Name: DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda o método DAP-chip para identificar genes alvos de reguladores de resposta em sistemas de dois componentes bacterianos. Esta técnica in vitro permite mapear sítios de ligação genômicos sem sinais ativadores conhecidos.

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Agradecemos Amy Chen por sua ajuda na preparação para a filmagem do vídeo e para demonstrar a técnica. Este trabalho realizado pelo ENIGMA: Ecossistemas e redes integradas com os genes e Assembléias Molecular (http://enigma.lbl.gov), um programa científico da área de foco no Lawrence Berkeley National Laboratory, foi apoiado pelo Escritório de Ciência, Instituto de Ciências Biológicas e Pesquisa Ambiental, do Departamento de Energia dos EUA sob Contrato n º DE-AC02-05CH11231.

Nota: O protocolo a seguir é adaptado para determinação de genes alvos do DVU3023 RR da bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Ele pode ser adaptado a qualquer outro regulador transcricional de interesse. 1. Clone e Purify RR <ol><li> Clonar o gene RR, especificamente DVU3023, de D. vulgaris Hildenborough num vector de expressão de Escherichia coli de modo a que o gene é o C-terminal marcado com His e de expressão está sob o controlo de um promotor de T7. Nota: Vários métodos de clonagem pode ser utilizado e é determinado pelo investigador. Também podem ser utilizados marcadores de afinidade alternados. </li><li> Transformar a construção de expressão em E. coli BL21 (DE3) tensão expressão. </li><li> Cresça 1 L da BL21 expressão tensão a 37 ° C. Na fase mid-log, adicionar IPTG a 0,5 mM para induzir a expressão da proteína. Continuar o crescimento à temperatura ambiente durante 24 horas. </li><li> Células centrifugar a 5000 xg por 10 min a 4 ° C. Ressuspender as células em tampão de lise (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, 500 mM de NaCl, 40 mM de imidazole, 1 mg / ml de lisozima, 1x benzonase nuclease). Lise das celulas usando uma imprensa francesa, a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,45 um. </li><li> Lavar uma coluna de 1 ml de Ni Sepharose em um instrumento de FPLC utilizando 10 ml de tampão de lavagem (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, 500 mM de NaCl, 40 mM de imidazole). </li><li> Carregar lisado na coluna. Lavar coluna com 20 ml de tampão de lavagem. </li><li> Eluir DVU3023 usando um gradiente de 0-100% de tampão de eluição (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM). </li><li> Carregar fracções eluídas numa coluna de dessalinização, e lava-se com um tampão de dessalinização (fosfato de sódio 20 mM pH 7,4, NaCl 100 mM). </li><li> Centrífuga amostra de proteína em um filtro de centrífuga de alta molecular de corte de peso para concentrar a proteína. Adicionar DTT a 0,1 mM e glicerol a 50% e armazenar a proteína a -20 ° C. Nota: terão de ser optimizados individualmente para cada proteína sob estudo métodos de purificação. </li></ol> 2. Determine gene alvo para RR Usando Electrophoretic Mobilidade Mudança Assay (EMSA) <ol><li> Amplificar por PCR a região de 400 pb a montante do DVU3025 gene alvo candidato, usando D. ADN genómico vulgaris Hildenborough como molde, e um iniciador não marcado para a frente e um reverso 5&#39;-biotina marcado com iniciador. Nota: Dicas para escolher um gene alvo candidato: Muitas vezes RRS ligar as regiões a montante do seu próprio gene / operon, ou eles podem regular genes codificados proximal. Se a RR tem ortólogos em outras espécies, olhar para genes que são conservados no bairro. Métodos alternativos incluem genes candidatos que escolhem com base em previsões regulão (por exemplo, RegPrecise 5), ou prevendo promotores dependentes de sigma54 6 RRS para que sejam eles próprios sigma54-dependente. </li><li> Executar o produto de PCR num gel de agarose a 1%, cortado a 400 bp produto de tamanho, e purificar o DNA usando uma extração de gel limpar kit. </li><li> Misturar a proteína DVU3023 (0,5 pmol) com 100 fmol de substrato DNA biotinilado em 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, glicerol a 25% e 1 ug / ml de poli dI.dC (non -específica concorrente ADN) num volume total de 20 ul. Também criou uma reação sem qualquer proteína como um controle. Incubar as reações à temperatura ambiente no banco para 20 min. </li><li> Nota: Estas são as condições padrão enumerados e outros componentes da reacção, podem ser adicionados dependendo do RR de interesse. Se a ativação for desejada, adicionar fosfato de acetil 50 mM para a reação (muitas vezes RRS ligará DNA in vitro, sem ativação). </li><li> Pré-executar um mini 6% de poliacrilamida-0.5x gel TBE pré-moldado em tampão TBE 0,5 x a 100 V por 30 min. Adicionar 5 mL de tampão 5x de carga (0,1% de azul de bromofenol, 0,1% xilenocianol, 30% de glicerol em 1x TBE) para as reações de ligação e de carga de 18 mL das reações sobre o gel. Execute a 100 V durante 2 horas. Nota: Para evitar o sobreaquecimento, o que pode conduzir a dissociação dos complexos proteína-ADN, encher a câmara tampão externo no sistema de electroforese com tampão de operação de tal forma que a maior parte do gel é isolado por tampão. Em alternativa, o gel pode ser realizada a 4 ° C. </li><li> Cortar uma membrana de nylon carregada ao tamanho do gel e mergulhe-o em 0,5 x TBE, durante pelo menos dez minutos. Remover o gel a partir da cassete. Cortar quaisquer saliências fora do gel e o gel de sanduiche e a membrana entre dois papéis de filtro de espessura embebido em TBE 0,5 x, e colocar dentro de um aparelho de transferência semi-seco e à temperatura de 20 V durante 30 min. </li><li> Coloque a membrana dentro de um instrumento de luz UV crosslinker comercial e definir o tempo de 3 min. Nota: A membrana podem agora ser armazenados secos à temperatura ambiente durante vários dias antes de prosseguir para o próximo passo. </li><li> Use um kit de detecção quimioluminescente disponível no mercado que emprega um estreptavidina-cavalo rabanete peroxidaçãosi conjugado para desenvolver a mancha como as instruções do fabricante. </li><li> Imagem da mancha utilizando um computador ligado a uma câmara CCD equipado e procurar uma mudança na mobilidade do substrato de DNA na presença do RR, o que indica que a RR liga o ADN a ser testado. Nota: A especificidade da transferência de DNA-proteína pode ser testada através da inclusão na reacção de um excesso de DNA competidor não marcado, que deverá eliminar ou reduzir a mudança de vista. </li></ol> 3. Verifique Alvo Enriquecimento após Genomic DNA-binding protein <ol><li> Reacção de ligação proteína-ADN genómico <ol><li> ADN genómico de cisalhamento até um tamanho médio de 