Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

A eletroporação é uma técnica na qual uma corrente elétrica é aplicada a células vivas para abrir poros transitórios na membrana celular. Através desses poros, corantes e outras moléculas que normalmente não atravessam a membrana celular podem entrar na célula; os poros se fecham rapidamente, sem causar danos à célula. Descreveremos como células aderidas podem ser eletroporadas enquanto crescem em uma lâmina revestida parcialmente com um material condutor de eletricidade e transparente.

O material é o óxido de índio-estanho, e como ele conduz corrente elétrica, abre poros que permitem a entrada de um corante na célula. Em seguida, é possível verificar se as células possuem junções comunicantes ou não, e quantas junções comunicantes existem. Esses pequenos canais conectam os interiores de células vizinhas e permitem a passagem de moléculas pequenas. Há muito tempo se reconhece que a comunicação por junções comunicantes tem diversas funções importantes na célula, incluindo a transformação neoplásica e a metástase.

Bem-vindo a esta apresentação de projetos celulares sobre como realizar eletroporação de células aderentes utilizando o Insitu. Esta imagem mostra o que será possível fazer: o corante fluorescente de cor amarela foi introduzido em células cultivadas sobre um vidro transparente e condutivo. Até esta linha, a linha é mais fácil de visualizar em contraste de fase.

Aqui está. Pode-se observar que o corante difundiu-se através das junções comunicantes das células à esquerda, que foram carregadas com corante por eletroporação, para as células à direita. Resultando neste gradiente de fluorescência, as células são tripsinas.

Em seguida, as células são transferidas para um tubo e centrifugadas. É muito importante que as células se espalhem bem, pois crescem na câmara. Por esse motivo, é melhor centrifugar as células para remover qualquer traço de tripsina.

O meio com traços de tripsina é aspirado, as células são ressuspendidas em aproximadamente um mililitro de meio de crescimento e então semeadas na câmara. A pipeta contém a suspensão celular; remova a tampa da câmara e pipete as células gota a gota dentro da câmara para facilitar o transporte. A câmara é colocada em uma placa de Petri de seis centímetros.

A câmara retorna à incubadora para que as células cresçam. As células plaqueadas se espalharão bem e crescerão até entrarem em contato umas com as outras e formarem junções comunicantes. Quando as células estiverem prontas para a eletroporação, configure o gerador de pulsos in situ nas condições desejadas.

Consulte o manual para obter a descrição do processo simples de configuração. Quando a tensão no insitu for ajustada, a luz vermelha no teclado acenderá. Retire os dois frascos aquecidos de DMEM sem cálcio do banho-maria: um é DMEM sem cálcio, mas com soro dialisado, e o outro é DMEM.

Sem cálcio, tenha as pipetas prontas com carga mais solta para amarelo no pipetador. Em vez do suspiro, retire as células do incubador. Remova o meio invertendo-o inicialmente no béquer de lavagem.

Em seguida, aplique suavemente uma vez sobre o tecido com DMEM sem cálcio, sem tentar remover completamente todo o DMEM, pois as células podem secar. Adicione cuidadosamente o amarelo de luciferina sobre a barreira, de modo a não perturbar as células, mas com rapidez suficiente para que as células não sequem. Utilize 200 microlitros para cada metade da câmara.

Coloque a tampa na câmara de insitu, depois carregue-a no porta-amostras. Certifique-se de que as abas na extremidade da câmara encaixam nas ranhuras do porta-amostras empurrando-o. Insira a câmara no suporte da câmara.

Pressione o botão de pulso no teclado do gerador de pulsos. O LED no gerador de pulsos e no suporte da câmara piscará em vermelho durante o processo de eletroporação e, em seguida, piscará em verde para indicar que o ciclo de init foi concluído. Puxe o cursor de volta para baixo do suporte da câmara e remova a câmara.

Aspire a maior parte do amarelo de luciferina para reutilizá-lo, mas tenha cuidado para não secar as células. Adicione DMEM sem cálcio. Com soro dialisado, o soro ajuda a fechar os poros; a câmara volta para o incubador para que ocorra a transferência do amarelo de luciferina através das junções comunicantes.

O tempo deve ser consistente de experimento para experimento. O padrão é três minutos. Despeje o meio no béquer de resíduos.

