Name: Calculando a média de Viral glicoproteína do envelope Spikes de Electron Cryotomography reconstruções com Jsubtomo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a determinar estruturas de complexos de glicoproteínas virais usando criotomografia eletrônica e subtomograma médio com Jsubtomo. Esta técnica computacional permite visualizar spikes de envelope em vírus para estudos de patogênese e design de fármacos.

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Este trabalho foi apoiado pela Academia da Finlândia (130750 e 218080 para J.T.H.), o Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z para T.A.B.), e pelo MRC (MR/J007897/1 para J.T.H e T.A.B; MR / L009528 / 1 para T.A.B.).

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

<html> O conhecimento da estrutura de glicoproteína pico viral no virião membrana é essencial para a replicação do vírus a compreensão e desenvolver agentes terapêuticos para tratar e prevenir a infecção. Electron crio-microscopia combinado com média única partícula surgiu como o método mais utilizado para resolver as estruturas de partículas de vírus envelopados, incluindo os picos de glicoproteínas. No entanto, este método está limitado a icosahedrally vírus simétricas. Aqui, através da aplicação da eletrônica de crio-tomografia e subtomogram médias na Jsubtomo, nós descrevemos um protocolo geral para determinar pontos de glicoproteínas em pleomorphic envolto vírus que não são passíveis de outros métodos de biologia estrutural atuais. Nossos resultados representativos demonstrar que a resolução deste método é suficiente para revelar insights sobre arquitetura de domínio, oligomerização e maior organização a fim de spikes glicoproteína em virions intactas. jove_content &quot;&gt; O passo mais importante dentro deste protocolo está construindo dois modelos de partida de confiança que são estatisticamente independentes uma da outra execução. bem-sucedida desta etapa pressupõe que os picos de glicoproteínas são suficientemente grandes e não embalados uns contra os outros com muita força, de modo que os picos individuais podem ser visualmente reconhecido e manualmente pegou no tomografias, e dois modelos independentes média. Se isso não for possível, duas modificações no protocolo pode ser tentada. Primeiro, dois modelos aleatórias independentes pode ser construído definindo primeiro dois subconjuntos aleatórios de subtomograms e depois média das subtomograms dentro destes subconjuntos 30. Em segundo lugar, se uma estrutura do pico isolado foi obtido por outros meios, por exemplo por cristalografia de raios-X, que pode ser utilizado como um modelo de partida. No entanto, deve ser tomado cuidado para baixo teor Filtro passa este modelo usando uma baixa resolução de corte (50-70 Å), como os dois modelos resultantes na próxima rodada de refinamento iráser estatisticamente independentes para além desse resolução. Devido a esta ressalva, é recomendável a abordagem anterior. A resolução obtida a partir deste protocolo depende de quatro fatores principais: i. estratégia de recolha de dados e a qualidade dos dados de entrada, ii. número das subtomograms, iii. a precisão do alinhamento das subtomograms, e iv. heterogeneidade das estruturas. Embora a primeira e segunda limitação pode ser largamente ultrapassado usando detectores de sinal de alta-ruído directa de electrões, combinados com CTF corrigido tomografia e recolha automática de dados, a precisão do alinhamento é mais afectada pelo tamanho e forma da estrutura do próprio interesse. Ao aplicar este protocolo em pequenas pontas que faltam características proeminentes, pode ser vantajoso para ligar fragmentos Fab para o pico para melhorar a precisão do alinhamento e, portanto, resolução 31. Finalmente, se as estruturas a serem médios exibem várias conformações, sub-Tomogrmétodos de classificação am pode ser utilizado para calcular a média conformações diferentes separadamente. Para o efeito, Jsubtomo integra com o pacote Dynamo, oferecendo classificação poderoso subtomogram 9. O protocolo anterior é complementar a cristalografia de raios-X de glicoproteínas virais isoladas. Estruturas cristalográficas pode ser montada em médias de sub-tomogram para obter a orientação precisa da glicoproteína com respeito à membrana viral. A aplicação desta metodologia, sem dúvida, continuar a lançar luz sobre a estrutura do vírus envelopado e pathobiology.