500 pb por sonicaçao de DNA genómico 100 ul (em concentrações de 100-200 ng / ul) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando uma microponta com 9 baixos impulsos de amplitude de um segundo, com 2 seg lacuna entre cada. Nota: Se os respingos de DNA para os lados do tubo, girar o conteúdo a cada 3 pulsos. As condições exatas usadasvariará de acordo com o instrumento de ultra-sons utilizado. Os fragmentos de ADN cortados podem variar de 100-1000 pb, mas o tamanho médio deve ser dentro de 400-600 pb. Demasiada corte pode resultar em menos sítios de ligação intactas, e quer muito ou pouco corte afetará preparação biblioteca durante as etapas a jusante inteiras de amplificação do genoma. </li><li> Misturar 2-3 ug de DNA genómico cortado com proteína RR (0,5 pmol de DVU3023) em 10 mM Tris-HCl pH 7,5, DTT 1 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, 25% glicerol, e 50 mM de fosfato de acetilo. Incubar as reacções a 25 ° C durante 30 min. Transferir 10 uL desta reacção para um tubo de 1,5 ml e rotular como ADN de entrada. Nota: fosfato Acetil é adicionada para activar a proteína in vitro por fosforilação. A fosforilação estimula a ligação ao ADN, mas muitos RRS também ligar o ADN in vitro, sem activação 7. A quantidade de proteína adicionada à reacção dependerá de actividade da preparação de proteína. O EMSA pode ser utilizado para optartimize este montante. </li></ol></li><li> Afinidade purificar o ADN ligado às proteínas <ol><li> Adicionar 30 mL de resina de agarose Ni-NTA para um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Centrifugar a 100 xg durante 1 minuto para recolher a resina na parte inferior, e remover o sobrenadante. Adicionar 100 ul de tampão de lavagem (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 5 mM, KCl 50 mM, glicerol a 25%), o movimento do tubo para misturar e centrifugar a 100 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar os restantes 90 ul da reacção de ligação com a resina de Ni-NTA lavada e incubar num agitador rotativo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 100 xg durante 2 min e remove-se o sobrenadante (o ADN não ligado). Adicionar 100 ul de tampão de lavagem, apertar o tubo para misturar o conteúdo, e centrifugar a 100 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante. Repita o passo de lavagem mais duas vezes. </li><li> Adicionar 35 ul de tampão de eluição (tampão fosfato pH 20 mM de sódio 8, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM) à resina e misturar por vortex. Incubar no banco a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 100 xg por 2 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml e rotular como a fracção de DNA ligada à proteína. </li><li> Também adicionar 35 ul de tampão de eluição para o ADN de entrada. </li><li> Purifica-se a entrada e as fracções de ADN ligado à proteína usando um kit de purificação de PCR. </li></ol></li><li> Genoma inteiro amplificar a entrada e amostras de DNA ligadas às proteínas. <ol><li> Adicionar 10 ul de entrada e de DNA ligado a proteínas para separar tubos PCR. Adicionar 1 mL de tampão de fragmentação de 10x, 2 ul de tampão de preparação da biblioteca, e 1 ul de solução de biblioteca de estabilização para cada amostra. Misture bem em vórtice. Aquecer num termociclador a 95 ° C durante 2 min, e frio no gelo. Nota: A quantidade inicial de ADN deve ser de pelo menos 10 ng, a fim de evitar a introdução de viés de amplificação. </li><li> Adicionar 1 ml de preparação de enzima Biblioteca, misturar por pipetagem, e incubar em termociclador a 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C durante 20 min, 75 ° C / 5 min, E espera a 4 ° C. </li><li> Para cada tubo, adicionar 47,5 mL de água, 7,5 ul de amplificação 10x mistura principal, e 5 ul de polimerase. Misturar bem e aquece-se a 95 ° C / 3 min, seguido por 20 ciclos de 94 ° C/15 seg, 65 ° C / 5 min. Segurar reacções a 4 ° C. </li><li> Purifica-se as amostras de DNA amplificado usando um kit de purificação PCR e medir a concentração de DNA por espectrofotometria. </li></ol></li><li> Verifique alvo enriquecimento no ADN ligada a proteína utilizando qPCR <ol><li> Primers Projeto qPCR para amplificar 200 pb da região a montante do gene alvo EMSA-verificada (DVU3025) usando qualquer software de desenho de primers livremente disponível. </li><li> Configure reações de qPCR em triplicado para cada modelo de DNA com cada conjunto de primers. Prepare uma mistura de mestre para cada conjunto de primers. 1x mistura principal contém 10 mL de mistura SYBR Green qPCR 2x, 0,5 uM de cada iniciador e água para um total de 18 ul. Alíquotas de 18 ul da mistura principal por poço de uma placa de 96 poços de PCR. </li><li> Dilute a entrada e amplificados purificados e amostras de DNA ligadas a proteínas de 5 ng / mL com água e usado como molde de ADN. Adicionar 2 l de molde de ADN para os poços. </li><li> Selar a placa com um filme de selagem ultra claro qPCR, spin down placa em uma centrífuga a 200 xg / 1 min. Coloque a placa em uma máquina de qPCR tempo real. Ciclo como se segue, utilizando o software associado qPCR: 95 ° C / 1 min, e 40 ciclos de 95 ° C/10 seg, 59 ° C/15 seg e 70 ° C/35 seg. </li><li> Além disso, definir as reações de qPCR triplicadas com primers para amplificar regiões a montante de um gene relacionado (controle negativo). </li><li> Calcular ôc T subtraindo valor T C do DNA ligada à proteína do que o ADN de entrada. Calcular o enriquecimento de dobragem do gene alvo no ADN ligado à proteína como 2 Ac t. Nota: Se o alvo a região a montante foi enriquecida com o ADN ligado às proteínas contra o ADN de entrada, que indica que as reacções de ligação e purificação por afinidade foram successful. Vá para a etapa 4. Se o enriquecimento de alvo a região a montante não foi observado, repita as reações de ligação (passo 3.1) com diferentes quantidades de proteína. </li></ol></li></ol> 4. Labeling DNA e matriz de Hibridização <ol><li> Etiqueta DNA de entrada com DNA Cy3 e enriquecido com Cy5 ota: Cy3 e Cy5 corantes são sensíveis à luz e os cuidados devem ser tomados para manter a exposição à luz a um mínimo. <ol><li> Misture 1 mg de DNA com 40 mL Cy3/Cy5-labeled 9-meros e ajustar o volume para 80 mL com água. </li><li> Calor desnaturar a 98 ° C durante 10 minutos no escuro (num termociclador). Frio rápida no gelo por 2 min. </li><li> Adicionar 2 l de Klenow da polimerase (3&#39;-5&#39;-exo -, 50.000 U / ml), 5 mM dNTPs, e 8 mL de água a cada reacção, misturar bem e incubar a 37 ° C durante 2 horas no escuro (em um termociclador). </li><li> Adicionar EDTA para 50 mM, para parar a reacção e uma solução de NaCl a 0,5 M. </li><li> Amostras de