Marcador de superfície celular Purificação Mediada de iPS Intermediários celulares a partir de um modelo Reprogramável mouse

O objetivo geral deste procedimento é isolar os raros intermediários de reprogramação de culturas de fibroblastos embrionários de camundongos reprogramados. Isso é feito derivando primeiro fibroblastos embrionários de camundongo de embriões E 13.5 de uma linhagem de camundongo reprogramável. Na segunda etapa, os fibroblastos embrionários de camundongo de baixa passagem são semeados em células-tronco pluripotentes induzidas ou meios de células IPS suplementados com doxiciclina para iniciar o processo de reprogramação.

Em seguida, as células são colhidas em pontos de tempo selecionados durante a reprogramação e marcadas com anticorpos contra marcadores específicos da superfície celular. Em última análise, os raros intermediários de reprogramação podem ser isolados por fatos para análise experimental posterior. A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes é que estudos mecanísticos podem ser realizados nos raros intermediários de reprogramação na ausência de células refratárias ao processo de reprogramação, que compõem a maior parte da população Para gerar embrionários de camundongos, fibroblastos ou mes, comece transferindo um chifre uterino embrionário de 13,5 dias para uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros contendo 10 mililitros de PBS estéril.

Em seguida, use uma tesoura esterilizada de grau cirúrgico para cortar o chifre em pedaços individuais, cada um contendo um embrião. Em seguida, sob um microscópio de dissecção em uma capa de cultura de tecidos, use uma pinça esterilizada para remover cuidadosamente o envelope uterino e a membrana embrionária extra ao redor de cada embrião e transfira cada embrião desnudo para placas individuais de 10 centímetros com 10 mililitros de PBS fresco. Em seguida, prossiga removendo a cabeça, os membros, a cauda e os órgãos internos de cada embrião com uma pinça.

Congele as cabeças em tubos individuais de 1,5 mililitro para genotipagem, conforme necessário. Transfira cada tronco para novas placas individuais de 10 centímetros e use duas lâminas cirúrgicas para picar cada embrião por dois minutos. Digerir os pedaços de tecido em 200 microlitros de tripsina EDTA durante três a cinco minutos à temperatura ambiente, seguidos de mais dois minutos de picagem.

Em seguida, desative a tentina com dois mililitros de meio de metanfetamina e transfira a pasta celular para um tubo de 15 mililitros usando uma pipeta de 1000 microlitros. Além dissociar mecanicamente o tecido com pipetagem suave e, em seguida, transferir a solução celular para um prato de 10 centímetros revestido de gelatina. Adicione mais 10 mililitros de metanfetamina à cultura.

Após 24 a 48 horas, a placa deve ser densamente coberta com MEFs para reprogramar os MEFs primeiro descongelar uma cultura de metanfetamina congelada de passagem baixa em um banho-maria de 37 graus Celsius e, em seguida, transferir o conteúdo para um tubo contendo 10 mililitros de meio de metanfetamina pré-aquecido. Depois de girar as células, ressuspenda o pellet em 12 mililitros de meio de metanfetamina fresco e transfira a suspensão celular para um recipiente de cultura T 75 revestido de gelatina. Após um período de recuperação de 24 a 48 horas, lave os MEFs com PBS e, em seguida, retire as células com três mililitros de tripsina EDTA por três a cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, pare a digestão enzimática com cinco mililitros de metanfetamina e dissocie ainda mais as células misturando suavemente com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, reprograme as metástases semeando as células em uma nova gelatina, frascos T 75 revestidos a 6,7 vezes 10 para as terceiras células por centímetro quadrado em 12 mililitros de meio IPSC contendo dois microgramas por mililitro de doxiciclina nos primeiros seis dias. Substitua o meio em dias alternados por meio IPSE suplementado com doxiciclina fresca, colhendo os intermediários de reprogramação nos pontos de tempo necessários por descolamento de tripsina EDTA, conforme demonstrado para cada suspensão intermediária colhida.

