Name: Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a diferenciar neurônios dopaminérgicos A9 de células-tronco pluripotentes humanas com alta eficiência. Este protocolo otimizado é essencial para modelar a doença de Parkinson e desenvolver terapias de reposição celular.

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Os autores agradecem aos membros do laboratório Renee Reijo Pera pela ajuda durante o desenvolvimento deste protocolo e durante a preparação deste manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo laboratório compartilhado do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (CL-00518).

1 Preparação de Meios de Cultura <ol><li> Prepare de fibroblastos de rato embrionário (MEF) forma, combinando o seguinte: 445 ml de DMEM, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), e solução de reserva de 5 ml de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 14 dias. </li><li> Prepare HPSC meio de cultura através da combinação do seguinte contendo soro: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de soro de substituição nocaute (KSR), 5 ml de 100x não essencial solução solução de estoque de aminoácidos, 5 ml penicilina 100x / estoque ampicilina, 5 ml de 100x mercaptoetanol a solução estoque, e 10 ng / ml de bFGF. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias. </li><li> Prepare a meio isento de soro mTeSR1 combinando o seguinte: 400 ml de meio basal mTeSR1, 100 ml de suplemento de 5x, e 5 ml de solução de estoque de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha meio a 4 ° C por não mais que 10 dias. </li><li> Preparar a solução estoque 10x colagenase IV: pesar 0,5 g de energia colagenase IV, edissolvê-la com 50 ml de DMEM / F12 e filtro de esterilizar. Faça alíquotas e armazená-las à temperatura de -20 ° C durante meses. </li><li> Preparar a solução de gelatina a 0,1%: pesam-se 0,5 g de gelatina (a partir de pele de bovino, de tipo B) de alimentação e dissolvê-lo com água desionizada. Mantenha a solução esterilizada em autoclave à temperatura ambiente durante semanas. </li><li> Preparar meio de diferenciação KSR combinando o seguinte: 410 ml de DMEM, 75 mL KSR, 5 ml 100x solução não-essencial estoque de aminoácidos, 5 ml penicilina 100x / solução estoque ampicilina, 5 ml de solução de estoque 100x mercaptoetanol. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias. NOTA: KSR varia de lote para lote, o que pode afetar a eficiência de diferenciação. Por isso, é melhor testar vários lotes de KSR para encontrar o melhor para a diferenciação. </li><li> Preparar meio de diferenciação N2 combinando o seguinte: 98 ml de DMEM, 1 ml de suplemento de N2 100x e 1 ml de solução de estoque de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4° C por não mais que 10 dias. </li><li> Preparar meio de diferenciação B27, combinando o seguinte: 480 ml de meio neurobasal, 10 ml de 50x suplemento B27, 5 ml de solução de estoque de GlutaMax 100x, 100x e 5 ml de solução de reserva de penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias. </li></ol> 2 Cultura de hESCs e hiPSCs em células alimentadoras MEF Os hESCs H9 foram obtidos a partir de Instituto de Pesquisa WiCell e hiPSCs foram estabelecidas em laboratório Reijo Pera através de transdução mediada por retrovírus de Yamanaka fatores OCT3 / 4, SOX2, KLF4 e C-MYC 18. <ol><li> Pelo menos um dia antes da passagem de células, preparar algumas placas de gelatina adicionando 1 ml de 0,1% de gelatina a uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante pelo menos 30 min. </li><li> Após a incubação, a partir de placas de gelatina aspirado, e semente de irradiação inactivado células MEF nas placas a uma densidade de 1,6 x 10 5 células/ Poço em meio de MEF utilizando um hemocitómetro para contar as células. NOTA: Se necessário, preparar alimentadores MEF logo aos três dias antes da passagem da célula. </li><li> Células de passagem um dia após o plaqueamento alimentadores MEF: médias aspirado de hPSCs, adicionar 1 mg / ml de colagenase IV em células em 1 ml / poço, e incuba-se as células a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Durante esta incubação, lavam alimentadores