Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

A eletroporação é uma técnica em que uma corrente elétrica é aplicada às células vivas para abrir poros transitórios na membrana celular. Através desses poros, corantes e outras moléculas que normalmente não atravessam a membrana celular podem entrar na célula, os poros se fecham rapidamente, sem danos à célula. Descreveremos como as células aderentes podem ser eletroporadas à medida que crescem em uma lâmina que é revestida em parte com material eletricamente condutor e transparente.

O material é óxido de índio e estanho e, à medida que conduz corrente elétrica, abre poros que permitem que um corante entre na célula. Em seguida, é possível examinar se as células têm junções comunicantes ou não, e quantas junções comunicantes são pequenos canais que conectam o interior das células vizinhas e permitem a passagem de pequenas moléculas. Há muito se reconhece que a comunicação da junção gap tem uma variedade de funções importantes na célula, incluindo transformação neoplásica e metástase.

Bem-vindo a esta apresentação de projetos de células sobre como realizar a eletroporação de células aderentes usando o Insitu. Esta imagem mostra, o que poderemos fazer, que o corante fluorescente solto para amarelo foi introduzido nas células que crescem em um vidro transparente e condutor. Até esta linha, a linha é mais fácil de ver sob contraste de fase.

Aqui está. Você pode ver que o corante se difundiu através de junções comunicantes das células à esquerda, que foram carregadas com corante por eletroporação para as células à direita. Resultando neste gradiente de células de fluorescência são trips.

Inizado então transferido para um tubo na centrífuga. É muito importante que as células estejam bem espalhadas à medida que crescem na câmara. Por esse motivo, é melhor centrifugar as células para remover quaisquer vestígios de tripsina.

O meio com traços de tripsina é aspirado das células, ressuspenso em aproximadamente um mililitro de meio de crescimento e, em seguida, semeado na câmara. A pipeta contém a suspensão celular, remova a tampa da câmara e pipete as células gota a gota para dentro da câmara para facilitar o transporte. A câmara é colocada em uma placa de Petri de seis centímetros.

A câmara volta para a incubadora para que as células cresçam. As células replaqueadas se espalharão bem e crescerão para se tocar e formar junções comunicantes. Quando as células estiverem prontas para eletro parade, ajuste o gerador de pulso in situ para as condições desejadas.

Consulte o manual para obter uma descrição do processo de configuração simples. Quando a tensão no insitu é definida, a luz vermelha no teclado acende. Retire do banho-maria os dois frascos aquecidos de DMEM sem cálcio, um é DMEM sem cálcio, mas com soro dialisado, e o outro é DMEM.

Sem cálcio, tenha as pipetas prontas para carregar mais soltas para amarelo na pipetadora. Em vez do suspiro, retire as células da incubadora. Remova o meio invertendo-o primeiro no copo de lavagem.

Em seguida, esfregando-o no tecido, lave uma vez com DMEM sem cálcio, não tente remover absolutamente todo o DMEM, pois as células podem secar. Adicione o amarelo de Lúcifer com cuidado na barreira para não perturbar as células, mas com rapidez suficiente para que as células não sequem. Use 200 microlitros para cada metade da câmara.

Coloque a tampa na câmara in-situ e, em seguida, carregue-a no controle deslizante. Certifique-se de que as abas finais da câmara se encaixem nas ranhuras do controle deslizante empurrando o controle deslizante. Insira a câmara no suporte da câmara.

Pressione o botão de pulso no teclado do gerador de pulso. O LED no gerador de pulsos e no suporte da câmara piscará em vermelho durante o processo de eletroporação e, em seguida, piscará em verde para indicar que o ciclo de inicialização está completo. Puxe o controle deslizante de volta para baixo do suporte da câmara e remova a câmara.

Aspire a maior parte do amarelo Lúcifer para usá-lo novamente, mas tome cuidado para não secar as células. Adicione DMEM sem cálcio. Com o soro dialisado, o soro ajuda o poroso a fechar a câmara volta para a incubadora para que a transferência do amarelo de Lúcifer através das junções comunicantes aconteça.

O tempo deve ser consistente de experimento para experimento. O padrão é de três minutos. Despeje o meio no copo de resíduos.

