Name: O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprenda o transplante de pele da cauda para estudar rejeição e tolerância mediadas por células T CD4 em camundongos. Este método minimamente invasivo permite monitorar respostas imunes sem sacrificar o animal receptor.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios SNF PPOOA-_119204 e PPOOP3_144918 para S.W.R. Agradecemos a E. Palmer e B.T.H. Hausmann pelos mouses e conhecimento técnico.

Nesta publicação de vídeo e protocolo, todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com o protocolo de animais aprovados pela Autoridade cantão Basileia-Cidade, Suíça. Execute todos os procedimentos em condições estéreis, sempre que possível. 1. Preparação de Cirurgia <ol><li> Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e gaze antes de usar. </li><li> Aqueça a almofada quente e organizar instrumentos cirúrgicos sobre a mesa (Tabela de Materiais / Métodos). </li><li> Abra as ataduras tira dedo. Aplique vaselina na almofada ferida com um cotonete (certifique-se a gaze é completamente coberto). </li><li> Pesar os ratinhos e administrar analgesia buprenorfina 0,05 mg / kg de peso corporal. Nota: este vai proporcionar analgesia imediatamente após o transplante. </li></ol> 2. Preparação do Cauda-pele para Transplante <ol><li> Eutanásia camundongos doadores (por exemplo, BM12 IA) por asfixia CO 2 e disinfect as caudas com solução desinfetante antes da excisão. </li><li> Posicione o rabo com a tarja preta para baixo em uma placa de plástico limpo e corte-o longitudinalmente ao longo da linha do meio, fazendo uma incisão superficial envolvendo apenas a camada de pele. </li><li> Retire a pele da cauda usando uma pinça agarrando. </li><li> Coloque o rabo-de pele em uma placa de cultura de 10 centímetros célula cheia com 10 ml de HBSS. </li></ol> 3. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Anestesiar ratos receptores (por exemplo, ratinhos C57BL / 6) por inalação de uma solução a 3% de isofluorano em uma caixa de indução transparente. Nota: Demora 3-5 min para o mouse para chegar a anestesia plano cirúrgico. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Coloque o mouse sobre a almofada morna e aplique 1,5% isofluorano através de uma máscara boca e bundas cada reflexo animais por toe beliscar. </li><li> Raspar o site dorsal dos ratos destinatário (por exemplo, C57BL / 6) e remover os pêlos contaminantes usando um sw gaze secaab. </li><li> Desinfetar local transplante raspada com uma solução asséptica. </li><li> Aperte a pele com uma pinça no site meio / direita do dorso e usar tesoura curva para fazer uma incisão em torno de cerca de 1 x 0.6 cm. </li><li> Se ocorrer sangramento, em seguida, limpar a ferida com um cotonete estéril. </li><li> Avaliar o tamanho da incisão e corta um transplante do tamanho estimado a partir da cauda para a pele usando o bisturi. </li><li> Apare os cantos para arredondar o transplante. </li><li> Carregue o transplante no bisturi, o excesso de seca de HBSS em um cotonete estéril e colocá-lo na cama enxerto do mouse destinatário. </li><li> Evitar a sobreposição de doador e pele de acolhimento e aplicar adesivo de tecido na zona de contato com exclusividade. </li><li> Aplicar um emplastro sem vincos ao redor da cintura do mouse. </li><li> Aplique o adesivo curativo não-elástico para fixar o gesso para o mouse (três milímetros deslocado). </li><li> Inciso com a tesoura cerca de 3 mm no site ventral superior do curativo. Nota: Isto é para evitar trapping dos dentes do rato durante a fase de recuperação. </li><li> Remova a boca-máscara anestésica e manter os ratos transplantados com a almofada de aquecimento até acordado. </li><li> Retornar ratinhos transplantados para as suas gaiolas apenas quando totalmente recuperado e avaliar a sua mobilidade para assegurar que a ligadura não seja demasiado apertado. </li><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com etanol 70%, antes de prosseguir com a próxima cirurgia. </li></ol> 4. Cuidados pós-operatórios <ol><li> Adicionar contendo paracetamol xarope para a água de beber (4 mg / ml), e administrá-lo por 7 dias. </li><li> Retorno do mouse para a sala de animais, uma vez que se recuperou. </li><li> Acompanhar de perto os ratos para sinais clínicos, incluindo depressão ou outras alterações comportamentais (comer ou imobilidade), a aparência anormal (falta de higiene) ou postura (pilo-ereção ou postura arqueada) para o tempo o curativo está em vigor (1 semana). </li></ol> 5. Remoção Bandage (6-7 dias pós-transplante) <ol><li> Anesthetize ratos por inalação de uma solução Isofluorano 3% em uma caixa de indução transparente (ver acima). </li><li> Corte curativo e gesso com uma tesoura da artéria e, cuidadosamente, remova-os. Nota: evitar o estiramento do local do transplante. </li><li> Monitorar os ratos transplantados para os sinais clínicos (ver 4.3) e marcar para a rejeição de enxertos de pele (Tabela 1). Nota: O sistema de pontuação do enxerto aproveita as diferentes texturas de cabelo na cauda-pele em comparação com o dorsal pele. A aparência do transplante e sua rejeição é classificado em 3 classes. Pele alogênico (MHC II incompatíveis, por exemplo, IA BM12) enxertos de camundongos C57BL / 6 imunocompetentes geralmente são rejeitados dentro de 12-15 dias pós transplante (próprios dados e 15-20). </li></ol>