transferência para tubos de 1,5 ml containing 0,9 volume de isopropanol, incubar no escuro durante 10 minutos, e centrifugar a 12000 xg durante 10 min. A pastilha deve ser rosa para DNA Cy3 marcado e azul para DNA Cy5 marcado. </li><li> Lavar sedimento com etanol a 80% (500 mL) e centrifugar a 12000 xg durante 2 min. Pelotas secarem naturalmente durante 5-10 min no escuro. Nota: Os grânulos podem ser armazenadas a -20 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 25 mL de água. Medir a concentração de DNA por espectrofotometria. </li><li> Piscina juntos 6 ug cada de ADN Cy3 e Cy5 marcado num tubo de 1,5 ml e seco sob vácuo em uma centrífuga em baixo calor no escuro (cobrir a tampa da centrifugadora, se for transparente). Nota: Os grânulos podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para a hibridação. </li></ol></li><li> Microarray Hibridização <ol><li> Ligue o sistema de hibridização em 3-4 horas antes de usar e definir a temperatura a 42 ° C. </li><li> Prepare uma solução de mistura principal hibridização tal que 1x solução contém 11,8 mL 2x Hybriditampão zação, 4,7 ul de Hibridização de componentes A e 0,5 ul de oligo alinhamento. </li><li> Ressuspender as peletes em 5 mL de água. Adicionar 13 ul desta mistura para a amostra. Vortex durante 15 seg, incubar a 95 ° C em um banho seco de 5 min. Manter as amostras a 42 ° C no sistema de hibridação até estarem prontos para carregamento. </li><li> Prepare o microarray montagem slide-mixer, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Coloque o conjunto misturador de slides dentro do sistema de hibridização. Carga de 16 ul de amostra no orifício de enchimento, selar as portas com uma película adesiva, transformar a mistura no no sistema, e hibridar durante 16-20 horas a 42 ° C. </li><li> Prepare 1x tampões de lavagem I (250 ml), II (50 ml) e III (50 ml) por diluição das 10x tampões comercialmente disponíveis em água, e para cada adicionar DTT a 1 mM. Tampão Quente I a 42 ° C. </li><li> Deslize o misturador de slides em uma ferramenta de desmontagem, e coloque dentro de um prato quente contendo Tampão I. Peel a batedeira desligada, enquanto vigorosamente shendo a ferramenta de desmontagem com a mão. </li><li> Coloque o slide em um recipiente com 50 ml de tampão de lavagem I e agitar vigorosamente durante 2 minutos com a mão. </li><li> Transferência de slides para um segundo recipiente com tampão de 50 ml Wash II e agitar vigorosamente durante 1 min com a mão. </li><li> Transferência de slides em um terceiro recipiente com 50 ml de Tampão de lavagem III, e agitar vigorosamente por 15 segundos com a mão. </li><li> Apagar rapidamente as bordas do slide em uma toalha de papel e coloque em um rack slide. Centrifugar a 200 xg durante 2 minutos para secar a corrediça. Coloque dentro de caso slide, envolvê-la com papel alumínio e guarde em um dessecador. </li></ol></li><li> A digitalização da Matriz <ol><li> Colocar a lâmina dentro do scanner de microarray de acordo com as instruções do instrumento. </li><li> Use um software de scanner para definir os comprimentos de onda como 532 nm = Cy3 e 635 nm = Cy5, e os ganhos fotomultiplicadores iniciais entre 350 e 400. </li><li> Pré-visualizar o slide para localizar a matriz no slide. Selecione a região de matriz para a digitalização. </li&gt; <li> Digitalizar a matriz e ajustar as configurações de fotomultiplicadores de tal forma que as características da matriz são principalmente amarelo. O histograma que mostra as curvas de vermelhas e verdes, sobreposto ou o mais próximo possível uns dos outros quanto possível. As curvas devem terminar acima dos 10 -5 contagens normalizadas em saturação. </li><li> Salve ambos os 532 e 635 nm imagens separadamente. </li></ol></li><li> Análise de Dados Matriz <ol><li> Importe as imagens em um software de análise de matriz. Usando o software, criar dois relatórios (par. Par) para cada matriz (por Cy3 e Cy5 imagens). Criar log 2 arquivos relação em escala usando os arquivos par. Use log 2 arquivos relação ao procurar picos usando uma janela deslizante de 500 pb. Mapear o pico loci para as regiões a montante de genes alvos. </li><li> Verifique se o alvo positivo (determinado usando EMSA e confirmado por qPCR, DVU3025 neste exemplo) aparece no top picos. Nota: Se o alvo positivo não está entre os top hits, é possível que a RR em consisideração tem vários genes alvos e replicar DAP-chips pode ser realizado e picos comuns a todas as repetições podem ser utilizados para gerar uma lista de destino. </li></ol></li></ol> 5. Binding Previsão do Site Motif e Validação <ol><li> Recuperar as sequências de regiões a montante (400 pb) para os genes alvos principais como gerado pela análise DAP-chip. Aplicar MEME sobre essas sequências através de micróbios Online (meme.nbcr.net) para prever motivos. Nota: as proteínas de ligação, tais como os reguladores Enhancer sigma54-dependentes podem ligar-se várias centenas de pares de bases a montante do local de início. Para outros reguladores da transcrição, uma região mais curto, tal como de 200 pb a montante será suficiente. </li><li> Projeto superior e oligômeros DNA, fundo que contêm o motivo sítio de ligação previsto ladeado por 10 bases em cada extremidade. Encomende o topo vertente 5 &#39;biotinilado. </li><li> Misturar os oligos de cadeia de topo e de fundo em relação de 1:1,5 em 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM e NaCl a 50 mM emum volume total de reacção de 20 ul em tubos PCR. Aquece-se a 95 ° C durante 5 minutos num termociclador, seguido de arrefecimento lento até 25 ° C. Diluir dez vezes e usar como substrato dsDNA tipo selvagem para EMSA. </li><li> Prepare substratos modificados usando os mesmos passos acima, mas oligômeros projeto para levar 4-6 substituições nas bases conservadas do motivo de ligação. </li><li> Defina-se reacções de ligação com a RR e do tipo selvagem ou substratos modificados e analisar usando EMSA, tal como descrito no passo 2. </li><li> Nota: O motivo predito é validado se o RR liga o substrato do tipo selvagem, mas não a uma modificação. </li></ol> 6. Conservação da Motif em Outras bacterianas relacionadas Espécies <ol><li> Selecione genomas de interesse que contêm ortólogos de DVU3023. Obter arquivos de seqüência e de anotação dos genomas do site do NCBI. </li><li> Use uma linguagem de programação como Perl para escrever scripts que irão utilizar as seqüências motivo de as metas DAP-chip para construir um position matriz ponderada e usar a matriz para marcar motivos semelhantes presentes em outros genomas seqüenciados. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm qualquer conflito de interesse de divulgar.