MEF uma vez com PBS e, em seguida adicionar água morna (37 ° C) HPSC meio de cultura contendo soro a 1,5 mL / poço. </li><li> Depois de 1 hora, toque na placa de cultura de um par de vezes para que a maioria das colônias indiferenciadas vai separar as placas, enquanto as colônias diferenciadas permanecem ligados. Cuidadosamente recolher as colônias flutuantes, e transferi-los para tubo de 15 ml. </li><li> Lavar suavemente a placa uma vez com água morna (37 ° C) de DMEM / F12 e transferir DMEM / F12 no mesmo tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar os tubos a 179 xg por 3 min. </li><li> Aspirar médio dos tubos, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Adicionar guerram HPSC meio de cultura, Pipeta as células para cima e para baixo várias vezes para quebrá-las em pequenos aglomerados e misture bem. </li><li> Transferência das células para novos alimentadores MEF em 1: 3-1: 6 ratio. </li><li> Troca da mídia todos os dias e passagem das células a cada 5-6 dias. </li></ol> 3 Preparação de Células para Diferenciação <ol><li> Pelo menos um dia antes da preparação de células, preparar algumas placas de Matrigel (tipicamente três poços de uma placa de 6 poços). Dilui-se com o Matrigel frio (4 ° C) de DMEM / F12 a 1:40 e adicionar 1 mL de Matrigel por poço de placas de 6 poços. Incubar as placas de Matrigel a 4 ° C durante a noite. NOTA: É possível selar as placas de Matrigel com Parafilm e armazená-las a 4 ° C durante o tempo que uma semana. </li><li> Use células (ver Passo 2) 4 dias após a passagem. Remova todas as colônias diferenciadas das placas. Aspirar o meio da placa de cultura, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubar as células a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Durante a incubação, preparar alguns gelatin placas por adição de 1 ml de gelatina a um poço de placas de 6 poços. Colocar estas placas e as placas de Matrigel preparadas um dia antes na incubadora. </li><li> Após a 5 min de incubação ou quando as células tornaram-se semi-flutuante, as células de pipeta para cima e para baixo várias vezes para fazê-los em células individuais. </li><li> Recolha de células individuais em tubos de 15 ml e centrifugar a 258 xg durante 3 min. </li><li> Suspenda as células com uma quantidade apropriada de soro contendo meio de cultura, HPSC e adicionar Thiazovivin para a concentração final de 2 fiM. </li><li> Transferência de células em placas revestidas com gelatina na proporção 1: 1, e incubar as células a 37 ° C durante 30 minutos para remover os alimentadores de MEF. </li><li> Transferência das células para um tubo cónico de 15 ml, adicionar soro contendo meio apropriado HPSC e contagem das células com um hemocitómetro. </li><li> Centrifuga-se as células a 258 xg durante 3 min. </li><li> Durante centrífuga, adicionar Thiazovivin se apropriar mTeSR1 meio para fazer uma concentração de 2 uM. </li><li> Depois de centrifugação, umaspirate o meio e adicionar meio mTeSR1 apropriado com Thiazovivin de modo que não são de 1,8 x 10 5 células / ml de meio. </li><li> Retire das placas de Matrigel da incubadora, aspirar o Matrigel e juntar 2 ml de células mistas para um poço das placas de 6 poços. NOTA: A densidade celular deve ser 3,6 x 10 4 células / cm2 de área de superfície. </li><li> Retorne as placas de volta para a incubadora, e deixar que as células anexar, durante 24 horas. </li><li> 24 h após o plaqueamento das células, aspirar meio antigo e adicionar 2 ml de meio novo mTeSR1 por poço e deixar crescer as células durante mais 24 horas antes de iniciar a diferenciação. </li></ol> Diferenciação Celular <ol><li> Iniciar a diferenciação de 48 horas após replating as células em placas de Matrigel. </li><li> Aspirar o meio de cultura da placa, lave as células uma vez com PBS, e adicionar 2 ml do seguinte meio de diferenciação por poço: meio de diferenciação KSR suplementado com 10 pM e 100 nM SB431542 LDN-193189 Marque este dia como D0 de diferenciação. </li><li> Mude meio todos os dias das D0 a D20. NOTA: Pode-se preparar o meio para o uso não mais do que dois dias de cada vez. </li><li> Utilizar o meio seguinte para o D1 e D2: meio de diferenciação