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<li>Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+MHC+regulation+in+the+IFN-gamma+knockout+mouse.+Evidence+for+three+states+of+MHC+expression+with+distinct+roles+for+IFN-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma.</a> Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).</li>
<li>Surquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+deficiency+prevents+eosinophilic+rejection+and+uncovers+a+role+for+neutrophils+in+the+rejection+of+MHC+class+II+disparate+skin+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts.</a> Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O transplante de pele é um método amplamente utilizado para estudar a rejeição e de tolerância em células T dependentes. Desde foi criado o modelo de transplante de pele, várias adaptações e mudanças foram aplicadas. No procedimento descrito, IA BM12 transplante de cauda-de pele é realizada usando gás anestésico (isoflurano). O uso de anestesia gás diminui o tempo de execução e recuperação de ratos, o que diminui o stress em ratos transplantados. O procedimento utiliza tecido adesivo para fixar o tail-pele, q...

O transplante de órgãos sólidos, tais como a pele, o coração e os rins já é um procedimento padrão na prática médica mundial 1. Órgãos transplantados com sucesso pode ser rejeitado pela activação do sistema imune receptor, o qual reconhece os principais antigénios de histocompatibilidade dos dadores. Pacientes transplantados Portanto precisam de tratamento com drogas imunossupressoras 2. O transplante alogênico de pele em ratos foi estabelecida por Medawar e seus colegas em 1955 e foi útil para identificar as moléculas-alvo mais tarde descrito como complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II. Desde então, o modelo de transplante de pele tem sido continuamente modificado e adaptado para estudar o papel das subpopulações de células T e a relevância da química e biológica de intervenção na supressão da rejeição do enxerto 2-4. Pele da orelha e tronco são mais difíceis de preparar e são mais suscetíveis à hipóxia e necrose de pele tail-5; no entanto,o procedimento de transplante é semelhante. Além disso, o monitoramento de transplantes de cauda de pele é fácil, devido à textura do cabelo característico da pele. Este artigo fornece um procedimento detalhado para a classe II do MHC transplante incompatibilidade cauda-de pele que permite que para o estudo de diferentes aspectos dos linfócitos T CD4 + mediada por células T e tolerância rejeição do enxerto em murganhos. A mutação de três pontos natural na molécula de MHC de classe II IA b (chamado IA BM12) 6-9 é suficiente para induzir a rejeição de enxertos de pele em ratos C57BL / 6 8. A molécula BM12 IA activa as células T CD4 + com vários receptores de células αβ-T (TCR) cadeias de ratinhos C57BL / 6, entre os quais as células T Vα2Vβ8-específicos de TCR foram identificados, a fim de gerar um ratinho transgénico Tc-10. A transferência adoptiva de células T específicos de TCR Vα2Vβ8 tem sido usado para estabelecer um modelo de rejeição em C57B imunodeficienteL / 6 RAG2 - / - ratos transplantados com IA BM12 pele. As diferenças genéticas entre doador e receptor influência sobre o resultado de aceitação de transplante e rejeição. Existem diferentes tipos de transplantes: auto-enxertos são transplantados a partir do próprio indivíduo receptor; syngrafts e enxertos são transplantes de indivíduos geneticamente idênticos e geneticamente não relacionadas, respectivamente. A aceitação de transplante de órgãos alogénicos foi demonstrada por intervenção química e biológica de pacientes e de modelos de rato 11,3,4. Numa abordagem básica, anti-CD3 tratadas com anticorpo C57BL / 