Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

O objetivo geral deste procedimento é induzir a diferenciação de neurônios dopaminérgicos altamente eficiente. In vitro. Isso é feito preparando primeiro uma cultura de adesão de célula única de células-tronco pluripotentes P humanas.

Na segunda etapa, o meio de cultura celular é trocado por meio de indução de neurônios para induzir os progenitores da placa de piso. Em seguida, os neurônios dopaminérgicos são cultivados em meios de maturação. E, finalmente, os progenitores de neurônios dopaminérgicos de célula única são cultivados em placas de fibronectina laminadas de poli L ornitina e meios de maturação por 30 dias.

Em última análise, a microscopia de imunofluorescência pode ser usada para avaliar a expressão de importantes marcadores de neurônios dopaminérgicos. Esta técnica tem uma vantagem maior sobre a neuroesfera existente no protocolo de neuroácidos. Pode gerar uma população neural dupla mais homogênea com maior eficiência.

Quatro dias após a passagem, aspirar o meio das culturas celulares. Separe as células com um mililitro de Accutane por poço e incube-as a 37 graus Celsius por cinco minutos. Durante a incubação, adicione um mililitro de gelatina a cada poço de uma placa de seis poços e, em seguida, coloque a placa junto com as placas revestidas com gel matri recém-preparadas na incubadora.

Quando as células se tornarem semiflutuantes, pipete-as para cima e para baixo várias vezes para fazer uma única suspensão celular. Em seguida, puxe as células para um tubo de 15 mililitros e centrifugue-as por três minutos. A 258 Gs e à temperatura ambiente, suspender novamente o sedimento na quantidade adequada de meio de cultura de células estaminais pluripotentes humanas suplementado com soro e adicionar thi vivin a uma concentração final de dois milimolares.

Em seguida, incube as células nas placas revestidas de gelatina na proporção de um para um a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para remover os alimentadores de metanfetamina, transfira as células para um novo tubo de 15 mililitros. Dilua-os em meio de células-tronco pluripotentes humanas, suplementado com soro, e conte-os depois de girar as células novamente, suspenda novamente as células em MT.SR meio com thias Ivan a uma concentração de 180.000 células por mililitro.

Em seguida, aspire o matrigel das placas revestidas e dispense dois mililitros de células por poço. 48 horas. Depois de recolocar as células nas placas de matrigel.

Aspire o meio de cada poço e lave as células uma vez com PBS. Em seguida, adicione dois mililitros de diferenciação KSR, meio suplementado com SB 4 31, 50 42 e L DN 1 9 3 1 8 9 às células que mudam o meio todos os dias de D zero para D 20 conforme descrito no gráfico no dia 20, aspire o meio de diferenciação e separe as células com um mililitro de 37 graus Celsius acutus por poço a 37 graus Celsius por cinco minutos. Durante a incubação, aqueça as placas de fibronectina de laminação poli L orina na incubadora.

Então, após Resus, suspendendo as células destacadas em uma única suspensão celular, dilua as células em meios neurobasais. Após a contagem, girar as células e ressuspender o pellet em B 27, meio de diferenciação a uma concentração de 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, aspire a fibronectina das placas de fibronectina de poliol ou laminina

Lave-os duas vezes com PBS e transfira 400 microlitros de células para cada um. Bem, finalmente, mude o meio após as primeiras 24 horas e, em seguida, a cada dois dias até o ponto final experimental para remover quaisquer células mortas soltas. Conforme ilustrado nessas imagens, as culturas de células-tronco pluripotentes humanas de célula única replaqueadas se expandirão como clusters durante as primeiras 48 horas de diferenciação, atingindo cerca de 70% de confluência.

Após a diferenciação, as células atingem a confluência total em apenas três a quatro dias. No dia 20, as células diferenciadas se ligam e crescem como pequenos aglomerados. Durante os próximos cinco dias, axônios e neuritos muito mais intensos e morfologicamente intactos aparecem dentro dos aglomerados, formando algumas conexões entre os aglomerados.

Após 11 dias de diferenciação, as células-tronco pluripotentes humanas podem ser convertidas com eficiência em precursores da placa de piso. Conforme demonstrado nessas imagens, quase todas as células expressam o precursor da placa de piso, os marcadores celulares se aninham e a raposa A dois ou mais. 90% das células expressam Corin O OTX dois e LM X um A. Após uma maior diferenciação, as células precursoras da placa de assoalho se especializam em neurônios dopaminérgicos que expressam TUJ um e TH. Esses neurônios dopaminérgicos são de uma identidade nove, pois expressam GK dois e são negativos para calvinina. Experimentos de coloração imunológica também demonstram que não há astrócitos GFAP e muito poucos neurônios GABAérgicos, indicando que a diferenciação é exclusivamente específica para a linhagem de neurônios dopaminérgicos.

Ao testar este procedimento, é importante manter a consistência na cultura de células do dia a dia e garantir que o meio seja preparado na hora com os ingredientes corretos.