Crio-tomografia de electrões é uma técnica de imagiologia de electrões crio-microscopia permitindo o cálculo de uma (3D) a reconstrução tridimensional de amostras biológicas complexas. Amostras adequadas variam de complexos purificados macromoleculares 1, filamentos 2, vesículas revestidas 3 e vírus membrana pleomórficos 4 para células procariotas todo 5 e até áreas finas de células eucarióticas inteiros 6. Após a coleta de dados de uma série de inclinação, os volumes de tomografia 3D, ou tomografias, pode ser calculado utilizando vários pacotes de software estabelecidos, incluindo bsoft 7 e 8 Imod. Dois aspectos inerentes ao estudo de amostras biológicas por limite de electrões crio-tomografia a interpretação biológica dos volumes tomográficos correspondentes. Em primeiro lugar, devido à dose de electrões limitado que pode ser aplicado a materiais biológicos antes de introduzir os danos da radiação significativa, signal-ruído proporções em dados tomográficos são tipicamente muito baixos. Em segundo lugar, como resultado da geometria inclinação amostra limitada durante a coleta de dados, alguns pontos de vista do objeto permanecer ausente, levando a uma chamada artefato &#39;cunha perdido &quot;no volume tomográfica. No entanto, ambas as limitações podem ser superadas se o volume tomográfica contém repetição de estruturas idênticas, tais como complexos macromoleculares, que pode ser com sucesso em média 9-12. Antes da média de estruturas de reconstruções tomogram, objetos de interesse devem ser encontrados e alinhado com a mesma orientação. A localização das referidas estruturas pode ser obtida por correlação cruzada de uma estrutura de modelo no volume de tomografia por uma abordagem muitas vezes referida como modelo correspondente 13. O molde utilizado neste processo de harmonização pode ser derivada a partir de electrões ou microscopia crio-electrão crio-tomografia combinada com a reconstrução em 3D, ou pode ser um mapa de densidade de simuladouma estrutura atômica. Vários pacotes computacionais foram desenvolvidos para realizar estas tarefas 11. Calculando a média dos picos de glicoproteína do vírus de membrana, tal como o HIV-1, tem sido uma abordagem particularmente bem sucedido para o estudo da sua estrutura 14-16. Uma compreensão da estrutura é parte integrante para revelar tanto a base molecular das interações vírus-hospedeiro e orientar o desenvolvimento do projeto antiviral e vacina. Enquanto cristalografia de macromoléculas é a técnica preferida para a alta resolução (geralmente melhor do que 4 Â) a análise estrutural de glicoproteínas virais individuais e os seus complexos, as estruturas de raios-X resultantes deste método são de proteínas isoladas a partir do ambiente natural do membranoso virião . Deste modo, detalhes importantes, tais como a arquitectura de ordem superior de glicoproteínas virais, no contexto do virião, permanecem escassos. Por outro lado, de electrões e microscopia crio-reconstrução de partícula únicade vírus envelopados inteiras se restringe a partículas virais com simetria icosaédrica 17,18. Electron cryotomography combinado com alinhamento sub-volumes foi assim que surgiu como uma técnica complementar que permite o estudo de spikes glicoproteína de forma irregular, vírus pleomórficos in situ. Nós desenvolvemos software chamado Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) para a detecção, alinhamento e nivelamento de sub-volumes tomográficas. Jsubtomo tem sido utilizado na determinação da estrutura de um número de estruturas virais e celulares 19-26. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado, que permite a determinação de estruturas de pico viral de superfície. Para contornar o excesso de refinamento de estruturas em média, correlacionando ruído, o esquema de refinamento &#39;padrão-ouro&#39; é adotado 10,27. Por fim, são discutidas estratégias para a visualização e interpretação dos resultados típicos.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>Universidade de Oxford</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

calculando a média de viral glicoproteína do envelope spikes de electron cryotomography reconstruções com jsubtomo

