Name: In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a gerar organoides pancreáticos ramificados a partir de progenitores embrionários de rato em cultura 3D com Matrigel. Este método permite expansão, diferenciação e auto-organização celular para estudos de organogênese pancreática.

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Este trabalho foi financiado por uma seqüência Fronteiras NCCR em Genética prêmio piloto, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 e Grant 12-126875 de Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Os autores agradecem o laboratório Spagnoli por sediar a gravação de vídeo.

Este protocolo destina-se a crescer organoids pancreáticas derivados de E10.5 de murino dissociadas células pancreáticas epiteliais. O protocolo exige aprovação ética para experimentação animal. 1. Dissecção da Dorsal pâncreas Bud de E10.5 embriões de camundongos <ol><li> Sacrifício camundongos cronometrado grávidas no dia embrionário (E) 10,5, abrir o abdômen com uma tesoura, retire os dois cornos uterinos e coloque-os em um prato de 10 centímetros de Petri cheia de fosfato frio salina tampão (PBS) ou Dulbecco modificado meio essencial (DMEM) conservados em gelo. O experimento total a partir do sacrifício a semeadura de células é feito em 60-90 min para evitar danos nas células. </li><li> Separe o útero em segmentos de embriões individuais usando uma tesoura pequena. Transferência de um embrião para um prato de 35 milímetros Petri com PBS frio e visualizá-lo sob um microscópio de dissecação com iluminação de cima. Com uma pinça de dissecção remover o músculo, decídua e gema em torno sac e expor o embrião. Coloque o embrião de volta para o meio de DMEM frio. Os embriões podem ser facilmente transferidas usando um 3 ml de transferência de pipeta de plástico / conta-gotas. Isolar cada embrião indivíduo de uma forma semelhante, antes de continuar. </li><li> Coloque um embrião em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri em PBS. <ol><li> Use uma pinça fina (largura 0,05 mm) para remover o membro anterior. Suavemente inserir a pinça na abertura para retirar o tracto digestivo da região da medula espinhal (Figura 1). Opcional: Para ver mais convenientemente o estômago, remover a parte superior do corpo do embrião, para baixo para o coração e a região da cauda a seguir a haste de gema. </li><li> Localize o estômago, fígado e intestino. Usando fórceps, isolar o tracto gastrointestinal a partir do estômago para o intestino e colocá-lo em DMEM frio em gelo (Figura 1). O botão de pâncreas dorsal está ligado dorsalmente, posterior ao estômago (Figura 1). </li><li> Isolar cada trato gastrointestinal individual em um similar forma antes de continuar. Se os embriões precisam ser genotipados, recolher a cauda no momento do esvaziamento e manter cada tracto gastrointestinal num indivíduo bem diferente em uma placa de 24 poços com DMEM frio em gelo. </li></ol></li><li> Coloque um trato gastrointestinal em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri em PBS frio. Agora use iluminação abaixo em campo claro de visualizar e dissecar o dorsal gemas pancreático sob o microscópio de dissecação. Estas condições irão optimizar a visualização de volumes. Usando agulhas de tungstênio eletroliticamente-afiadas ou 20 g de agulhas de seringa, isolar o broto pancreático com tão pouco quanto possível mesenchyme ao redor do epitélio (Figura 1). <ol><li> Transferir o botão isolado em uma placa de Petri contendo uma solução fria de dispase (1,25 mg / ml) durante 2-3 min. A partir deste ponto, a transferência pode ser realizada mais convenientemente com capilares de vidro de 50 mL puxou-chamas ligados a um tubo flexível controlada aftosa. Em alternativa, mas com mais risk de perder pela raiz, use a 10 mL pipeta automática (Pipetman) com pontas de plástico apropriados. </li><li> Realize bud aspiração e ejeção de pâncreas sob controle microscópico. Coloque o broto pancreático volta em PBS. Além disso limpar a gema de pâncreas isolado do mesênquima com as agulhas e aspiração suave usando o capilar de vidro (Figura 1). </li><li> Quando todo o mesênquima é removido, lave o broto pancreático em PBS frio; transferir cada broto de DMEM frio em poços individuais (60 poços mini-bandejas cheias com 10 ml de DMEM frio). É importante não remover o mesênquima em dispase, o que torna o tecido muito pegajosa. </li></ol></li></ol> 2. Chapeamento e Cultura de células dispersas <ol><li> Transfira o epitélio dissecado de todos os embriões com um capilar de vidro, puxado-chama em poços cônicos de 60 poços mini-bandejas cheias de 10 mL PBS para enxaguar. <ol><li> Transferir o botão em 10 ul de tripsina a 0,05% de umnd deixe incubar a 37 ° C durante 4 min. Inactivar a tripsina pela transferência do broto para um poço com 10 mL de DMEM + 10% soro fetal bovino (FCS). </li><li> Dissociar a suspensão de células por aspiração através de um capilar fino puxado com um puxador de pipeta. É importante evitar bolhas nesta fase, enquanto pipetando para cima e para baixo para dissociar as células. Organoids Pâncreas optimamente começar a partir de pequenos grupos de 5-15 células e, portanto, a dissociação parcial é recomendada (Figura 1). </li></ol></li><li> Reunir as células de vários embriões para um tubo Eppendorf, a fim de minimizar as diferenças devidas ao processamento individual. Dilui-se a suspensão de células em Matrigel refrigerados a uma razão de 1:3. Aliquota desta mistura para uma placa de 96 poços, 8 ul / poço ou numa placa optimizado para imagiologia (ver abaixo). </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 5 minutos, permitindo que o Matrigel para engrossar. Preencha os poços com 70 mL de meio de escolha (organóides ou esfera, consulte Tables 1 e 2) e deixar em um ambiente humidificado contendo 5% de CO 2 e 95% de ar a 37 ° C. </li><li> Substituir o meio de cada 4 º dia. Monitorar as crescentes colônias pancreáticas diário e documentar o processo de geração de imagens. </li><li> As moléculas pequenas ou proteínas de interesse pode ser adicionado ao meio, nesta fase, para as experiências de interferência, como relatado anteriormente 28. </li></ol> Tabela 1: médio organóides. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome de Materiais </td><td> Banco de Concentração </td><td> Concentração na mídia final </td><td> Volume de estoque </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> KnockOut substituição Serum (suplemento) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 14,3 M </td&gt; <td> 0,1 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Phorbol Myristate acetato (PMA) </td><td> 16 uM </td><td> 16 nM </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (inibidor ROCK) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 ng / mL </td><td> 25 ng / mL </td><td> 2,5 mL </td></tr><tr><td> Recombinante Humana R-espondina 1 </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> - Ou - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Recombinante do rato R-espondina 1 </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Recombinante FGF1 humano (aFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 25 ng / mL </td><td> 1,25 mL </td></tr><tr><td> A heparina (Liquemine) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2,5 U / mL </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RecomFGF10 Humano binant </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / mL </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 mL </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td></td><td> 5000 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 2: médio Sphere. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome de Materiais </td><td> Banco de Concentração </td><td> Concentração na mídia final </td><td> Volume de estoque </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> B27 x50 (suplemento) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Recombinante FGF2 humano (bFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 64 ng / mL </td><td> 3,2 mL </td></tr><tr><td> Y-27632 (inibidor ROCK) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845,8 mL </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td></td><td> 5000 mL </td></tr></tbody></table> 3. Imagem da Progressão de Desenvolvimento organoide <ol><li> Imagem organoids quer diárias ou por microscopia de lapso de tempo usando um microscópio fluorescente time-lapse. Por lapso de tempo de imagem, use um XY (Z) microscópio de fluorescência invertido automatizado. </li><li> Depósito pequenas gotículas de 3 mL em placas de 4 poços ou placas com fundo de vidro preenchidos com 2-5 ml médio. Imagem com um objetivo de longa distância 10x. Nota: Os ratinhos transgénicos que expressam marcadores fluorescentes podem ser usados. Filme 1 mostra, por exemplo, a expansão inicial de organoids de Pdx1-Ngn3-ER TM-ires-nGFP + camundongos 4. A GFP nuclear permite ao utilizador controlar as células como objectos individuais, mas os mesmos princípios podem ser aplicados para controlar as células com fluorescência de membrana taiscomo MT / MG camundongos 29. </li><li> Comece lapso de tempo de imagem de 3 horas após a semeadura das células a fim de evitar desvios de foco e definir a automação controlar software para tirar uma foto / h por 3 ou mais dias, em posições definidas manualmente. Para cada posição, adquirir uma interferência diferencial contraste da imagem (DIC) bem como o sinal de GFP, a expressão do marcador fluorescente relatórios. </li></ol> 4. Recuperação de Organóides para Histologia <ol><li> Colocar a placa de 96 poços sobre gelo e remover o meio, substitui-lo com PBS gelado. Este despolimeriza parcialmente Matrigel. </li><li> Gentilmente aspirar cada organoide individual, removendo o Matrigel circundante usando uma ponta 1.000 mL, a fim de não perturbar a arquitetura geral. Transferir cada organóide para um poço com PBS gelado. Manter a placa de gelo. Fixação direta em Matrigel também é possível. </li><li> Fixe o organoide por 15 min em 4% paraformaldeído (PFA), criopreservar-lo em sacarose e incorporá-lo em gelatina. Processar cadaorganóide para cryosectioning e histologia, como descrito anteriormente (Johansson et al., 2007) 4. </li></ol> 5. Recuperação de Organóides por PCR e Bioquímica <ol><li> Colocar a placa de 96 poços sobre gelo e remover o meio. Adicionar 60 ul de RNAlater por poço, de modo a estabilizar e proteger o ARN celular. </li><li> Interromper o gel em cada poço mecanicamente por despolimerização que parcialmente em gelo. Ou recuperar organoids individuais usando uma ponta de 1.000 mL, a fim de não perturbar a arquitetura global ou recuperar todo o bem (com Matrigel) por perturbar o gel mecanicamente com um mL ponta 200. Utilizar uma ponta 1000 ul de transferir o conteúdo do poço para um tubo Eppendorf livre de não-pegajoso RNAse mantido em gelo. </li><li> Lavar os poços com 60 ul RNAlater e adicionar o restante conteúdo para o mesmo tubo de Eppendorf. </li><li> Girar os tubos durante 5 min a 500-1000 x g a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante, deixando apenas 20-30 mLde RNAlater no tubo juntamente com o pellet. Para bioquímica, armazenar as amostras o mais seco possível. </li><li> Não congelar amostras em RNAlater imediatamente; armazenar a 4 ° CO / N (para permitir RNAlater para penetrar profundamente no tecido). O tecido pode ser armazenada a -20 ° C para armazenamento a longo prazo e pode ser posteriormente processado para a ruptura de tecido e a extracção de pequenas quantidades de ARN. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A produção em grande escala de células beta funcionais in vitro ainda é ineficaz 1. Neste contexto desafiador, estudos de biologia do desenvolvimento pode ajudar a decifrar os sinais exatos que são necessários para a diferenciação das células beta funcionais. Este protocolo permite a manutenção, expansão e diferenciação de células progenitoras pancreáticas embrionárias in vitro. Isso inclui a formação de células beta produtoras de insulina que não co-expressar outros hormônios endócrinas, tê...