KSR suplementado com SB431542 10 mM, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, e 50 ng / ml FGF8b. </li><li> Usar o seguinte meio para a D3 e D4: meio de diferenciação KSR suplementado com SB431542 10 mM, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 uM CHIR99021. </li><li> Utilizar o meio seguinte para D5 e D6: 75% KSR meio de diferenciação, mais 25% de meio de diferenciação de N2 suplementado com 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 uM CHIR99021. </li><li> Use o seguinte meio para D7 e D8: 50% KSR meio de diferenciação mais 50% meio de diferenciação N2 suplementado com 100 nM LDN-193189 e 3 mM CHIR99021.</li><li> Use o seguinte meio para D9 e D10: 25% KSR meio de diferenciação mais 75% meio de diferenciação N2 suplementado com 100 nM LDN-193189 e 3 mM CHIR99021. </li><li> Utilizar o meio seguinte para D11 e D12: diferenciação de meio B27 suplementado com 3 uM CHIR99021, 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF, a 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM e 0,1 mM de cAMP. </li><li> Utilizar o meio seguinte para o resto de diferenciação: meio de diferenciação B27 suplementado com 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF, a 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM e 0,1 mM de cAMP. </li><li> A cerca de D16 de diferenciação, preparar algumas placas / laminina / Fibronectina poli-L-ornitina. Dilui-se poli-L-ornitina solução estoque com frio (4 ° C) de PBS a 15 ug / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite. </li><li> Aspirar a solução de poli-L-ornitina, lavar as placas 3 vezes com água estéril e depois secar as placas. </li><li> Diluir laminina estoque solbuição com frio (4 ° C) de PBS a 1 mg / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite. </li><li> Aspirar a solução de laminina, lavar as placas 3 vezes com água estéril e depois secar as placas. </li><li> Diluir solução-mãe de fibronectina com frio (4 ° C) de PBS a 2 ug / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite. </li><li> Placas de vedação com Parafilm e colocá-los a 4 ° C por até duas semanas. </li><li> Após 20 dias de diferenciação, replate células para os / as placas Laminin / fibronectina poli-L-ornitina. Aspirar o meio de diferenciação, adicionar 1 ml de água morna (37 ° C) a Accutase um poço de placas de 6 poços, e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Durante a incubação, colocar as placas / poli-L-ornitina Laminina / fibronectina na incubadora. </li><li> Após a incubação de 5 min ou quando as células tornaram-se semi-flutuante, suavemente as células para cima e para baixo da pipeta várias vezes paratorná-los em células individuais. </li><li> Recolher as células individuais em tubos de 15 mL cónico, e adicionar a quantidade apropriada de meio neurobasal para contagem de células, que irá variar dependendo de expansão (após 11 dias de diferenciação, as células podem expandir de 15-20 vezes). Contar as células usando um hemocitômetro. </li><li> Centrifuga-se as células a 258 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com meio de diferenciação B27 de modo a que a concentração de células é de 1 x 10 6 células / ml de meio. </li><li> Aspirar fibronectina a partir das placas, lava-se duas vezes com PBS, e adicionar 2 ml de células para um poço de placas de 6 poços. NOTA: A densidade celular para replating deve ser de 2 x 10 5 células / cm2 de área de superfície. </li><li> Mude médio de 24 horas mais tarde para remover as células mortas não acopladas. </li><li> Mudar meio todos os outros dias até que os pontos de tempo desejado para uma dada experiência. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As células estaminais pluripotentes humanas (incluindo ambos os hESCs e hiPSCs) podem ser diferenciadas in vitro para gerar a maioria, se não todos, os tipos de células do nosso corpo, incluindo neurónios DA, o que foi demonstrado em estudos anteriores 19. Aqui, com base no conhecimento do desenvolvimento embrionário neurônio dopaminérgico 20 e protocolos publicados a partir de outros laboratórios 14,15, otimizamos as condições de cultura para a geração de neurônios DA de hESCs ...