O método DAP-chip aqui descrito foi utilizado com sucesso para determinar os genes alvos para vários RRS em Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 dos quais um é mostrado aqui como um resultado representativo. Para RR DVU3023, escolhendo um alvo gene candidato foi simples. DVU3025 está localizado imediatamente a jusante do gene RR, e os genes-alvo e RR são conservadas em diversas espécies Desulfovibrio, e adicionalmente DVU3025 tem um promotor dependente de sigma54 previsto. O EMSA fornece u...

A capacidade das bactérias para sobreviver e prosperar é criticamente dependente da forma como eles são capazes de perceber e responder a perturbações em seus ambientes, e este por sua vez é dependente de seus sistemas de transdução de sinal. O número de sistemas de sinalização uma bactéria codifica tem sido chamado o seu &quot;QI microbiana&quot; e pode ser uma indicação de ambos variabilidade do seu ambiente e da sua capacidade de sentir múltiplos sinais e afinar a sua resposta 1. Dois sistemas de componentes de transdução de sinal (TCS) são os sistemas de sinalização mais prevalentes utilizados por bactérias, e que consistem de uma histidina-quinase (HK), que detecta o sinal externo e transmite através da fosforilação de um regulador de resposta efectora (RR) 2. RRS pode ter uma variedade de domínios de saída e, portanto, diferentes modos efetoras, mas a resposta mais comum é a regulação da transcrição por meio de um DNA domínio 1 vinculativo. Os sinais detectados e as funções correspondentes dos vast maioria dos TCSs permanecem desconhecidos. Embora métodos in vivo, tais como Chip-chip são habitualmente usadas para a determinação de locais de ligação de factores de transcrição do genoma 3, que apenas pode ser utilizado para RRS sistema de dois componente bacteriano, se são conhecidas as condições de activação ou sinalização. Muitas vezes, os sinais ambientais que ativam a TCS são mais difíceis de determinar que os seus genes alvos. O microarray ensaio in vitro com base aqui descrita pode ser utilizada para determinar rápida e eficazmente os genes alvos e prever as funções de TCS. Este ensaio tira partido do facto de RRS pode ser fosforilada e assim activado in vitro utilizando pequenos doadores molécula como fosfato acetil 4. Neste método, chamado DAP-chip para ADN de afinidade-purificada de chip (Figura 1), o gene da RR de interesse é clonado com uma cauda de His no E. coli, e uma proteína marcada subsequentemente purificado é permitido biª a cortado DNA genômico. O DNA ligado à proteína é então enriquecida por afinidade-purificação, o ADN enriquecido e entrada são amplificados, marcado por fluorescência, reunidas e hibridado com um conjunto azulejos que é feito para o organismo de interesse (Figura 1). Microarray experiências estão sujeitos a artefactos e, por conseguinte, são empregues passos adicionais para optimizar o ensaio. Um tal passo é a tentativa de determinar um destino para o RR em estudo utilizando ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA) (ver fluxo de trabalho na Figura 2). Em seguida, após a ligação ao ADN genómico e as etapas de DAP, o DNA ligado à proteína e de entrada são examinados por qPCR para ver se o alvo positivo é enriquecido na fracção ligada à proteína em relação à fracção de entrada, confirmando, assim, as condições óptimas de ligação para o RR (Figura 2). Após a matriz de hibridação, os dados são analisados ​​para encontrar os picos de intensidade de sinal mais elevado, indicando locus genómico onde a proteína hanúncio vinculada. As funções podem ser previstos para o RR com base nos genes alvos obtidos. Os loci alvo genómicas são usadas para prever motivos sítios de ligação, que são, em seguida, experimentalmente validados usando EMSAs (Figura 2). As previsões funcionais e genes alvos para a RR pode então ser estendido para as espécies que codificam RRS ortólogos por inventariar os genomas de motivos de ligação semelhantes (Figura 2) intimamente relacionados. O método DAP-chip pode fornecer uma riqueza de informações para a TCS onde antes não havia nenhuma. O método também pode ser utilizado para qualquer regulador de transcrição se a proteína pode ser purificada e as condições de ligação de ADN pode ser determinada, e para todo o organismo de interesse com uma sequência de genoma disponível. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. O chip de ADN purificado por afinidade (DAP-estratégia chip) 7. O gene RR a partir do organismo de interesse é clonado com um carboxi-terminal His-tag numa E. tensão expressão coli. Purificado proteína marcada com His é activada por fosforilação com fosfato de acetilo, e misturados com o DNA genómico cortado. Uma aliquota da reacção de ligação é guardado como o ADN de entrada, enquanto o resto é submetido a purificação por afinidade usando uma resina Ni-NTA. A entrada e o DNA ligado a RR são todo o genoma amplificado e marcado com Cy3 e Cy5, respectivamente. O ADN marcado é reunidas e hibridado com uma matriz de ladrilhos, que é então analisado para determinar os alvos do gene. Figura modificada e reimpresso com a licença creative commons de 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Resumo do fluxo de trabalho. Para qualquer Protei marcado purificadon, começar por determinar um alvo usando EMSA. Permitir proteína para ligar DNA genômico e DNA-afinidade-Purify (DAP) e todo o genoma amplificar (WGA) e do DNA de entrada enriquecido. Se um gene alvo é conhecido, usar qPCR para garantir que o alvo conhecido é enriquecido na fracção ligada a proteína. Se nenhum destino poderia ser determinado, prossiga diretamente para rotulagem de DNA e variedade de hibridização. Se o enriquecimento por qPCR não pôde ser observado, em seguida, repita a ligação proteína-gDNA e passos DAP-WGA usando diferentes quantidades de proteína. Use a análise de matriz para encontrar picos e mapeá-los para atingir genes. Use as regiões a montante de genes alvo de prever motivos local de ligação. Validar os motivos experimentalmente usando EMSAs. Use o motivo para digitalizar os genomas de espécies relacionadas que codificam ortólogos da RR em estudo, e prever genes alvo nas espécies também. Com base nos genes alvos obtidos, a função fisiológica da RR e seus ortólogos pode ser previsto. Figura modificada e reimpresso usando o c criativoommons licença de 7.