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Vírus envelopados utilizar glicoproteínas da membrana na sua superfície para mediar a entrada nas células hospedeiras. Análise estrutural tridimensional dessas glicoproteína &#39;picos&#39; é muitas vezes um desafio técnico, mas importante para a compreensão da patogênese viral e na concepção de medicamentos. Aqui, um protocolo é apresentado para a determinação da estrutura viral pico através da média computacional de dados crio-tomografia eletrônica. Crio-tomografia eletrônica é uma técnica em microscopia eletrônica utilizada para obter reconstruções tridimensionais de tomografia de volume, ou tomografias, de espécimes biológicos pleomórficos, como vírus de membrana em um estado quase original, congelados hidratado. Estas radiografias revelam estruturas de interesse em três dimensões, embora com baixa resolução. Média Computacional de sub-volumes, ou sub-tomografias, é necessário obter maior detalhe resolução de repetir motivos estruturais, tais como picos de glicoproteínas virais. A abordagem computacional detalhado para aligning média e sub-tomografias utilizando o pacote de software Jsubtomo está delineado. Esta abordagem permite a visualização da estrutura de picos de glicoproteínas virais para uma resolução da ordem de 20-40 Å e estudo de estudo de interacções de ordem superior pico-a-pico na membrana viral. Os resultados típicos são apresentados por vírus Bunyamwera, um vírus com invólucro a partir da família Bunyaviridae. Esta família é um grupo estruturalmente diverso de patógenos que representam uma ameaça para a saúde humana e animal.

Nós demonstrar a aplicação do fluxo de trabalho média sub-tomograma descrito acima para a glicoproteína do envelope do vírus complexo Bunyamwera (Orthobunyavirus Bunyaviridae) utilizando dados publicados anteriormente definido 24. Recolha de dados e refinamento parâmetros listados na Tabela 1. Uma tomografia representativo é mostrado na Figura 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parâmetro (unidade) </td><td> Valor </td></tr><tr><td> A coleta de dados </td><td></td></tr><tr><td> Tensão (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Ampliação calibrado (X) </td><td> 111000 </td></tr><tr><td> O tamanho do pixel (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Dose estimada (e - / a 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (im) </td><td> 4,0-4,5 </td&gt; </tr><tr><td> Primeiro de zero CTF (A) um </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Faixa de inclinação (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Amostragem Tilt (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Dados e requinte </td><td></td></tr><tr><td> Tomogramas </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virions </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Sementes por virion </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Número total de sementes </td><td> 3074 </td></tr><tr><td> Spikes detectado </td><td> 1346 </td></tr><tr><td> Spikes após eliminar sobreposições </td><td> 1401 </td></tr><tr><td> Spikes após seleção com base correlação cruzada </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Spikes incluídos na média final </td><td> 1022 </td></tr><tr><td> Simetria </td><td> C3 </td></tr><tr><td> A amostragem angular (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Resoluçãogama utilizada no refinamento (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Estimativa resolução final (a) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: coleta de dados e estatísticas Bunyamwera refinamento. FTC, a função de transferência de contraste. b Calculado utilizando a correlação de shell Fourier entre duas estruturas de forma independente refinados em um limite de 0.143. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2:. Fatia através de uma tomografia de viriões Bunyamwera Diversas vistas laterais pico evidente na periferia de cada vírus são indicadas por pontas de seta. A tomografia tem sido baixa-pass filtrada a 60 Å. A barra de escala de 100 nm. Primeiro, temos refinado um modelo inicial usando 205 pontos escolhidos manualmente ( <strong&gt; A Figura 3). Simetria Trina do centro-maior pico foi evidente, sem aplicar qualquer simetria (Figura 3B) e foi imposta nas rodadas posteriores de refinamento (Figura 3C). Para a detecção de todos os picos automaticamente sobre as superfícies de virião, geramos 106 sementes para cada virião no raio de 43 nm e um espaçamento de 20 graus (Figura 4A) e iterativamente refinado suas posições em relação à membrana (Figura 4B). <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: O refinamento da estrutura do modelo inicial. (A) cilíndrica média (C100) modelo construído a partir de posições definidas manualmente de spikes. (B) densidade médio depois de cinco rodadas de refinamento sem qualquer simetria (C1) imposta exibe um pico com três dobrascaracterísticas simétricas. A resolução do modelo é de 48 Å. (C) Média do pico foi resolvido em 41 Å após cinco rodadas de refinamento com simetria tripla. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Refinamento das sementes AB) Um subconjunto de sementes antes (A) e após (B) requinte são mostrados em uma densidade virion na Figura 2 Sementes em (B) foram codificados por cores com base no respectivo cruzada. coeficientes de correlação (azuis, baixa correlação; vermelho, alta correlação). Os melhores correlacionando glicoproteína manchas Spike (75% superior após eliminar sobreposições; ~ 1.000 pontos) foram utilizados para calcular a média final. A média foi resolvido a 35 uma resolução (Figura 5). Ele revelou uma estrutura pico trimeric no meio, emAlém de alguma contribuição de seis picos vizinhos. Modelos compostos dos viriões, calculadas através da colocação da estrutura nas posições conhecidas, revelado colocação dos espigões na superfície do virião (Figura 6A). Ocasionalmente, patches de ordenados localmente de spikes eram evidentes (Figura 6B). <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5: estrutura refinada de um patch da camada de glicoproteína pico após casamento de modelos. (AB) Dois mapas &#39;even&#39; e &#39;estranho&#39;, de reconstrução de duas metades de os dados são mostrados. Os dois mapas mostram um notável grau de similaridade, verificando a válido até da abordagem. A orientação em torno do eixo longitudinal é diferente espiga como os dois mapas foram reconstruídos completamente independente um do outro. (C) Média dos dois mapas é mostrado naa resolução final de 35 Å. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6: Colocação dos picos sobre o virion Bunyamwera. (A) modelo composta de um viral. Exibir vetores (varas) indicam as orientações das espigas. As cores indicam a correlação cruzada entre cada ponto ea estrutura do modelo (azul, baixa correlação; vermelho, alta correlação). (B) Um close-up de um tapa-ordenada de spikes.

