloração, pois o peptídeo fosforilado eletroporado bloqueou o domínio SSH dois da grab dois e inibiu a fosforilação de EGF pela irk. Observe a região de três a quatro comprimentos celulares à direita da linha, onde as células ainda não foram eletroporadas, mas também não apresentam coloração. Essas são células que adquiriram o peptídeo bloqueador de suas vizinhas eletroporadas por meio de junções comunicantes.Esta é a demonstração mais poderosa possível de que a inibição do sinal deve-se ao peptídeo e não pode ser um artefato da eletroporação. Como essas células não foram eletroporadas, este é o mesmo quadro mostrado em contraste de fase. Observe a ausência de qualquer alteração na morfologia após a eletroporação.Em alguns pacientes, a comunicação por junções de escape pode ser quantificada com precisão em uma grande variedade de células cultivadas. A introdução de peptídeos para interromper vias de sinalização específicas é uma abordagem poderosa para avaliar a relevância em células vivas de interações proteína-proteína que foram identificadas com proteínas purificadas. Isso pode ser o primeiro passo importante no desenvolvimento de medicamentos peptídicos.

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Research

JoVE Journal

Biology

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