6 ratos mostraram sobrevivência prolongada de IA BM12 cauda-de pele (dados não publicados). A depleção de células T CD4 + e CD8 +, células T antes do transplante em ratinhos receptores resultou na aceitação do MHC de classe I e II enxertos incompatíveis (rev. em 12). Curiosamente, a rejeição de enxertos de pele depende da presença de células T CD4 + </sup&gt; As células T (Rev. em 12). Neste modelo, tendo como alvo as interacções específicas entre as células imunes diferentes, bloqueando as moléculas de co-estimulação com anticorpos ou com supressão de células T reguladoras, pode induzir tolerância (dados não publicados). Na verdade, bloqueando tanto CD40 e CD28 levou a longo prazo a tolerância do enxerto de pele 13,14. O transplante de pele da cauda-é fácil de realizar e é fácil de monitorizar em comparação com o transplante de outros órgãos. Além disso, os transplantes de pele de cauda são fáceis de preparar e são menos susceptíveis à isquemia do que os outros tecidos da pele. Em contraste com os anestésicos injectáveis, o uso de gás anestésico (isoflurano) durante o transplante de ambos encurta o processo e o tempo de recuperação do destinatário. Curling do transplante de cauda-de pele, o que pode conduzir a cicatrização incompleta e rejeição de enxerto, é evitada por aplicação de adesivo de tecido. Além disso, o modelo de transplante de pele da cauda-IA BM12 ativa exclusivamente CD4 <sup&gt; + Células T, tanto em imunocompetentes e camundongos imunodeficientes (do mesmo fundo genético) facilitando a interpretação dos resultados. Este protocolo descreve um modelo fiável, reprodutível e facilmente monitorado rato que permite a intervenção química e biológica. O modelo destina-se a investigar a rejeição ea tolerância indução de transplantes de rabo-de pele.

<table><tbody><tr><td>Solução padrão Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonete</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>31025060</td><td></td></tr><tr><td>Dafalgan , UPSA</td><td>Bristol Myers Squibb UPSA Hansaplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tiras de dedo</td><td>Beierdorf AG</td><td>REF.76861</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl adesivo tecidual</td><td>Braun</td><td>REF.1050052</td><td></td></tr><tr><td>Leukotape classic , 2 cm x 10 m</td><td>BSN Medical SAS</td><td>REF.02204-00</td><td></td></tr><tr><td>PBS, solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010015</td><td>GIBCO</td></tr><tr><td>Gaze estéril, 5 x 5 cm, 8 camadas</td><td>MaiMed GmbH</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de padrão estreito</td><td>FST</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris fina curva</td><td>FST</td><td>14095-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris fina</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mayo</td><td>FST</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de artéria com ponta esférica 11,5 cm</td><td>FST</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de tecido</td><td>FST</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica nº 20</td><td>Swann-Morton LTD</td><td>3006</td><td>Aço carbono</td></tr><tr><td>Cabos de lâmina cirúrgica</td><td>Seringa Swann-Morton LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml</td><td>ARTSANA</td><td></td><td>Descartável</td></tr><tr><td>Temgesic, buprenorfina</td><td>ESSEX Chemie AG</td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos 10 cm, 60,1 cm2</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Vifor SA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada quente</td><td>Solis</td><td></td><td>Tipo 223</td></tr></tbody></table>

o transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células t cd4 alogênico em camundongos