Lave as células em PBS. Então resus. Suspenda os pellets em mídia de fax para marcação de anticorpos para estabelecer culturas IPSC totalmente reprogramadas.

Cultive as células em meio IPSC livre de doxiciclina por mais quatro a sete dias para rotular as células reprogramadas. Rotule os intermediários colhidos com os anticorpos apropriados de interesse. Após 10 minutos, bata suavemente nos tubos para ressuspender as células e, em seguida, coloque os tubos no gelo por mais 10 minutos.

Após a segunda incubação, lave as células em 10 mililitros de PBS frio por tubo. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os pellets em um volume apropriado de meio de rotulagem complementado com strippin P tamanho sete em gelo. Após 20 minutos, lave as células em mais 10 de PBS frio e ressuspenda os grânulos celulares em meios de marcação suplementados com iodeto de propídio.

Filtrar quaisquer aglomerados de células passando a suspensão por um filtro de 70 micrómetros e, em seguida, transferir as células para os tubos de fax correspondentes apropriados no gelo. Para os controles de compensação. Resus suspende um frasco criogênico de células IPS mantidas em mes irradiados em 800 microlitros de tampão de marcação.

Reservando 200 microlitros de células para o controle de controle não rotulado. Em seguida, divida a suspensão de célula restante entre três tubos de 15 mililitros para os controles de cor única e rotule as amostras como acabamos de demonstrar para analisar os intermediários por citometria de fluxo. Comece definindo um portão no gráfico de dispersão para frente a lado para excluir detritos.

Em seguida, use a altura de dispersão direta versus a área de dispersão direta para excluir os agregados e o canal PI versus a dispersão direta. Para bloquear as células vivas PI negativas. Use as células não rotuladas para ajustar as tensões para os sete canais FITC e PSI azuis do Pacífico.

Idealmente, posicionar a população de células na extremidade inferior do respectivo canal. Em seguida, defina as portas com as células de controle não rotuladas para subfracionar as culturas de reprogramação nos dias três, seis e nove. Populações de SSEA uma célula negativa de TH 1,2 positiva, SSEA de uma célula negativa de TH 1,2 negativa e os intermediários de reprogramação de células negativas de SSEA, uma célula positiva de TH 1,2 negativa.

Em seguida, subdivida ainda mais o dia nove SSEA uma fração negativa TH positiva 1,2 com o gráfico SSEA um versus EPAM. Usando o controle não rotulado, desenhe portas ao redor das células positivas de EPAM e das células negativas de EPAM, conforme mostrado aqui. Finalmente, colete as células em um a dois mililitros de mídia celular IPS.

Após a indução da doxiciclina, os mitos de reprogramação sofrem mudanças morfológicas distintas por volta do sexto dia. Começam a surgir manchas semelhantes a colônias primitivas que continuam a crescer em tamanho com o cultivo posterior. Um bom experimento de reprogramação resultará em mais de 500 colônias por T 75 inicialmente semeadas com cinco vezes 10 elevado à quinta células e as culturas IPS estabelecidas possuirão colônias características em forma de cúpula e serão em sua maioria desprovidas de células diferenciadas.

Mudanças morfológicas e moleculares durante a reprogramação são refletidas em mudanças na expressão da superfície celular da coxa 1.2 SSEA e, finalmente, epca. Embora os MES sejam predominantemente positivos para a coxa 1.2 e negativos para os outros marcadores, no terceiro dia, uma grande proporção de células começou a regular negativamente a expressão da coxa 1.2, e um subconjunto muito pequeno tornou-se SSEA um positivo. O intermediário de reprogramação real para este ponto de tempo nos dias seis e nove, uma porcentagem aumentada de células positivas para SSEA, geralmente bem acima de 10%, pode ser detectada por volta do dia 12.

Um subconjunto de células positivas para SSEA um pode ser detectado que também são positivos. Para epca. As culturas de células IPS genuínas estabelecidas serão fortemente positivas.

Para SSEA one e EPCA Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar apenas mapas de passagem baixa que tenham sido devidamente genotipados de antemão.