Cultura órgão fornece um modelo útil que preenche as lacunas entre o complexo, mas altamente relevante em investigações in vivo ea simulação conveniente, mas aproximado de modelos da linha celular. No caso do pâncreas, não existe uma linha de células perfeitamente equivalente a progenitores pâncreas embora existam linhas de células transformadas que simulam células endócrinas e exócrinas. Todo o pâncreas adulto não podem ser cultivadas; ilhotas isoladas endócrinos pode ser mantida durante algumas semanas, sem proliferação celular e fatias de tecidos podem ser mantidos in vitro durante 5 horas. Cultura pâncreas embrionário tem sido amplamente utilizado, não só para estudar o seu desenvolvimento, mas também para investigar interacções epiteliais mesenquimais 4,6,7, a imagem processa 8 ou para interferir quimicamente com eles 9. Dois métodos de cultura de órgãos são usados ​​principalmente: a primeira consiste na cultura de gomos pancreáticas em placas revestidas com fibronectina 2, que é convenient para fins de imagem; a segunda opção é a cultura dos órgãos de filtros na interface ar-líquido 3,4 que melhor preserva a morfogênese. Apesar de muito úteis, estes métodos levam a um certo grau de achatamento; a expansão de células progenitoras é muito limitado em comparação com o normal desenvolvimento e a população de partida é complexo que compreende todos os tipos de células pancreáticas e células mesenquimais. A capacidade de cultura e expandir células primárias dispersas é valioso para estudar relações de linhagem e descobrir as propriedades intrínsecas dos tipos de células isoladas 10. Sugiyama et al. 11 poderia manter progenitores pâncreas e progenitores endócrinas que retiveram alguns personagens funcionais por 3-5 dias em cultura em camadas alimentadoras. Pancreatospheres, semelhante ao neurospheres 12 e mammospheres 13, foram ampliados a partir de ilhotas adultas e células ductais embora a natureza dos progenitores / células-troncoque geram essas esferas não é clara. Além disso, em contraste com o desenvolvimento fisiológico, os pancreatospheres continha alguns neurónios 14,15. Spheres também foram recentemente produzidos a partir de células progenitoras embrionárias pâncreas 16,17 e regenerar pancreata 18 com boa expansão e diferenciação de células progenitoras subseqüente, mas não conseguiu recapitular morfogênese. Modelos 3D a partir de células dispersas e, muitas vezes definidos que se auto-organizam em órgãos miniaturizados recentemente floresceu e simular desenvolvimento ou adulto o volume de negócios de vários órgãos, como o intestino 19,20, o estômago 21, o fígado 22, a próstata 23 e traquéia 24. Em alguns casos, a morfogénese e diferenciação de desenvolvimento foram recapitulado em 3D a partir de células ES, como é o caso dos copos óptica 25, 26 do intestino ou do cérebro 27. Aqui, desCribe um método para expandir progenitores multipotentes pancreáticas dissociadas em um andaime Matrigel 3D onde podem diferenciar e se auto-organizar.