Adicione a solução fixadora de formaldeído a 4% com uma pasta ou pipeta, aguarde em temperatura ambiente por pelo menos dois minutos. Despeje o formaldeído e enxágue algumas vezes. Com o PBS, as células são fixadas ao vidro, portanto, há pouco perigo de se soltarem durante a lavagem.

Para poder ver as células sob contraste de fase, é importante colocar uma lamínula no topo da câmara. Encha a câmara com PBS formando um menisco orgulhoso. Evitando bolhas de ar, coloque a lamínula.

Não se preocupe se o PBS transbordar Basta absorver o PBS extra no tecido. Você precisa de um microscópio fluorescente invertido, de preferência com contraste de fase e com um bloco de filtro para amarelo de Lúcifer. Sob contraste em fases, procure a borda da área eletroporada.

Você verá duas linhas em células de fluorescência. Na metade da lâmina estará fluorescendo intensamente. A linha mais próxima das células brilhantes é a borda da área eletroporada.

Qualquer fluorescência além disso é devido à transferência de amarelo lúcido através de junções comunicantes. Por exemplo, esta imagem de células epiteliais mostra células que foram eletro no lado esquerdo da imagem, transferindo amarelo de Lúcifer para células vizinhas não eletroporadas, criando um gradiente de células brilhantes da borda do revestimento condutor para a direita. Esta imagem mostra o mesmo quadro de células sob contraste de fase.

Observe que você pode ver a linha X com muita clareza. Uma medida quantitativa de quanta transferência de junção gap ocorreu pode ser feita manualmente, trabalhando com as imagens fluorescentes e de contraste de fase de células eletroporadas. As estrelas ao longo da borda da área condutora são consideradas células doadoras.

Eles foram eletroporados e soltos para o amarelo. Eles passam luc por amarelo para as células vizinhas à direita, que o transmitem. Ainda mais em quantidades decrescentes.

A proporção dos pontos para as estrelas 41 para oito, neste caso, pode produzir um número para comparar a extensão da transferência da junção comunicante neste caso. 5.1 é o índice da junção comunicante. Uma alternativa à marcação e contagem manual de células é usar um software de análise de imagem para medir as quantidades relativas de brilho ao longo do lado não eleito de uma borda de célula eletroporada.

Essas células não possuem junções comunicantes. Aqui está a borda direita da área eletroporada. Observe que não há gradiente de fluorescência, o que indica a ausência de junções comunicantes sob contraste de fase.

Você pode ver claramente todas as células. Observe que a linha X também é claramente visível. Neste exemplo.

Todas as células da câmara foram estimuladas com fator de crescimento epidérmico EGF e, 10 minutos depois, fixadas e sondadas para arco fosfográfico. Observe que as células coradas à direita não foram eletroporadas e as células à esquerda até esta linha foram eletroporadas. As células não eletroporadas mostram coloração marrom com um anticorpo fosfo-irk e imunoperoxidase.

As células eletroporadas não mostram coloração, pois o peptídeo fosfotérmico eletroporado bloqueou o domínio SSH dois da garra dois e inibiu a fosforilação irk do EGF. Observe a região de três a quatro células de comprimento à direita da linha onde as células não eram eletro, mas não mostram coloração. Estas são células que adquiriram peptídeos bloqueadores de seus vizinhos eletroporados por meio de junções comunicantes.

Esta é a demonstração mais poderosa possível de que a inibição do sinal deve ser devida ao peptídeo e não pode ser um artefato de eletroporação. Como essas células não são eletroporadas, este é o mesmo quadro mostrado sob contraste de fase. Observe a ausência de qualquer alteração na morfologia após a eletroporação.

Com alguns pacientes, a comunicação juncional gap pode ser quantitativa precisamente em uma grande variedade de células cultivadas. A introdução de peptídeos para interromper vias de sinalização específicas é uma abordagem poderosa para avaliar a relevância em células vivas de proteínas, interações proteicas que foram identificadas com proteínas purificadas. Este pode ser o primeiro passo importante no desenvolvimento de medicamentos peptídicos em cúpula.