In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores
19 de julho de 2014
O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.
O objetivo geral deste procedimento é expandir os progenitores pancreáticos multipotentes associados em um andaime 3D Matrigel, onde eles podem se diferenciar e se auto-organizar. Isso é feito isolando primeiro o pâncreas de embriões embrionários de camundongos do dia 10.5. O segundo passo é remover o mesênquima e dissociar o epitélio em células únicas e pequenos aglomerados.
A etapa final é suspender as células em matrigel e incubar o gel polimerizado para expansão. Em última análise, isso leva a organoides pancreáticos ramificados auto-organizados, semelhantes ao pâncreas embrionário de camundongo que pode ser visualizado ao vivo ou no ponto final por microscopia. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como todos os exemplos do pâncreas, é que se parte de uma população de células bem definida e menos complexa.
Os progenitores pancreáticos são mais bem mantidos em culturas de células 3D do que em 2D. Este método pode nos ajudar a responder a algumas perguntas críticas dentro do campo, como interação celular ou interação celular com a matriz. Isso acabará levando à compreensão de como a polarização surge e, portanto, também como surge a diversidade celular.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia do diabetes após a adaptação em humanos, porque podemos expandir o pâncreas que dará origem a células melhores que produzem insulina. A demonstração visual deste método é crítica, pois a etapa de remoção do tempo incrível é difícil de executar e a etapa de dissociação é importante para a formação de organoides de órgãos. Para começar, coloque um embrião de camundongo que foi previamente isolado no dia embrionário 10,5 em uma placa de Petri limpa de 35 milímetros em PBS.
Em seguida, use uma pinça fina de aproximadamente 0,05 milímetro de largura para remover o membro anterior. Insira suavemente a pinça na abertura para separar o trato digestivo da região da medula espinhal. Localize o estômago, fígado e intestino no embrião.
Em seguida, use as agulhas para isolar o trato gastrointestinal do estômago ao intestino. Coloque o trato gastrointestinal no DMM frio no gelo. Repita a etapa anterior para isolar cada trato gastrointestinal individual.
Mantenha os tratos gastrointestinais individuais em poços diferentes. Em uma placa de 24 poços com DMM frio no gelo, só é necessário mantê-los separados se o genótipo for importante. Coloque um trato gastrointestinal em uma placa de Petri limpa de 33 milímetros em PBS frio e visualize em um microscópio de dissecção usando a iluminação de baixo como campo claro.
Quando o trato gastrointestinal estiver em foco, disseque o broto pancreático dorsal usando línguas afiadas eletrolíticas em vez de agulhas ou agulhas de seringa de calibre 20. Isole o broto pancreático com o mínimo de mesênquima possível ao redor do epitélio. Coloque o broto isolado em uma placa de Petri e incube em um ponto frio de 25 miligramas por mililitro para a solução espacial por dois a três minutos.
A partir deste ponto, ao transferir o broto, use um capilar de vidro de 50 microlitros puxado por chama preso a um tubo flexível controlado pela boca. Coloque o broto na solução enquanto estiver sob controle microscópico. Coloque um broto pancreático de volta no PBS.
Em seguida, limpe o broto pancreático isolado do mesênquima usando as agulhas e aspire suavemente com o capilar de vidro. Depois que todo o mesênquima for removido, lave o broto pancreático em PBS frio e transfira cada broto para poços individuais. Em uma placa de 60 poços contendo 10 microlitros de DMM frio por poço.
Para enxaguar os botões pancreáticos dissecados, pipete cada botão em poços cônicos individuais e uma mini bandeja de 60 poços contendo 10 microlitros de PBS por. Em seguida, transfira o broto pancreático para um poço contendo 10 microlitros de 0,05% de tripsina e incube por quatro minutos. A 37 graus Celsius, inative a tripsina transferindo o broto para um poço contendo 10 microlitros de DMM com 10% de soro fetal de bezerro pipee a suspensão celular através de um capilar fino puxado com um extrator de pipeta para dissociar as células.
