DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar os sítios de ligação genômica de reguladores de resposta bacterianos de dois componentes utilizando um ensaio baseado em microarranjo in vitro. Isso é alcançado por meio da clonagem e purificação de uma proteína reguladora de resposta marcada, sua ativação por fosforilação in vitro e a determinação de um alvo gênico utilizando ensaios de mobilidade eletroforética para uso como controle positivo nas etapas subsequentes de microarranjo. Como segundo passo, a proteína reguladora de resposta purificada é misturada com o DNA genômico, o que permite que o DNA ligado à proteína seja separado do DNA de entrada por meio de purificação por afinidade.

Em seguida, o DNA ligado à proteína e o DNA de entrada são amplificados e verificados por qPCR para enriquecimento do gene-alvo controle positivo na fração ligada à proteína, marcados fluorescentemente, combinados e hibridados em um microarranjo com cobertura contínua (tiling microarray). Para determinar os sítios de ligação genômica do regulador de resposta, os resultados indicam os genes mais prováveis que são regulados pelo regulador de resposta em estudo, e os resultados podem ser validados adicionalmente utilizando ensaios de mobilidade eletroforética em gel (EMSA). A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como o chip-chip in vivo, é que ela pode ser utilizada mesmo quando os sinais ativadores e as condições não são conhecidos para os sistemas de dois componentes.

Este método é de grande importância para o campo da sinalização bacteriana, pois a grande maioria dos reguladores de resposta possui alvos gênicos desconhecidos, e este método auxilia na elucidação de redes regulatórias complexas. Demonstrará este procedimento Amy Chen, assistente de pesquisa do meu laboratório, antes de iniciar este procedimento.

Purifique uma rr, especificamente a proteína DVU 3 0 2 3 expressa a partir de um gene DVU 3 0 2 3 clonado misto. Incube 0,5 picomol da proteína DVU 3 0 2 3 com 100 fentomol de um substrato de DNA previamente preparado *in vitro* em solução tamponada até um volume total de 20 microlitros. Após montar uma reação sem nenhuma proteína como controle, incube as reações à temperatura ambiente na bancada por 20 minutos.

Após a incubação, adicione cinco microlitros de tampão de carregamento 5x às reações de ligação. Carregue 18 microlitros de cada reação em um gel mini de poliacrilamida 6% previamente preparado em tampão 0,5 XTBE e execute a 100 volts por duas horas. Após a eletroforese, corte uma membrana de nylon carregada no tamanho do gel e mergulhe-a em 0,5 XTBE por pelo menos 10 minutos. Em seguida, remova o gel da cassete.

Retire quaisquer reentrâncias do gel e coloque o gel e a membrana entre dois papéis filtro grossos embebidos em TBE 0,5X. Coloque o gel e a membrana dentro de um aparelho de eletrotransferência semisseco e execute a 20 volts por 30 minutos. Em seguida, coloque a membrana dentro de um equipamento comercial de cruzamento por luz UV e defina o tempo para três minutos; após desenvolver o blot usando um kit de detecção quimioluminescente, capture a imagem utilizando um computador conectado a uma câmera equipada com CCD.

Procure uma alteração na mobilidade do substrato de DNA na presença da RR, o que indica que a RR se liga ao DNA em teste. Em seguida, misture dois a três microgramas de DNA genôm游戏副本o compartilhado com 0,5 picomol de DVU 3 0 2 3 em uma solução tamponada. Após incubação da reação a 25 graus Celsius por 30 minutos, transfira 10 microlitros da mistura para um tubo de 1,5 mililitro e rotule-o como DNA de entrada.

Adicione 30 microlitros de resina de níquel NTA aros a um tubo microcêntrifugo de 0,6 mililitro. Centrifugue a amostra a 100 ×g por um minuto para recolher a resina no fundo do tubo após a centrifugação. Remova o sobrenadante neste ponto.

Adicione 100 microlitros de tampão de lavagem e agite suavemente o tubo para misturar o conteúdo. Após a centrifugação, aplique 100 Gs por dois minutos e remova o sobrenadante. Adicione os 90 microlitros restantes da reação de ligação à lavagem com a resina de NTA de níquel.

Em seguida, incube a amostra em um agitador rotativo durante 30 minutos. Ao finalizar, centrifugue a amostra a 100 Gs por dois minutos. Após a remoção do sobrenadante, repita os passos de lavagem mais três vezes.

A seguir, adicione 35 microlitros de tampão eluente à resina e misture por vortex. Incube a amostra em bancada à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a centrifugação da amostra, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e identifique-o como a fração de DNA ligado à proteína.

Em seguida, adicione 35 microlitros do tampão eluente ao DNA de entrada após a purificação das frações de DNA de entrada e de DNA ligado à proteína. Adicione 10 microlitros de cada uma a tubos de PCR separados. Em seguida, adicione um microlitro de tampão de fragmentação 10 x, dois microlitros de tampão de preparação de biblioteca e um microlitro de solução de estabilização de biblioteca a cada amostra, misturando bem as amostras por vortexagem.

Incube as amostras em um termociclador a 95 graus Celsius por dois minutos. Após a conclusão, resfrie as amostras em gelo. Em seguida, adicione um microlitro da enzima de preparação da biblioteca às amostras e misture o conteúdo por pipetagem.