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

O estudo das respostas das células T e suas consequências durante o reconhecimento do aloantígeno requer um modelo que permita distinguir entre células T doadoras e hospedeiras, monitorar facilmente o enxerto e adaptar o sistema para responder a diferentes questões imunológicas. Medawar e colegas estabeleceram o transplante alogênico de pele da cauda em camundongos em 1955. Desde então, o modelo de transplante de pele tem sido continuamente modificado e adaptado para responder a perguntas específicas. O uso da pele da cauda torna este modelo fácil de pontuar para a rejeição do enxerto, não requer preparo extensivo nem anestesia profunda, é aplicável a animais de todos os antecedentes genéticos, desencoraja a necrose isquêmica e permite intervenção química e biológica. 
Em geral, as células T alogênicas CD4+ e CD8+ são responsáveis pela rejeição de aloenxertos, uma vez que reconhecem antígenos principais de histocompatibilidade incompatíveis de diferentes cepas de camundongos. Vários modelos foram descritos para ativar células T alogênicas em camundongos transplantados de pele. A identificação de moléculas de classe I e II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em diferentes cepas de camundongos, incluindo camundongos C57BL / 6, foi um passo importante para a compreensão e estudo das alorespostas mediadas por células T. No modelo de transplante de pele da cauda descrito aqui, uma mutação de três pontos (I-Abm12) no sulco apresentador de antígeno da molécula MHC CLASSE II (I-A b) é suficiente para induzir forte ativação alogênica de células T CD4+ em camundongos C57BL/6. Enxertos de pele de camundongos I-Abm12 em camundongos C57BL/6 são rejeitados dentro de 12-15 dias, enquanto enxertos singênicos são aceitos por até 100 dias. A ausência de células T (camundongos CD3-/- e Rag2-/-) permite a aceitação do enxerto de pele por até 100 dias, o que pode ser superado pela transferência de 2 x 104 células T selvagens ou transgênicas. As células T transferidas adotivamente proliferam e produzem IFN-γ em camundongos Rag2-/- transplantados combm12 I-A.

Numa primeira abordagem C57BL / 6 foram transplantadas com IA allografts BM12 e IA b syngrafts. Após a remoção curativo, enxertos sinais manifestos de cicatrização de feridas, sem encerramento da zona de contato em camundongos C57BL / 6 (Figura 1A). Após a remoção do penso, a inflamação mediada por células T CD4 +, conduziu ao aparecimento de áreas necróticas (manchas vermelhas) e rejeição de aloenxertos IA BM12 em ratinhos C57BL / 6 no espaço de 13 dias após ...

O transplante de pele da cauda é um modelo poderoso para estudar a rejeição dependente de células T e a indução de tolerância durante respostas imunes alogênicas em camundongos. As vantagens deste protocolo são pequenas cirurgias invasivas e facilidade de monitoramento sem a necessidade de sacrificar o camundongo receptor.