<table><tbody><tr><td>Coluna HisTrapFF (coluna Ni-Sepharose)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (instrumento FPLC)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna de dessalinização HiPrep 26/10</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos marcados com biotina</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% poliacrilamida-0,5x TBE mini gel pré-moldado de retardamento de DNA</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, EUA</td><td>EC63652BOX</td><td>Como alternativa, você pode derramar seu próprio gel.</td></tr><tr><td>Membrana de nylon</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Célula de transferência eletroforética semi-seca</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Papel de borrão extra grosso, 8 x 13,5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador UV Modelo XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detecção quimioluminescente de ácido nucleico (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, EUA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Resina de agarose Ni-NTA</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, EUA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Kit de amplificação do genoma completo (tampão de fragmentação, tampão de preparação de biblioteca, solução de estabilização de biblioteca, enzima de preparação de biblioteca, master mix de amplificação 10x, polimerase WGA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA</td><td>Para quantificação de DNA</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, com ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Qualquer mistura de PCR Sybr Green pode ser usada</td></tr><tr><td>PlateMax Filme de selagem a quente ultra claro para qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[cabeçalho]</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de perfil baixo transparente de 96 poços</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, EUA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Sistema de PCR em tempo real</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, EUA</td><td>4376600</td><td>Qualquer sistema de PCR em tempo real pode ser usado</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, EUA</td><td>28104</td><td>Qualquer kit de limpeza de PCR pode ser usado</td></tr><tr><td>Nonamers marcados com Cy3/Cy5</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, EUA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polimerase 50.000 U/ml, 3'-5' exo-</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de hibridização</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA</td><td>N/A</td><td>Esta empresa não fabrica mais matrizes ou itens relacionados, portanto, fontes alternativas como Agilent ou Affymetrix precisarão ser usadas.</td></tr><tr><td>Microarrays e misturadores impressos sob encomenda</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de hibridização (2x tampão de hibridização, componente de hibridização A, oligo de alinhamento)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tampão de lavagem (10x tampão de lavagem I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A scanner</td> <td>de microarrayDispositivos moleculares, Sunnyvale CA, EUA</td><td>Este modelo foi substituído por superiores</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro software de microarray</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, software de análise de chip ChIP</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-afinidade-purificada método chip (dap-chip) para determinar genes alvos para bacteriana dois sistemas regulatórios componentes