A dissociação parcial é recomendada porque os organoides pancreáticos começam de forma ideal a partir de pequenos grupos de cinco a 15 células. Agrupe as células de vários embriões em um tubo einor para minimizar as diferenças resultantes do processamento individual. Diluir a suspensão celular na proporção de um para três em matrigel resfriado.
Alíquota da suspensão de células diluídas em uma placa de quatro poços ou uma placa de 96 poços por pipetagem. Oito microlitros por poço. Incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos para permitir que o gel matri engrosse.
Encha o micro poço com meio de cultura e coloque a placa em um ambiente umidificado a 37 graus Celsius contendo 5% de CO2 e 95% de ar. Substitua o meio a cada quatro dias e monitore as colônias pancreáticas em crescimento diariamente. Documente o processo de crescimento usando microscopia de lapso de tempo, células progenitoras pancreáticas dorsais de camundongos embrionários.
O dia 10.5, cultivado em meio organoide, apresentou expansão de aglomerados de células ao longo do período de cultivo de sete dias e começou a se ramificar após quatro dias. As células individuais não se expandiram e perderam uma expressão de PDX. Enquanto os grandes clusters mantiveram pdx.
Uma expressão, células progenitoras pancreáticas cultivadas em esfera. O meio se expandiu com mais frequência do que no organoide. Além disso, Illumina foi detectado no segundo ou terceiro dia e uma expansão adicional levou a esferas ocas monocamadas com áreas locais ocasionais de várias camadas.
A análise histológica de um organoide de sete dias confirmou a composição de progenitores pancreáticos, conforme mostrado pela coloração positiva para células diferenciadas H NF one B e PDX one, também foi identificada pela coloração para o marcador exócrino amilase e o marcador endócrino insulina. As esferas expressas de forma mais homogênea. Os marcadores progenitores pancreáticos hnf um B e PDX um e diferenciados menos que os organoides.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não dissociar totalmente as células após este procedimento. Você pode tratar esses organoides como se fosse um pequeno órgão. Portanto, você pode executar o QPCR normal.
Você pode realizar QPCR de célula única, fazer imagens ao vivo. Você pode fazer imuno-histoquímica e, ao fazer todos esses métodos, você pode ter um, você pode obter uma compreensão da dinâmica celular que está acontecendo nisso, neste pequeno órgão como estrutura, você pode incubar com pequenos produtos químicos e, portanto, interagir com as diferentes vias de interesse. Esta técnica abrirá caminho para os pesquisadores identificarem os mecanismos de desenvolvimento do pâncreas e melhor formação celular no momento em camundongos, mas no futuro, a partir de células ESLs humanas ou IP S.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer um pequeno pâncreas que imite o desenvolvimento normal do pâncreas de alguns progenitores em ambiente cultural 3D.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método de cultura tridimensional que imita o desenvolvimento do pâncreas a partir de progenitores pancreáticos de camundongo embrionário. Permite expansão substancial, diferenciação e morfogênese em um órgão ramificado, adequado para imageamento e manipulação funcional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Pesquisa com Células-Tronco
Contexto
- O desenvolvimento do pâncreas é essencial para compreender a organogênese.
- Os métodos existentes geralmente partem de populações celulares complexas.
- As técnicas de cultivo 3D aprimoram o estudo do desenvolvimento de órgãos.
- A imagem em tempo real de organoides pode fornecer informações sobre comportamentos celulares.
Objetivo do Estudo
- Expandir progenitores pancreáticos multpotentes em um ambiente controlado.
- Facilitar a diferenciação e auto-organização em estruturas pancreáticas.
- Aprimorar os métodos tradicionais de explante de pâncreas.
Métodos Utilizados
- Isolamento do pâncreas de embriões de camundongos do dia embrionário 10,5.
- Remoção do mesênquima e dissociação do epitélio em células isoladas.