Dopaminérgico (DA) neurônios pode ser encontrada em várias regiões do cérebro, incluindo o mesencéfalo, hipotálamo, retina, e bulbos olfatórios. Os neurônios A9 DA na substância negra pars compacta (SNPC) comportamento de controle e movimento, projetando para o estriado na parte frontal do cérebro e formando o sistema motor extrapiramidal. A degeneração de neurónios DA A9 leva à doença de Parkinson (PD), que é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e humano actualmente incurável. A terapia de substituição de células é uma das mais promissoras para o tratamento da DP 1, por conseguinte, tem havido um grande interesse na determinação neurónios A9 DA a partir de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo ambas as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e o células humanas recentes tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs). Muitas pesquisas têm tentado obter neurônios A9 DA de hPSCs usando vários métodos. Os primeiros relatórios de todos os neurônios DA gerados através de uma neuralroseta estágio progenitor. Por co-cultura com MS5 2 ou PA6 3-5 células estromais com ou sem fatores de crescimento externo para 2-4 semanas, L. Studer e colegas e três outros grupos induzidos com sucesso hESCs para produzir rosetas neurais. Eles, então, enriquecido essas rosetas por dissecção mecânica ou digestão enzimática para uma maior diferenciação. Em outros relatos, os pesquisadores geraram rosetas neurais através do corpo embrióide (EB) flutuantes cultura diferenciação 6-9. Mais tarde, os investigadores estabeleceram um método de diferenciação de monocamada com base 10,11, onde banhado hESCs e hiPSCs na matriz extra-celular, adicionou diferentes factores de crescimento em cultura para induzir a diferenciação de hPSCs de neurónios DA, que imita o in vivo DA desenvolvimento embrionário neurónio . Apesar de todos estes estudos obtidos tirosina hidroxilase (TH) células -expressing com algumas características de neurônios DA, todo o processo de diferenciação é o tempo e trabalho consumindo,geralmente ineficiente, e mais importante ainda, a identidade A9 destes neurónios não foram demonstradas na maioria dos estudos, com excepção de um com Lmx1a expressão ectópica 12. Recentemente, uma placa de novo piso (FP) protocolo baseada foi desenvolvido 13-16, em que os precursores PF com DA potencial neurônio foram gerados primeiro pela ativação do sonic hedgehog e canônicas vias de sinalização Wnt durante a fase inicial de diferenciação, e, em seguida, essas células FP foram melhor especificados para os neurônios de DA. Apesar de este protocolo é mais eficiente, ainda existem alguns problemas; por exemplo, todo o processo de diferenciação leva muito tempo (pelo menos 35 dias) e é dependente de células alimentador 15, ou seja 16 ou EB dependente da identidade A9 não foi demonstrada 14. Aqui, a partir do conhecimento do desenvolvimento in vivo DA neurônio embrionário e os resultados publicados por outros pesquisadores, nós otimizamos as condições de cultivo para o FEPgeração icient de neurônios DA de ambos os hESCs e hiPSCs. Nós primeiro gerado células precursoras FP pela ativação da via de sinalização Wnt canônica com pequena molécula CHIR99021 e sonic hedgehog sinalização com pequenas moléculas SAG e purmorphamine. Estas células FP expressar Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestin. Em seguida, essas células especificado PF para neurônios DA com fatores de crescimento, incluindo BDNF, GDNF, etc. Os neurônios DA gerados são do tipo de célula A9 como eles são positivos para GIRK2 enquanto negativo para calbindina 17. Este protocolo é de células de alimentação ou EB independente, altamente eficiente e reprodutível. Usando este protocolo, pode-se derivar neurônios DA em menos de 4 semanas a partir de hESCs ou hiPSCs de pessoas normais para estudo transplante de células, ou de hiPSCs de pacientes com DP para in vitro modelagem de PD ou testar agentes terapêuticos potenciais para a DP.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/ampicilina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido não essencial</td><td>Life Tecnologias</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento reduzido matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R & D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R& D Systems</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>R& D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anticorpo NESTIN humano</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td> 1<td>/1.000 diluição</td></tr><tr><td>Coelho anti humano OTX2 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2.000 diluição</td></tr><tr><td>Cabra anti humano FOXA2 anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 diluição</td></tr><tr><td>coelho anti humano LMX1a anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>1/1.000 diluição</td></tr><tr><td>Coelho anti humano TH anticorpo</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td> 1<td>/500 diluição</td></tr><tr><td>Frango anti humano TH anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 diluição</td></tr><tr><td>Camundongo anti humano TUJ1 anticorpo</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1 /, 2000 diluição</td></tr><tr>Anticorpo humano <td>Abcam</td><td>abcam ab30738</td> do <td>coelho anti GIRK2</td> humano do coelho diluição 1<td>/300</td></tr><tr><td>Anticorpo</td> humano <td>Abcam</td><td>abcam ab25085</td><td>1/400 da diluição</td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dirigido neurônios dopaminérgicos diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Os neurônios dopaminérgicos (DA) na substância negra pars compacta (também conhecidos como neurônios A9 DA) são o tipo específico de célula que é perdido na doença de Parkinson (DP). Há um grande interesse em derivar neurônios A9 DA de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para terapia de reposição celular regenerativa para DP. Durante o desenvolvimento neural, os neurônios A9 DA se originam dos precursores da placa de assoalho (FP) localizados na linha média ventral do sistema nervoso central. Aqui, otimizamos as condições de cultura para a diferenciação gradual de hPSCs em neurônios A9 DA, que imita o desenvolvimento embrionário do neurônio DA. Em nosso protocolo, primeiro descrevemos a geração eficiente de células precursoras de FP a partir de hPSCs usando um método de molécula pequena e, em seguida, convertemos as células FP em neurônios A9 DA, que podem ser mantidos in vitro por vários meses. Este protocolo eficiente, repetível e controlável funciona bem em células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) de pessoas normais e pacientes com DP, nas quais se pode derivar neurônios A9 DA para realizar modelagem de doenças in vitro e triagem de drogas e terapia de transplante de células in vivo para DP.