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Os métodos in vivo, tais como Chip-chip são técnicas bem estabelecidas usados ​​para determinar genes alvos globais para fatores de transcrição. No entanto, eles são de uso limitado na exploração de dois sistemas de regulação componente bacteriano com condições de ativação descaracterizados. Tais sistemas de regular a transcrição apenas quando activada, na presença de sinais únicos. Uma vez que estes sinais são muitas vezes desconhecidos, o método de microarray com base in vitro descritos neste artigo de vídeo podem ser utilizados para determinar alvos de genes e sítios de ligação para reguladores da resposta. Este método de ADN purificado por afinidade-chip pode ser utilizado para qualquer regulador purificada em qualquer organismo com um genoma sequenciado. O protocolo envolve permitindo que a proteína purificada marcado para se ligar ao DNA genómico cortado e, em seguida, a purificação por afinidade de ADN ligado à proteína, seguido de marcação fluorescente do ADN e hibridação com uma matriz de ladrilhos costume. Precedendo passos que podem ser utilizados para optimizar o ensaio para a especificidadereguladores c também são descritos. Os picos gerados pela análise dos dados de matriz são utilizados para prever motivos sítios de ligação, que são, em seguida, validada experimentalmente. As previsões motivo pode ser ainda utilizado para determinar genes alvos dos reguladores de resposta ortólogos em espécies estreitamente relacionadas. Nós demonstramos a aplicabilidade deste método através da determinação dos genes alvos e motivos do site vinculativo e prevendo, assim, a função de um regulador de resposta DVU3023-dependente sigma54 na bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ambiental.

O método acima foi aplicado para determinar os genes alvos globais dos RRS no sulfato de modelo reduzindo bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Este organismo tem um grande número de TCS representado por mais de 70 RRS, indicando a vasta variedade de possíveis sinais que detecta e responde. Análise in vivo sobre as funções destes sistemas de sinalização são difíceis de realizar uma vez que os sinais e, assim, as suas condições de activação são desconhecidos. Aqui o método DAP-chip...

Este artigo vídeo descreve um método de microarray baseado in vitro para determinar os genes alvos e sítios de ligação para dois reguladores de resposta do sistema de componentes.