- Suspensão das células em Matrigel para polimerização.
- Incubação do gel para promover a expansão celular e a formação de organoides.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de organoides pancreáticos ramificados com autoorganização.
- Os organoides assemelham-se à estrutura do pâncreas embrionário de camundongo.
- O método permite a visualização em tempo real e a análise microscópica em ponto final.
- Vantagens demonstradas em comparação com as técnicas existentes de explante pancreático.
Conclusões
- O método de cultivo 3D é eficaz para o estudo do desenvolvimento do pâncreas.
- Ele fornece uma população celular inicial menos complexa para a pesquisa.
- Essa técnica pode aprimorar nossa compreensão da organogênese pancreática.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este sistema de organoides tridimensionais permite a expansão escalonável de progenitores pancreáticos definidos, apoiando estudos mecanicistas de organogênese e interações célula-matriz. Ele fornece uma plataforma reprodutível para reduzir riscos na validação de alvos em vias relacionadas ao diabetes, modelando processos de desenvolvimento relevantes ao ser humano. A abordagem reduz a complexidade biológica preservando características morfogenéticas essenciais, aumentando a confiança preditiva na avaliação pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar interações de células progenitoras e sinalização do nicho em um microambiente tridimensional controlado.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade ao partir de uma população celular bem definida e menos complexa, em comparação com métodos de explante.
- Valor Estratégico: Apoia a validação orientada por hipóteses de alvos envolvidos na ramificação pancreática, diferenciação e formação de células produtoras de insulina.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera resultados quantificáveis de organoides, como morfologia de ramificação e expressão de marcadores, para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Compatível com imagem em tempo real e análise de ponto final, permitindo avaliação longitudinal dos efeitos de compostos.
- Valor Estratégico: Facilita a padronização de ensaios para avaliação de moduladores da expansão de progenitores e diferenciação endócrina.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Recapitula estágios-chave do desenvolvimento do pâncreas relevante para humanos, incluindo a especificação das linhagens endócrina e acinar.
- Valor Operacional: Permite aplicações posteriores, como qPCR, imunohistoquímica e imagem em tempo real, para desvio mecanicista de riscos.
- Valor Estratégico: Possibilita a avaliação pré-clínica de compostos sobre morfogênese e maturação funcional antes da otimização do fármaco líder.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo um sistema biologicamente relevante para avaliar os efeitos de compostos no comportamento e na diferenciação de progenitores pancreáticos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao modelar interações célula-célula e célula-matriz essenciais para a formação do pâncreas.
- Triagem: Permite leituras reproduzíveis e quantitativas, como expressão de PDX1, ramificação e produção hormonal, para validação de alvos.
- Análises: Fornece saídas multimodais, incluindo imagens, expressão gênica e localização proteica, para informar relações estrutura-atividade.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta ao trabalho pré-clínico gerando organoides que imitam a arquitetura e função do pâncreas embrionário.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalonável e modular aplicável a múltiplos projetos que estudam o desenvolvimento e as doenças pancreáticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas decisões de destino das células progenitoras.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio de etapas padronizadas de dissociação e incorporação em Matrigel.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao permitir a redução de riscos biológicos em estágios iniciais, antes da otimização dispendiosa de compostos líderes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação funcional em um sistema tridimensional fisiologicamente relevante.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos embrionários e manipulação microfluídica para isolamento consistente de progenitores.
- Depende do acesso a Matrigel, sistemas de incubação controlados e microscopia com captura de tempo-lapse para monitoramento longitudinal.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de dissociação e agrupamento celular para garantir a fidelidade na formação de organoides.
- Envolve considerações de adaptação ao transpor o protocolo de progenitores derivados de células-tronco pluripotentes de camundongo para humanos.
- Limitado pela necessidade de evitar cuidadosamente a dissociação completa, já que a iniciação de organoides depende de pequenos aglomerados celulares (5–15 células).