Incube as amostras em um termociclador. Após a incubação, adicione 47,5 microlitros de água, 7,5 microlitros de mix mestre de amplificação 10x e cinco microlitros de polimerase a cada tubo. Após a mistura das amostras, aqueça-as em um termociclador.

Prepare reações de QPCR em triplicata para cada modelo de DNA preparando uma mistura mestra 1x para cada conjunto de primers previamente desenhado, em seguida alíquota 18 microlitros da mistura mestra por poço de uma placa de PCR de 96 poços. Dilua as amostras de DNA amplificado e purificado, bem como as amostras de DNA ligado à proteína, com água até cinco nanogramas por microlitro e adicione dois microlitros de cada amostra aos poços. Após isso, selle a placa com uma película selante UltraClear para QPCR.

Centrifugue a placa em uma centrífuga a 200 ×g por um minuto. Após colocar a placa em um ciclo de máquina de QPCR em tempo real, usando as seguintes condições para rotular o DNA de entrada com s si três e o DNA enriquecido com sci cinco, misture um micrograma de DNA com 40 microlitros de nonameros marcados com S3 SCI-FI e ajuste o volume para 80 microlitros com água. Em seguida, desnature as amostras a 98 graus Celsius por 10 minutos no escuro em um ciclador térmico.

Quando terminado, resfrie rapidamente as amostras em gelo por dois minutos, adicione dois microlitros de polimerase três primas, cinco primas exo, cinco milimolares de trifosfatos de desoxirribonucleotídeo e oito microlitros de água a cada reação. Após a mistura, incube as reações a 37 graus Celsius por duas horas no escuro em um ciclador térmico. Neste ponto, adicione EDTA até 50 milimolares para interromper as reações e solução de cloreto de sódio até 0,5 molar.

Em seguida, transfira para tubos de 1,5 mililitro contendo um volume de 0,9 de isopropanol após incubação no escuro por 10 minutos. Centrifugue as amostras a 12.000 ×g por 10 minutos. Reúna seis microgramas de cada uma das amostras de DNA marcadas S3 e sci-fi em um tubo de 1,5 mililitro e seque sob vácuo em uma centrífuga com calor baixo no escuro, cobrindo a tampa da centrífuga se ela for transparente.

Uma vez que os pellets estejam secos, suspendemo-los em cinco microlitros de água. Em seguida, adicione 13 microlitros de uma mistura mestra de solução de hibridização 1x previamente preparada às amostras após vórtex por 15 segundos, incube as amostras a 95 graus Celsius em banho seco por cinco minutos. Retire as amostras do banho seco e coloque-as em um sistema de hibridização a 42 graus Celsius até o momento do carregamento.

Em seguida, coloque o conjunto de lâmina misturadora previamente preparado dentro do sistema de hibridização. Adicione 16 microlitros da amostra na porta de preenchimento. Em seguida, feche as portas com uma película adesiva e ligue a mistura no sistema após hibridizar por 16 a 20 horas a 42 graus Celsius.

Deslize o misturador, retire o lâmina de uma ferramenta de desmontagem e coloque-a dentro de um recipiente contendo tampão morno um. Retire o misturador enquanto agita vigorosamente a ferramenta de desmontagem. Coloque a lâmina em um recipiente com 50 mililitros de tampão de lavagem um e agite vigorosamente por dois minutos.

Em seguida, repita o passo anterior com 50 mililitros do tampão de lavagem dois e 50 mililitros do tampão de lavagem três RRR DVU 3 0 2 3 deslocado. A região upstream de DVU 3 0 2 5 por QPCR mostrou que a região upstream de DVU 3 0 2 5 está enriquecida na fração ligada à proteína em relação ao DNA de entrada, indicando assim que as condições de ligação foram adequadas para DVU 3 0 2 3. DVU 0 0 1 3 foi um controle negativo. Os quatro picos superiores obtidos após a análise de DAP chipp foram escolhidos como os alvos mais prováveis, sendo DV 3 0 2 3.

O alvo positivo DVU 3 0 2 5 foi o primeiro pico obtido com a pontuação mais alta. Dois alvos gênicos são dois outros permeases de lactato codificados separadamente. O quarto alvo gênico não está localizado em uma região upstream, mas na região intergênica entre dois genes transcritos de forma convergente; as regiões upstream dos alvos obtidos foram utilizadas pelo DAP-chip meme para prever um motivo do sítio de ligação.

O motivo foi validado adicionalmente mediante substituições nas bases conservadas dentro do motivo, o que eliminou a mudança na ligação. O motivo validado foi utilizado para analisar os genomas de outras bactérias redutoras de sulfato que possuíam ortólogos DVU 3 0 2 3; os loci foram escolhidos como possíveis alvos gênicos quando o motivo estava localizado em regiões upstream de quadros de leitura aberta, utilizando sequências de motivos previstas para rs autólogos. Um motivo de sítio de ligação consenso foi gerado, o qual se assemelha estreitamente ao do Divo Garris Hilton Burrow.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o método Daptive para determinar os alvos gênicos de proteínas reguladoras. Este método pode ser empregado para analisar o tamanho da ligação de qualquer proteína reguladora, desde que a proteína possa ser purificada e a sequência do genoma seja conhecida.