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar os sítios de ligação genômica de reguladores de resposta bacterianos de dois componentes utilizando um ensaio baseado em microarranjo in vitro. Isso é alcançado por meio da clonagem e purificação de uma proteína reguladora de resposta marcada, sua ativação por fosforilação in vitro e a determinação de um alvo gênico utilizando ensaios de mobilidade eletroforética para uso como controle positivo nas etapas subsequentes de microarranjo. Como segundo passo, a proteína reguladora de resposta purificada é misturada com o DNA genômico, o que permite que o DNA ligado à proteína seja separado do DNA de entrada por meio de purificação por afinidade.Em seguida, o DNA ligado à proteína e o DNA de entrada são amplificados e verificados por qPCR para enriquecimento do gene-alvo controle positivo na fração ligada à proteína, marcados fluorescentemente, combinados e hibridados em um microarranjo com cobertura contínua (tiling microarray). Para determinar os sítios de ligação genômica do regulador de resposta, os resultados indicam os genes mais prováveis que são regulados pelo regulador de resposta em estudo, e os resultados podem ser validados adicionalmente utilizando ensaios de mobilidade eletroforética em gel (EMSA). A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como o chip-chip in vivo, é que ela pode ser utilizada mesmo quando os sinais ativadores e as condições não são conhecidos para os sistemas de dois componentes.Este método é de grande importância para o campo da sinalização bacteriana, pois a grande maioria dos reguladores de resposta possui alvos gênicos desconhecidos, e este método auxilia na elucidação de redes regulatórias complexas. Demonstrará este procedimento Amy Chen, assistente de pesquisa do meu laboratório, antes de iniciar este procedimento.Purifique uma rr, especificamente a proteína DVU 3 0 2 3 expressa a partir de um gene DVU 3 0 2 3 clonado misto. Incube 0,5 picomol da proteína DVU 3 0 2 3 com 100 fentomol de um substrato de DNA previamente preparado *in vitro* em solução tamponada até um volume total de 20 microlitros. Após montar uma reação sem nenhuma proteína como controle, incube as reações à temperatura ambiente na bancada por 20 minutos.Após a incubação, adicione cinco microlitros de tampão de carregamento 5x às reações de ligação. Carregue 18 microlitros de cada reação em um gel mini de poliacrilamida 6% previamente preparado em tampão 0,5 XTBE e execute a 100 volts por duas horas. Após a eletroforese, corte uma membrana de nylon carregada no tamanho do gel e mergulhe-a em 0,5 XTBE por pelo menos 10 minutos. Em seguida, remova o gel da cassete.Retire quaisquer reentrâncias do gel e coloque o gel e a membrana entre dois papéis filtro grossos embebidos em TBE 0,5X. Coloque o gel e a membrana dentro de um aparelho de eletrotransferência semisseco e execute a 20 volts por 30 minutos. Em seguida, coloque a membrana dentro de um equipamento comercial de cruzamento por luz UV e defina o tempo para três minutos; após desenvolver o blot usando um kit de detecção quimioluminescente, capture a imagem utilizando um computador conectado a uma câmera equipada com CCD.Procure uma alteração na mobilidade do substrato de DNA na presença da RR, o que indica que a RR se liga ao DNA em teste. Em seguida, misture dois a três microgramas de DNA genôm游戏副本o compartilhado com 0,5 picomol de DVU 3 0 2 3 em uma solução tamponada. Após incubação da reação a 25 graus Celsius por 30 minutos, transfira 10 microlitros da mistura para um tubo de 1,5 mililitro e rotule-o como DNA de entrada.Adicione 30 microlitros de resina de níquel NTA aros a um tubo microcêntrifugo de 0,6 mililitro. Centrifugue a amostra a 100 ×g por um minuto para recolher a resina no fundo do tubo após a centrifugação. Remova o sobrenadante neste ponto.Adicione 100 microlitros de tampão de lavagem e agite suavemente o tubo para misturar o conteúdo. Após a centrifugação, aplique 100 Gs por dois minutos e remova o sobrenadante. Adicione os 90 microlitros restantes da reação de ligação à lavagem com a resina de NTA de níquel.Em seguida, incube a amostra em um agitador rotativo durante 30 minutos. Ao finalizar, centrifugue a amostra a 100 Gs por dois minutos. Após a remoção do sobrenadante, repita os passos de lavagem mais três vezes.A seguir, adicione 35 microlitros de tampão eluente à resina e misture por vortex. Incube a amostra em bancada à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a centrifugação da amostra, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e identifique-o como a fração de DNA ligado à proteína.Em seguida, adicione 35 microlitros do tampão eluente ao DNA de entrada após a purificação das frações de DNA de entrada e de DNA ligado à proteína. Adicione 10 microlitros de cada uma a tubos de PCR separados. Em seguida, adicione um microlitro de tampão de fragmentação 10 x, dois microlitros de tampão de preparação de biblioteca e um microlitro de solução de estabilização de biblioteca a cada amostra, misturando bem as amostras por vortexagem.Incube as amostras em um termociclador a 95 graus Celsius por dois minutos. Após a conclusão, resfrie as amostras em gelo. Em seguida, adicione um microlitro da enzima de preparação da biblioteca às amostras e misture o conteúdo por pipetagem.Incube as amostras em um termociclador. Após a incubação, adicione 47,5 microlitros de água, 7,5 microlitros de mix mestre de amplificação 10x e cinco microlitros de polimerase a cada tubo. Após a mistura das amostras, aqueça-as em um termociclador.Prepare reações de QPCR em triplicata para cada modelo de DNA preparando uma mistura mestra 1x para cada conjunto de primers previamente desenhado, em seguida alíquota 18 microlitros da mistura mestra por poço de uma placa de PCR de 96 poços. Dilua as amostras de DNA amplificado e purificado, bem como as amostras de DNA ligado à proteína, com água até cinco nanogramas por microlitro e adicione dois microlitros de cada amostra aos poços. Após isso, selle a placa com uma película selante UltraClear para QPCR.Centrifugue a placa em uma centrífuga a 200 ×g por um minuto. Após colocar a placa em um ciclo de máquina de QPCR em tempo real, usando as seguintes condições para rotular o DNA de entrada com s si três e o DNA enriquecido com sci cinco, misture um micrograma de DNA com 40 microlitros de nonameros marcados com S3 SCI-FI e ajuste o volume para 80 microlitros com água. Em seguida, desnature as amostras a 98 graus Celsius por 10 minutos no escuro em um ciclador térmico.Quando terminado, resfrie rapidamente as amostras em gelo por dois minutos, adicione dois microlitros de polimerase três primas, cinco primas exo, cinco milimolares de trifosfatos de desoxirribonucleotídeo e oito microlitros de água a cada reação. Após a mistura, incube as reações a 37 graus Celsius por duas horas no escuro em um ciclador térmico. Neste ponto, adicione EDTA até 50 milimolares para interromper as reações e solução de cloreto de sódio até 0,5 molar.Em seguida, transfira para tubos de 1,5 mililitro contendo um volume de 0,9 de isopropanol após incubação no escuro por 10 minutos. Centrifugue as amostras a 12.000 ×g por 10 minutos. Reúna seis microgramas de cada uma das amostras de DNA marcadas S3 e sci-fi em um tubo de 1,5 mililitro e seque sob vácuo em uma centrífuga com calor baixo no escuro, cobrindo a tampa da centrífuga se ela for transparente.Uma vez que os pellets estejam secos, suspendemo-los em cinco microlitros de água. Em seguida, adicione 13 microlitros de uma mistura mestra de solução de hibridização 1x previamente preparada às amostras após vórtex por 15 segundos, incube as amostras a 95 graus Celsius em banho seco por cinco minutos. Retire as amostras do banho seco e coloque-as em um sistema de hibridização a 42 graus Celsius até o momento do carregamento.Em seguida, coloque o conjunto de lâmina misturadora previamente preparado dentro do sistema de hibridização. Adicione 16 microlitros da amostra na porta de preenchimento. Em seguida, feche as portas com uma película adesiva e ligue a mistura no sistema após hibridizar por 16 a 20 horas a 42 graus Celsius.Deslize o misturador, retire o lâmina de uma ferramenta de desmontagem e coloque-a dentro de um recipiente contendo tampão morno um. Retire o misturador enquanto agita vigorosamente a ferramenta de desmontagem. Coloque a lâmina em um recipiente com 50 mililitros de tampão de lavagem um e agite vigorosamente por dois minutos.Em seguida, repita o passo anterior com 50 mililitros do tampão de lavagem dois e 50 mililitros do tampão de lavagem três RRR DVU 3 0 2 3 deslocado. A região upstream de DVU 3 0 2 5 por QPCR mostrou que a região upstream de DVU 3 0 2 5 está enriquecida na fração ligada à proteína em relação ao DNA de entrada, indicando assim que as condições de ligação foram adequadas para DVU 3 0 2 3. DVU 0 0 1 3 foi um controle negativo. Os quatro picos superiores obtidos após a análise de DAP chipp foram escolhidos como os alvos mais prováveis, sendo DV 3 0 2 3.O alvo positivo DVU 3 0 2 5 foi o primeiro pico obtido com a pontuação mais alta. Dois alvos gênicos são dois outros permeases de lactato codificados separadamente. O quarto alvo gênico não está localizado em uma região upstream, mas na região intergênica entre dois genes transcritos de forma convergente; as regiões upstream dos alvos obtidos foram utilizadas pelo DAP-chip meme para prever um motivo do sítio de ligação.O motivo foi validado adicionalmente mediante substituições nas bases conservadas dentro do motivo, o que eliminou a mudança na ligação. O motivo validado foi utilizado para analisar os genomas de outras bactérias redutoras de sulfato que possuíam ortólogos DVU 3 0 2 3; os loci foram escolhidos como possíveis alvos gênicos quando o motivo estava localizado em regiões upstream de quadros de leitura aberta, utilizando sequências de motivos previstas para rs autólogos. Um motivo de sítio de ligação consenso foi gerado, o qual se assemelha estreitamente ao do Divo Garris Hilton Burrow.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o método Daptive para determinar os alvos gênicos de proteínas reguladoras. Este método pode ser empregado para analisar o tamanho da ligação de qualquer proteína reguladora, desde que a proteína possa ser purificada e a sequência do genoma seja conhecida.