<table><tbody><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Estoque mantido em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>KnockOut Substituição de soro (suplemento)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Estoque mantido em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>Estoque mantido em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Acetato de Miristato de Phorbol (PMA)</td> <td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>Estoque mantido em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Y-27632 (inibidor de ROCK)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>Estoque mantido em -20 °C. Atenção! Estabilidade/fonte é uma fonte frequente de problemas.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>Estoque mantido em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>R-spondina humana recombinante 1</td><td>R& D</td><td>4645-RS-025 / CF</td><td>Estoque mantido em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>R-spondin 1 de camundongo recombinante</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td>Estoque mantido em -80 &graus; C</td></tr><tr><td>FGF1 humano recombinante (aFGF)</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td>Estoque mantido em -80 &deg; C - não incluir para aumentar a produção de células beta</td></tr><tr><td>Heparina (Liquemin)</td> <td>Drossapharm</td><td></td><td>Estoque mantido em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Humano Recombinante FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG-025</td><td>Estoque mantido em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Estoque mantido em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>B27 x50 (suplemento)</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Estoque mantido em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>FGF2 humano recombinante (bFGF)</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td>Estoque mantido em -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Stock mantido em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina 0,05%</td> <td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Estoque mantido em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>RNAlater - Reagente estabilizador de RNA</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Armazene na RT</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>Concentração de trabalho: 1,25 mg/ml. Estoque mantido em -20 &graus; C</td></tr><tr><td>BSA para reconstituição</td><td>Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td><td>Para reconstituição de citocinas&nbsp; - estoque mantido em -20 > C</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Estoque mantido em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Bandejas MicroWell de 60 poços</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 4 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 95 poços F fundo</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Placas inferiores de vidro</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas de vidro de descarte</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td>Estação de imagem Cell&#174; (suporte motorizado invertido Olympus IX81) equipada com uma câmera Hamamatsu ORCA ER B7W e o Ludin Cube and Box. 
O Leica DMI6000 B está cercado por um Ludin Cube and Box, equipado com uma câmera Leica DFC365 FX e a interface de comando do software AF6000 Expert/Matrix.</td></tr><tr><td>Objetiva</td><td></td><td></td><td>Olympus UPLAN FL NA 0,30 ar 9,50 mm 10X longa distância; 
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 ar 11.0 mm 10X longa distância</td></tr></tbody></table>