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é realizar o transplante de pele da cauda. Para estudar a rejeição mediada por linfócitos T ou a indução de tolerância em um modelo murino, isso é realizado primeiramente colhendo a pele da cauda de um camundongo doador. Na segunda etapa, o local de transplante é preparado no animal receptor.Em seguida, o enxerto é transplantado e fixado com adesivo tecidual e um curativo no passo final. O curativo é removido no sétimo dia após o transplante e o enxerto é avaliado. Por fim, a resposta aloimune mediada por linfócitos T pode ser estudada.Esta técnica de transplante de pele da cauda fornece um modelo poderoso para estudar a rejeição dependente de linfócitos T e a indução de tolerância durante respostas imunes alogênicas em camundongos. Antes de iniciar o procedimento, abra os curativos adesivos em forma de tira e aplique vaselina sobre as almofadas para feridas com um cotonete, certificando-se de que a gaze esteja completamente coberta. Em seguida, desinfete a cauda de um camundongo doador eutanasiado com solução desinfetante.Em seguida, posicione a cauda sobre uma placa de plástico limpa. Vire a faixa preta superior para baixo e faça uma incisão superficial longitudinal através da pele ao longo da linha média da cauda. Use pinças de fixação para destacar a pele e, então, coloque o tecido em uma placa de cultura celular de 10 centímetros contendo 10 mililitros de HBSS.Raspe o local dorsal de um camundongo receptor anestesiado e use um pedaço seco de gaze para remover qualquer pelos contaminantes. Após desinfetar o local de transplante raspado com solução asséptica, pinçe a pele com pinça no lado direito médio do dorso e use tesoura curva para fazer uma incisão redonda de aproximadamente um por 0,6 centímetros de diâmetro. Em seguida, use um bisturi para cortar um enxerto da pele da cauda do doador removida, arredondando os cantos do tecido, carregue o enxerto no bisturi e remova o excesso de HBSS com um cotonete estéril.Em seguida, posicione o tecido seco sobre o leito do enxerto do camundongo receptor. Evite sobrepor a pele do doador e do hospedeiro, aplicando adesivo tecidual apenas na zona de contato. Em seguida, enrole um curativo sem dobras ao redor da cintura do camundongo e aplique uma bandagem adesiva inelástica para fixar o curativo ao camundongo, evitando que o animal prenda os dentes na bandagem.Durante a recuperação, faça uma incisão de três milímetros no lado ventral superior do material. Após a recuperação completa sobre uma almofada aquecida, devolva o animal transplantado à sua gaiola e avalie sua mobilidade. Para garantir que a atadura não esteja muito apertada, trate o camundongo com xarope de paracetamol na água do animal por sete dias.Após seis a sete dias, utilize tesouras de artéria estéreis para cortar e remover cuidadosamente os curativos, tomando cuidado para evitar esticar o local do transplante. Por fim, monitore os camundongos transplantados quanto a sinais clínicos e avalie a rejeição dos enxertos de pele. Neste experimento, camundongos C 57 BL six foram transplantados com aloenxertos IABM 12 e enxertos IAB sin.Após a remoção das ataduras, o enxerto exibiu sinais de cicatrização da ferida sem fechamento da zona de contato nos seis camundongos C57BL/6. Uma a duas semanas depois, uma inflamação mediada por linfócitos T positivos para CD4 levou ao aparecimento de áreas necróticas dentro do enxerto. A rejeição dos aloenxertos IA BM12 foi observada nos camundongos C57BL/6 dentro de 13 dias após o transplante.Embora os enxertos sín sejam tolerados por até 100 dias. A rejeição da pele de caudas com incompatibilidade de Classe II do MHC depende da presença de células T positivas para CD quatro alogênicas. Por exemplo, camundongos deficientes em células T, com nulificação do CD três E, e camundongos deficientes em células T e B, com nulificação do RAG dois, apresentam cicatrização completa da ferida e toleram enxertos I a BM 12 por até 100 dias.A aceitação do enxerto de pele caudal com 12 incompatibilidades IABM permite o estudo de linfócitos T CD4 positivos alogênicos e suas funções efetoras em um modelo murino sem patologias graves de doença. A vantagem deste modelo de transplante de pele caudal é que a análise funcional de linfócitos T CD4 positivos pode ser facilmente realizada por transferência adotiva de linfócitos T CD4 positivos específicos para antígeno. Neste experimento representativo, a transferência de dois vezes 10 à quarta potência de células A BM transgênicas específicas para antígeno foi suficiente para induzir a rejeição de enxertos IABM 12 em camundongos knockout rag dois dentro de 13 dias. Observou-se que as células A BM que expressam as cadeias TCR V alfa dois V beta oito proliferaram extensivamente no ensaio de diluição EFL seis 70 e produziram IFN gama após estimulação com PMA. Em conjunto.Esses dados demonstram que apenas algumas poucas células T CD4 positivas alogênicas são necessárias para rejeitar enxertos de pele A BM 12, tornando este um modelo ideal para a análise de células T alogênicas na ausência de patologia grave. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o transplante de pele de cauda e monitorar com sucesso a rejeição do enxerto.

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