Calculando a média de Viral glicoproteína do envelope Spikes de Electron Cryotomography reconstruções com Jsubtomo

O objetivo geral deste procedimento é estudar as estruturas de complexos de glicoproteínas presentes nas superfícies de vírus envelopados. Isso é realizado primeiramente localizando as partículas virais nos volumes tomográficos previamente calculados a partir de dados de microscopia crioeletrônica. O segundo passo consiste em criar dois modelos iniciais estatisticamente independentes dos complexos de glicoproteínas utilizando um subconjunto de dados definido manualmente.

Em seguida, esses modelos são aprimorados e utilizados para detectar automaticamente todos os complexos de glicoproteínas nas partículas virais. O passo final consiste em refinar a estrutura do complexo de glicoproteínas utilizando o conjunto completo de dados. Por fim, ferramentas de visualização molecular são utilizadas para interpretar a estrutura final.

A análise estrutural tridimensional desses picos glicoproteicos é inestimável para a compreensão da patogênese viral, bem como para o desenvolvimento de fármacos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a cristalografia de raios X, é que ela permite resolver estruturas de proteínas de membrana no ambiente natural da membrana. Esta técnica pode auxiliar no estudo de tópicos fundamentais na biologia estrutural.

Por exemplo, a estrutura de muitos vírus que contêm membrana. Embora esta técnica possa fornecer informações sobre complexos de glicoproteínas nesses vírus, ela também pode ser aplicada a outros sistemas, como proteínas de membrana incorporadas em lipossomos. O procedimento será demonstrado por dois membros do meu grupo, Slee e David Bittel.

Para começar, abra um arquivo de autograma no B show. Selecione manualmente as partículas virais nos gramas definindo a coordenada central de uma partícula viral usando a ferramenta de seleção de partículas. Repita este passo até que todas as variantes tenham sido processadas.

Salve as coordenadas do vírus em um arquivo star. Prossiga para repetir este processo para todos os tomos. Em seguida, execute o J sub tomo py no modo de extração para extrair as subvolumes variáveis em arquivos de volume individuais, utilizando os arquivos star salvos como arquivos de entrada para gerar dois modelos iniciais independentes.

Primeiro, abra o arquivo do mapa de subvolume ovariano. Em B, mostre. Selecione um subconjunto de picos nos subvolumes Varian definindo a coordenada central de um pico usando a ferramenta de seleção de partículas acessível pela janela da caixa de ferramentas.

Repita este passo até que todos os picos claramente distintos tenham sido processados. Salve as coordenadas dos picos em um arquivo star. Repita este passo até que aproximadamente 200 picos de glicoproteínas tenham sido processados.

Após atribuir as vistas aos varians conforme descrito no protocolo textual, crie uma máscara no espaço real usando o J sub tomo Create mask py. Em seguida, gere uma máscara no espaço recíproco usando o J sub tomo create wedge mask py.

A máscara do espaço recíproco é usada para excluir regiões na área do cunho ausente, resultante da coleta de dados tomográficos de eixo único. Em seguida, crie duas médias iniciais usando o J.Sub tomo para gerar médias. PY usando um arquivo de seleção salvo como arquivo de entrada.

Utilize a iteração para reduzir o ruído nas médias iniciais, alinhando e fazendo a média iterativamente dos dois modelos previamente gerados com o J sub-tomograma iteração gold PY. Detalhes para ambas as etapas deste processo podem ser encontrados no protocolo textual. Avalie o grau de simetria na estrutura examinando o arquivo do mapa resultante filtrado por passagem baixa no kyira. Por exemplo, se a espícula for um complexo trimérico, deve ser evidente uma simetria tripla.

Continue o refinamento da estrutura conforme detalhado no protocolo textual. Em seguida, gere sementes localizadas uniformemente na superfície da Varian para correspondência de modelo e atribua um vetor de visão inicial às sementes executando o JVs py. Use os arquivos star previamente gerados como arquivos de entrada para gerar aproximadamente 1,5 vez mais sementes do que o número esperado de espículas.

Esse vetor de visualização aproxima a direção do pico mais próximo de cada ponto semente. Em seguida, gere duas médias independentes da superfície do vírus como antes. Depois refine a posição das sementes conforme detalhado no protocolo textual.

Finalmente, gere arquivos de marcador com dos arquivos star de sementes refinados usando jvs.py. Examine as sementes abrindo os arquivos CMM e os arquivos de mapa de virion associados. Em kyira.

Certifique-se de que as sementes refinadas estejam alinhadas corretamente em relação à membrana viral. Os marcadores refinados podem ser coloridos com base em seus coeficientes de correlação cruzada para localizar automaticamente todas as espículas nos subvolumes Varian utilizando correspondência local de modelos ao redor das sementes refinadas, alinhar e média as espículas localizadas, usar as médias geradas a partir de um subconjunto de espículas selecionadas manualmente como modelos iniciais. Detalhes adicionais sobre este processo podem ser encontrados no protocolo textual. Para visualizar os resultados, abra a estrutura refinada da espícula no kyira para visualização.

Prossiga para ajustar as estruturas atômicas. Em seguida, crie um modelo composto do virion usando j Subo Create model DO py. Por fim, abra o modelo composto para visualização no kyira.

O modelo inicial foi refinado utilizando 205 espículas selecionadas manualmente. Três vezes. A simetria da espícula mais central foi evidente sem a aplicação de qualquer simetria e foi imposta nas rodadas subsequentes de refinamento para detectar todas as espículas manualmente nas superfícies varianas. Foram geradas 106 sementes para cada víon no raio de 43 nanômetros e espaçamento de 20 graus, e suas posições foram refinadas iterativamente em relação à membrana.

Os melhores fragmentos de glicoproteínas em forma de espiga correlacionados foram utilizados para calcular a média final. A média foi resolvida com uma resolução de 35 angstrom. Revelou uma estrutura trimerizada de espiga no centro, além de algumas contribuições de seis espigas vizinhas.

Modelos compostos das varis calculados mediante o posicionamento da estrutura nas posições conhecidas revelaram a localização dos espinhos na superfície da Varian. Ocasionalmente, eram evidentes manchas localmente ordenadas de espinhos. Ao tentar este procedimento, é importante utilizar apenas os melhores dados e verificar cuidadosamente todos os resultados intermediários.

Após seguir este procedimento, estruturas de cristalografia de raios X podem ser ajustadas à média final para obter uma visão mais precisa das interações proteína-proteína. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como calcular a média de estruturas de glicoproteínas do envelope viral utilizando o J Omo.