in vitro pâncreas organogenesis de dispersos rato embrionárias progenitores

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

O pâncreas é um órgão essencial que regula a homeostase da glicose e secreta enzimas digestivas. A pesquisa sobre a embriogênese do pâncreas levou ao desenvolvimento de protocolos para produzir células pancreáticas a partir de células-tronco 1. Todo o órgão embrionário pode ser cultivado em vários estágios de desenvolvimento 2-4. Esses métodos de cultura têm sido úteis para testar drogas e para obter imagens de processos de desenvolvimento. No entanto, a expansão do órgão é muito limitada e a morfogênese não é fielmente recapitulada, uma vez que o órgão se achata 
Propomos condições de cultura tridimensionais (3D) que permitem a expansão eficiente de progenitores pancreáticos embrionários de camundongos dissociados. Ao manipular a composição do meio de cultura, é possível gerar esferas ocas, compostas principalmente por progenitores pancreáticos que se expandem em seu estado inicial, ou organoides complexos que progridem para progenitores em expansão mais maduros e se diferenciam em células endócrinas, acinares e ductais e que se auto-organizam espontaneamente para se assemelhar ao pâncreas embrionário. 
Mostramos aqui que o processo in vitro recapitula muitos aspectos do desenvolvimento natural do pâncreas. Este sistema de cultura é adequado para investigar como as células cooperam para formar um órgão, reduzindo sua complexidade inicial a poucos progenitores. É um modelo que reproduz a arquitetura 3D do pâncreas e que, portanto, é útil para estudar a morfogênese, incluindo polarização de estruturas epiteliais e ramificações. Também é apropriado avaliar a resposta a pistas mecânicas do nicho, como rigidez e os efeitos na tensegridade celular.

E10.5 dorsais progenitores pancreáticas dissociadas e semeadas em Matrigel 3D recapitular desenvolvimento pâncreas. Progenitores pode ser mais fácil de ser seguido com repórteres fluorescentes. No nosso caso, usamos um camundongo transgênico que expressa uma proteína GFP nuclear controlada por Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Filme 1), na ausência de tamoxifeno e, portanto, sem ativar Neurog3 4 (Figura 2). Com o meio de organóide,...

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

O objetivo geral deste procedimento é expandir progenitores pancreáticos multpotentes associados em um suporte tridimensional de Matrigel, onde eles podem se diferenciar e auto-organizar. Isso é realizado primeiramente isolando o pâncreas de embriões de camundongo do dia embrionário 10,5. O segundo passo consiste em remover o mesênquima e dissociar o epitélio em células isoladas e pequenos agregados.O passo final é suspender as células em matrigel e incubar o gel polimerizado para expansão. Em última análise, isso leva à formação de organoides pancreáticos ramificados auto-organizados, semelhantes ao pâncreas embrionário de camundongo, que podem ser visualizados em tempo real ou ao final do experimento por microscopia. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como todos os explantes de pâncreas, é que se parte de uma população celular bem definida e menos complexa.Os progenitores pancreáticos são melhor mantidos em culturas celulares tridimensionais do que em culturas bidimensionais. Este método pode nos ajudar a responder algumas questões fundamentais na área, como a interação célula-célula ou a interação celular com a matriz. Isso levará, em última in

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A tridimensionais ensaio clonogênica que permite pancreático-como progenitores de se diferenciar em insulina expressar colônias é descrito. Este método tira vantagem de semi-sólido mídia contendo fatores Matrigel metilcelulose, e crescimento, no qual progenitores única proliferam e se...

Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

O presente estudo descreve uma abordagem diferenciada dirigida em induzir a diferenciação de pâncreas de células estaminais embrionárias humanas. De grande importância é a constatação de que células endoteliais co-cultura maturação media de células-tronco embrionárias humanas derivadas progenitores pâncreas em células que expressam insulina.

Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma...

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

Um protocolo para isolar, os clusters da cultura e imagem de células ilhotas (CCI) derivadas de células pancreáticas fetais humanos é descrito. O método detalha os passos necessários para gerar CCIs de tecido, cultura como monocamadas em suspensão ou na forma de agregados, e imagem para os marcadores de proliferação e decisões destino celular do pâncreas.

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a gerar organoides pancreáticos ramificados a partir de progenitores embrionários de rato em cultura 3D com Matrigel. Este método permite expansão, diferenciação e auto-organização celular para estudos de organogênese pancreática.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

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