Uma visão geral do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1. A eficiência da diferenciação protocolo aqui apresentada baseia-se no estado das células iniciadoras. Portanto, é essencial ter a certeza de que, em primeiro lugar um remove todas as colónias diferenciadas antes dissociando hPSCs em células individuais de diferenciação, e, segundo, uma esgota a maioria, se não todas, as células alimentadoras MEF por incubação das células em placas revestidas com gelatina durante 30 min, e em terceiro ...

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir uma diferenciação altamente eficiente de neurônios dopaminérgicos in vitro. Isso é realizado primeiramente preparando um cultivo de adesão de célula única de células-tronco pluripotentes humanas P.No segundo passo, o meio de cultura celular é substituído por meio de indução neuronal para induzir progenitores de placa do assoalho. Em seguida, os neurônios dopaminérgicos são cultivados em meio de maturação. E, finalmente, os progenitores de neurônios dopaminérgicos individuais são cultivados em placas de laminina de fibronectina com poli-L-ornitina em meio de maturação por 30 dias.Por fim, a microscopia de imunofluorescência pode ser usada para avaliar a expressão de marcadores importantes de neurônios dopaminérgicos. Esta técnica apresenta uma vantagem maior em comparação com o protocolo de ácido neuroesférico existente. Ela pode gerar uma população neural dupla mais homogênea com maior eficiência.Quatro dias após a passagem, aspire o meio das culturas celulares. Desprenda as células com um mililitro de Accutase por poço e incube-as a 37 graus Celsius por cinco minutos. Durante a incubação, adicione um mililitro de gelatina a cada poço de uma placa de seis poços e, em seguida, coloque a placa juntamente com as placas recém-preparadas revestidas com Matrigel dentro do incubador.Quando as células estiverem parcialmente em suspensão, pipete-as para cima e para baixo várias vezes para obter uma suspensão de células simples. Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrifugue-as por três minutos a 258 ×g e temperatura ambiente. Re-suspenda o pellet na quantidade apropriada de meio de cultura de células-tronco pluripotentes humanas suplementado com soro e adicione thi vivin até uma concentração final de 2 mmolares.Em seguida, incubar as células em placas revestidas com gelatina na proporção de um para um a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para remover os alimentadores de metionina, transferir então as células para um novo tubo de 15 mililitros. Diluir em meio de células-tronco pluripotentes humanas, suplementado com soro, e contá-las após centrifugar as células novamente; ressuspender as células no meio MT.SR um com tias Iva até uma concentração de 180.000 células por mililitro.Em seguida, aspire o Matrigel dos poços revestidos e distribua dois mililitros de células por poço. 48 horas. Após o replante das células nos poços com Matrigel.Aspire o meio de cada poço e lave as células uma vez com PBS. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de diferenciação KSR, suplementado com SB 4 31, 50 42 e L DN 1 9 3 1 8 9 às células, trocando o meio diariamente do D0 até o D20, conforme descrito no gráfico. No dia 20, aspire o meio de diferenciação e desprenda as células com um mililitro de acutase a 37 graus Celsius por poço, a 37 graus Celsius por cinco minutos. Durante a incubação, aqueça as placas de poli-L-ornitina, laminina e fibronectina no incubador.Em seguida, após a ressuspensão, suspenda as células destacadas em uma suspensão de células simples e dilua as células em meio neurobasal. Após a contagem, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em meio de diferenciação B 27 na concentração de 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, aspire a fibronectina das placas de poliornina, laminina e fibronectina.Lave-os duas vezes com PBS e transfira 400 microlitros de células para cada poço. Finalmente, troque o meio após as primeiras 24 horas e, em seguida, a cada dois dias até o ponto final do experimento, para remover quaisquer células mortas não aderidas. Conforme ilustrado nessas imagens, culturas de células-tronco pluripotentes humanas monoclonais replatadas expandir-se-ão em aglomerados durante as primeiras 48 horas de diferenciação, atingindo cerca de 70% de confluência.Após a diferenciação, as células atingem confluência total em apenas três a quatro dias. No dia 20, as células diferenciadas aderem e crescem como pequenos aglomerados. Durante os próximos cinco dias, axônios e neuritos muito mais intensos e morfologicamente intactos aparecem dentro dos aglomerados, formando algumas conexões entre eles.Após 11 dias de diferenciação, as células-tronco pluripotentes humanas podem ser eficientemente convertidas em precursores da placa do assoalho. Conforme demonstrado nestas imagens, quase todas as células expressam os marcadores celulares precursores da placa do assoalho, como NESTIN e FOXA2, e mais de 90% das células expressam CORIN, OTX2 e LMX1A. Após diferenciação adicional, as células precursoras da placa do assoalho se especializam em neurônios dopaminérgicos que expressam TUJ1 e TH. Esses neurônios dopaminérgicos apresentam identidade do tipo encefálico médio, pois expressam EN2 e são negativos para calbindina. Experimentos de imunomarcação também demonstram que não há astrócitos GFAP positivos e que existem pouquíssimos neurônios GABAérgicos, indicando que a diferenciação é exclusivamente específica para a linhagem de neurônios dopaminérgicos.Ao testar este procedimento, é importante manter a consistência no cultivo celular diário e garantir que o meio seja preparado recentemente com os ingredientes corretos.