Uma abordagem é apresentada para determinar estruturas de complexos de glicoproteínas de membrana viral usando uma combinação de criotomografia eletrônica e média de subtomograma com o pacote computacional Jsubtomo.

Calculando a média de Viral glicoproteína do envelope Spikes de Electron Cryotomography reconstruções com Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as estruturas de complexos de glicoproteínas presentes nas superfícies de vírus envelopados. Isso é realizado primeiramente localizando as partículas virais nos volumes tomográficos previamente calculados a partir de dados de microscopia crioeletrônica. O segundo passo consiste em criar dois modelos iniciais estatisticamente independentes dos complexos de glicoproteínas utilizando um subconjunto de dados definido manualmente.Em seguida, esses modelos são aprimorados e utilizados para detectar automaticamente todos os complexos de glicoproteínas nas partículas virais. O passo final consiste em refinar a estrutura do complexo de glicoproteínas utilizando o conjunto completo de dados. Por fim, ferramentas de visualização molecular são utilizadas para interpretar a estrutura final.A análise estrutural tridimensional desses picos glicoproteicos é inestimável para a compreensão da patogênese viral, bem como para o desenvolvimento de fármacos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a cristalografia de raios X, é que ela permite resolver estruturas de proteínas de membrana no ambiente natural da membrana. Esta técnica pode auxiliar no estudo de tópicos fundamentais na biologia estrutural.Por exemplo, a estrutura de muitos vírus que contêm membrana. Embora esta técnica possa fornecer informações sobre complexos de glicoproteínas nesses vírus, ela também pode ser aplicada a outros sistemas, como proteínas de membrana incorporadas em lipossomos. O procedimento será demonstrado por dois membros do meu grupo, Slee e David Bittel.Para começar, abra um arquivo de autograma no B show. Selecione manualmente as partículas virais nos gramas definindo a coordenada central de uma partícula viral usando a ferramenta de seleção de partículas. Repita este passo até que todas as variantes tenham sido processadas.Salve as coordenadas do vírus em um arquivo star. Prossiga para repetir este processo para todos os tomos. Em seguida, execute o J sub tomo py no modo de extração para extrair as subvolumes variáveis em arquivos de volume individuais, utilizando os arquivos star salvos como arquivos de entrada para gerar dois modelos iniciais independentes.Primeiro, abra o arquivo do mapa de subvolume ovariano. Em B, mostre. Selecione um subconjunto de picos nos subvolumes Varian definindo a coordenada central de um pico usando a ferramenta de seleção de partículas acessível pela janela da caixa de ferramentas.Repita este passo até que todos os picos claramente distintos tenham sido processados. Salve as coordenadas dos picos em um arquivo star. Repita este passo até que aproximadamente 200 picos de glicoproteínas tenham sido processados.Após atribuir as vistas aos varians conforme descrito no protocolo textual, crie uma máscara no espaço real usando o J sub tomo Create mask py. Em seguida, gere uma máscara no espaço recíproco usando o J sub tomo create wedge mask py.A máscara do espaço recíproco é usada para excluir regiões na área do cunho ausente, resultante da coleta de dados tomográficos de eixo único. Em seguida, crie duas médias iniciais usando o J.Sub tomo para gerar médias. PY usando um arquivo de seleção salvo como arquivo de entrada.Utilize a iteração para reduzir o ruído nas médias iniciais, alinhando