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Este vídeo demonstra um ensaio in vivo em bactérias para estudar a interação de proteínas de ligação a RNA (RBPs) com RNA. As células bacterianas são transformadas com duas construções de plasmídeo - um plasmídeo de sítio de ligação que codifica um mRNA contendo um gene repórter fluorescente a jusante de um sítio de ligação de RBP - enquanto um plasmídeo RBP expressa as proteínas RBP sob o controle de um indutor. Após o aumento mediado por indutor na produção de RBP, os RBPs se ligam ao mRNA,...

Ensaio de repressão gênica repórter para estudar a regulação translacional de um gene alvo

Este vídeo demonstra um método para detectar as cepas de cianobactérias em uma amostra ambiental usando um chip de microarray de anticorpos. Amostras portadoras de várias bactérias interagem com anticorpos impressos, e a imunocoloração com anticorpos anti-cianobactérias marcados com fluoróforo revela a presença de cepas específicas de cianobactérias por meio de fluorescência em pontos distintos.

Uma técnica para detectar cepas de cianobactérias usando um chip de microarray de anticorpos

Desenvolvemos uma plataforma microfluidica para testes rápidos de suscetibilidade a antibióticos. O fluido é passado em altas velocidades sobre bactérias imobilizadas na parte inferior de um canal microfluido. Na presença de estresse e antibiótico, cepas suscetíveis de bactérias morrem rapidamente. No entanto, bactérias resistentes podem sobreviver a essas condições estressantes.

Teste de suscetibilidade de antibiótico induzido por estresse em um chip

Descrevemos aqui um ensaio por acoplamento de identificação do DNA adenina metiltransferase (DamID) para sequenciamento de alta taxa de transferência (DamID-seq). Este método melhorado fornece uma resolução mais alta e uma maior gama dinâmica, e permite analisar os dados DamID-seq em conjunto com outros dados de sequenciação de alto rendimento tal como Chip-SEQ, ARN-SEQ, etc.

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Leucemia linfocítica crônica (CLL) é a leucemia mais comum no mundo ocidental. Fatores de transcrição NFAT são importantes reguladores do desenvolvimento e ativação em numerosos tipos de células. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) em células humanas de CLL identificar genes alvo romance de NFAT2.

Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina para identificar Genes-alvo NFAT2 novela em leucemia linfocítica crônica

Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

A imunoprecipitação de cromatina, juntamente com o sequenciamento de última geração (ChIP-seq), é um método usado para estabelecer interações entre fatores de transcrição e as sequências genômicas que eles controlam. Este protocolo descreve técnicas para a realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, usando salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme bacteriano como um exemplo.

Descobrindo metas regulatórias csgd em salmonella biofilme usando imunoprecipitação de cromatina e sequenciamento de alta produtividade (ChIP-seq)

A Ação Capilar De Ligania Diferencial do Ensaio de Ligamento (DRaCALA) pode ser usada para identificar pequenas proteínas de ligação de ligantes de um organismo usando uma biblioteca ORFeome.

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Aprenda o método DAP-chip para identificar genes alvos de reguladores de resposta em sistemas de dois componentes bacterianos. Esta técnica in vitro permite mapear sítios de ligação genômicos sem sinais ativadores conhecidos.

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes (Vídeo) | JoVE Journal

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

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