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Este vídeo demonstra a geração de células progenitoras neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas não transgênicas e transgênicas (hPSCs). As hPSCs são diferenciadas em células progenitoras neurais usando um meio de diferenciação neuronal. Enquanto a diferenciação é induzida em células não transgênicas usando pequenas moléculas, as hPSCs transgênicas são diferenciadas pela adição de um antibiótico que induz o promotor de um fator de transcrição específico de diferenciação neuronal.

Diferenciando Células-Tronco Pluripotentes Humanas Não Transgênicas e Transgênicas em Células Progenitoras Neurais

Este vídeo demonstra o processo de indução de células-tronco pluripotentes humanas a se diferenciarem em neurônios, transfectando-as com lentivírus modificados carregando um gene do fator de transcrição neurogênico sob o controle do elemento responsivo à tetraciclina, seguido de tratamento com um derivado de tetraciclina e meio de maturação.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando lentivírus projetados

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em neurônios dopaminérgicos, para fornecer um modelo para estudar a doença de Parkinson. As hESCs são cultivadas em um meio de indução neural em uma placa de micropoços para formar neuroesferas 3D. Estes são então cultivados em um meio de indução neural para promover a diferenciação em neurônios progenitores dopaminérgicos. A maturação final dos neurônios ocorre em uma inserção de cultura sob condições de...

Geração de Organoides Neuronais Dopaminérgicos a partir de Células-Tronco Embrionárias Humanas

Este procedimento gera os neurónios telencefálicos atravessando checkpoints que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. As células são deixadas a diferenciar-se espontaneamente, são expostas a factores que os empurram no sentido da linhagem neural, são isolados, e são plaqueadas em lamelas de cobertura para permitir a diferenciação terminal e maturação.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Aprenda a diferenciar neurônios dopaminérgicos A9 de células-tronco pluripotentes humanas com alta eficiência. Este protocolo otimizado é essencial para modelar a doença de Parkinson e desenvolver terapias de reposição celular.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

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