Adicione solução fixadora de formaldeído a 4% com uma pipeta ou bastão, espere à temperatura ambiente por pelo menos dois minutos. Descarte o formaldeído e lave algumas vezes. Como as células estão fixadas ao vidro com PBS, há pouco risco de elas se desprendem durante a lavagem.

Para conseguir visualizar as células em contraste de fase, é importante colocar uma lamínula sobre a câmara. Encha a câmara com PBS, formando um menisco saliente. Evitando bolhas de ar, coloque a lamínula.

Não se preocupe se o PBS transbordar. Basta absorver o excesso de PBS com papel absorvente. Você precisará de um microscópio fluorescente invertido, preferencialmente com contraste de fase e com um bloco de filtros para amarelo de luciferina. Em contraste de fase, procure a borda da área eletroporada.

Você verá duas linhas sob fluorescência nas células. Na metade da lâmina, haverá fluorescência intensa. A linha mais próxima das células brilhantes corresponde à borda da área eletroporada.

Qualquer fluorescência adicional é devida à transferência de lucifer yellow através das junções comunicantes. Por exemplo, esta imagem de células epiteliais mostra células que foram eletroporadas no lado esquerdo da imagem, transferindo o lucifer yellow para células vizinhas não eletroporadas, criando um gradiente de células fluorescentes a partir da borda do revestimento condutivo em direção à direita. Esta imagem mostra o mesmo campo de células em contraste de fase.

Observe que é possível ver a linha X com muita clareza. Uma medida quantitativa da quantidade de transferência por junções comunicantes ocorrida pode ser realizada manualmente trabalhando com as imagens de fluorescência e de contraste de fase das células eletroporadas. As estrelas ao longo da borda da área condutora são consideradas células doadoras.

Eles foram eletroporados e absorveram o gene para a cor amarela. Transmitem luc para a cor amarela a células vizinhas à direita, que o repassam adiante. Ainda mais longe, em quantidades decrescentes.

A razão entre os pontos e as estrelas, 41 para oito neste caso, pode gerar um número para comparar o quão extensa é a transferência por junções comunicantes neste caso. 5,1 é o índice de junção comunicante. Uma alternativa à marcação e contagem manual de células é o uso de software de análise de imagem para medir as quantidades relativas de fluorescência ao longo do lado não eletroporado da borda de uma célula eletroporada.

Essas células não possuem junções comunicantes. Aqui está a borda direita da área eletroporada. Observe que não há gradiente de fluorescência, o que indica a ausência de junções comunicantes sob contraste de fase.

Você pode ver claramente todas as células. Observe que a linha X também é claramente visível. Neste exemplo.

Todas as células na câmara foram estimuladas com fator de crescimento epidérmico EGF e, 10 minutos depois, fixadas e submetidas à detecção de phospho arc. Observe que as células coradas à direita não foram eletroporadas, enquanto as células à esquerda até esta linha foram eletroporadas. As células não eletroporadas apresentam coloração marrom com um anticorpo phospho irk e imunoperoxidase.

As células eletroporadas não apresentam coloração, pois o peptídeo fosforilado eletroporado bloqueou o domínio SSH dois da grab dois e inibiu a fosforilação de EGF pela irk. Observe a região de três a quatro comprimentos celulares à direita da linha, onde as células ainda não foram eletroporadas, mas também não apresentam coloração. Essas são células que adquiriram o peptídeo bloqueador de suas vizinhas eletroporadas por meio de junções comunicantes.

Esta é a demonstração mais poderosa possível de que a inibição do sinal deve-se ao peptídeo e não pode ser um artefato da eletroporação. Como essas células não foram eletroporadas, este é o mesmo quadro mostrado em contraste de fase. Observe a ausência de qualquer alteração na morfologia após a eletroporação.

Em alguns pacientes, a comunicação por junções de escape pode ser quantificada com precisão em uma grande variedade de células cultivadas. A introdução de peptídeos para interromper vias de sinalização específicas é uma abordagem poderosa para avaliar a relevância em células vivas de interações proteína-proteína que foram identificadas com proteínas purificadas. Isso pode ser o primeiro passo importante no desenvolvimento de medicamentos peptídicos.