e fazendo a média iterativamente dos dois modelos previamente gerados com o J sub-tomograma iteração gold PY. Detalhes para ambas as etapas deste processo podem ser encontrados no protocolo textual. Avalie o grau de simetria na estrutura examinando o arquivo do mapa resultante filtrado por passagem baixa no kyira. Por exemplo, se a espícula for um complexo trimérico, deve ser evidente uma simetria tripla.Continue o refinamento da estrutura conforme detalhado no protocolo textual. Em seguida, gere sementes localizadas uniformemente na superfície da Varian para correspondência de modelo e atribua um vetor de visão inicial às sementes executando o JVs py. Use os arquivos star previamente gerados como arquivos de entrada para gerar aproximadamente 1,5 vez mais sementes do que o número esperado de espículas.Esse vetor de visualização aproxima a direção do pico mais próximo de cada ponto semente. Em seguida, gere duas médias independentes da superfície do vírus como antes. Depois refine a posição das sementes conforme detalhado no protocolo textual.Finalmente, gere arquivos de marcador com dos arquivos star de sementes refinados usando jvs.py. Examine as sementes abrindo os arquivos CMM e os arquivos de mapa de virion associados. Em kyira.Certifique-se de que as sementes refinadas estejam alinhadas corretamente em relação à membrana viral. Os marcadores refinados podem ser coloridos com base em seus coeficientes de correlação cruzada para localizar automaticamente todas as espículas nos subvolumes Varian utilizando correspondência local de modelos ao redor das sementes refinadas, alinhar e média as espículas localizadas, usar as médias geradas a partir de um subconjunto de espículas selecionadas manualmente como modelos iniciais. Detalhes adicionais sobre este processo podem ser encontrados no protocolo textual. Para visualizar os resultados, abra a estrutura refinada da espícula no kyira para visualização.Prossiga para ajustar as estruturas atômicas. Em seguida, crie um modelo composto do virion usando j Subo Create model DO py. Por fim, abra o modelo composto para visualização no kyira.O modelo inicial foi refinado utilizando 205 espículas selecionadas manualmente. Três vezes. A simetria da espícula mais central foi evidente sem a aplicação de qualquer simetria e foi imposta nas rodadas subsequentes de refinamento para detectar todas as espículas manualmente nas superfícies varianas. Foram geradas 106 sementes para cada víon no raio de 43 nanômetros e espaçamento de 20 graus, e suas posições foram refinadas iterativamente em relação à membrana.Os melhores fragmentos de glicoproteínas em forma de espiga correlacionados foram utilizados para calcular a média final. A média foi resolvida com uma resolução de 35 angstrom. Revelou uma estrutura trimerizada de espiga no centro, além de algumas contribuições de seis espigas vizinhas.Modelos compostos das varis calculados mediante o posicionamento da estrutura nas posições conhecidas revelaram a localização dos espinhos na superfície da Varian. Ocasionalmente, eram evidentes manchas localmente ordenadas de espinhos. Ao tentar este procedimento, é importante utilizar apenas os melhores dados e verificar cuidadosamente todos os resultados intermediários.Após seguir este procedimento, estruturas de cristalografia de raios X podem ser ajustadas à média final para obter uma visão mais precisa das interações proteína-proteína. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como calcular a média de estruturas de glicoproteínas do envelope viral utilizando o J Omo.

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