O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a estrutura celular e a localização de proteínas em células BE. Isso é conseguido incubando as células BE cultivadas nas lamínulas de vidro com um medicamento escolhido em condições padrão de cultura de células. Como segundo passo, incube as células tratadas com um fixador, que preserva a estrutura e a localização da proteína.

Em seguida, as células be fixas são incubadas sequencialmente com anticorpos primários e secundários marcados com fluorescência, a fim de visualizar as alterações na proteína-alvo selecionada por meio de resultados de microscopia de fluorescência que mostram como o tratamento medicamentoso das células be altera a localização da proteína e a estrutura celular com base na visualização da coloração imunofluorescente. Embora esse método possa fornecer informações sobre o esôfago de Barrett, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, incluindo câncer e células normais. Comece este procedimento colocando as lamínulas de 18 milímetros em uma placa de Petri de vidro e autoclave-as.

Em seguida, transfira as lamínulas da autoclave para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços usando uma pipeta de vidro estéril conectada a um tubo de vácuo. Após essa lavagem, a tampa desliza com PBS e mídia estéreis. Em seguida, tripsina.

As células imortalizadas contam as células usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro subsequentemente diluem as células em meios de cultura a uma concentração de 20.000 a 40.000 células por mililitro. Em seguida, coloque um mililitro de células em cada poço contendo uma lamínula. Para uma contagem total de células de 20.000 a 40.000 células por poço, use uma ponta de pipeta estéril para empurrar suavemente a lamínula para o fundo do poço para garantir que as células se prendam à lamínula.

Para tratar as células BE, dilua o medicamento selecionado em 37 graus Celsius Média até a concentração desejada misture bem invertendo o tubo repetidamente ou usando um misturador de vórtice. Comece o tratamento 24 horas após a colocação inicial das células BE para permitir a fixação das células na lamínula de cobertura Agora pré-rotuladas com placas de amostra tratadas com medicamentos e veículos com uma caneta de laboratório para distinguir entre comparação e controle. Trate uma lamínula adicional de células be com 0,1% de veículo diluído no meio de cultura.

Depois, coloque as células em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 98% de umidade. Agora, após o tempo de incubação desejado do tratamento medicamentoso, aspire o meio e lave as lamínulas rapidamente com um XPBS à temperatura ambiente. Em seguida, aspire o PBS e adicione um mililitro de PBS contendo 4% de PFA a cada poço e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, aspire o 4%P-F-A-P-B-S Lave as lamínulas três vezes cinco minutos de cada vez com PBS em temperatura ambiente. Armazene as lamínulas por uma semana em PBS e 0,1% PFA a quatro graus Celsius, se desejar. Para olhos permeáveis as células PFA fixas, a fim de permitir que o anticorpo acesse os alvos intracelulares, incube as células com cloreto de amônio 50 milimolares diluído em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, lave-os com PBS em temperatura ambiente uma vez por cinco minutos. Isso reduzirá o fundo para evitar a ligação não específica de anticorpos às proteínas celulares. Incube as células BE por 30 minutos em 100 a 300 microlitros de PBS contendo 0,1% de troponina e 0,5% de BSA.

Em seguida, prepare um prato quadrado de bioensaio colocando camadas no fundo da câmara com toalhas de papel molhadas e colocando uma camada de parfum por cima. Marque o Parfum com uma caneta de laboratório para identificar as lamínulas. Transfira suavemente as células das lamínulas voltadas para cima para o parâmetro usando uma pinça e uma agulha de seringa.

Agora dilua o anticorpo primário em PBS contendo 0,5% BSA e 0,1% de saponina, limpe suavemente a solução de bloqueio. Usando um tecido de laboratório, adicione 100 microlitros da solução de anticorpo primário e incube as células be durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte.

Lave as lâminas três vezes com PBS contendo 0,5% BSA e 0,1% de troponina por cinco minutos de cada vez em temperatura ambiente. Em seguida, dilua o anticorpo secundário conjugado com uma marca fluorescente em PBS contendo 0,5% BSA e 0,1% de ponente. Adicione 100 microlitros de anticorpo diluído a cada lamínula e incube as células por duas horas em temperatura ambiente Após duas horas.

Lave as lamínulas três vezes cinco minutos de cada vez em PBS contendo 0,5% BSA e 0,1% troponina. Remova o tampão de lavagem e adicione 100 a 300 microlitros de PBS às lamínulas. Levante suavemente a lamínula com uma pinça e seque o PBS usando um lenço de papel ou toalha de papel.

Em seguida, adicione 15 microlitros de uma mídia de montagem Antifa adequada contendo DPI à lamínula. Coloque a lamínula invertida em uma lâmina de microscópio de vidro com as células voltadas para baixo. Em seguida, coloque as lâminas em uma pasta de lâminas e mantenha-as longe da luz direta durante a noite em temperatura ambiente para permitir que o meio Antifa cure.

Uma vez que o meio Antifa tenha endurecido, as lâminas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius ou 20 graus Celsius negativos até a visualização microscópica. Nesta etapa, remova as lâminas de armazenamento de 20 graus Celsius negativos ou quatro graus Celsius e deixe-as aquecer até a temperatura ambiente. Ligue o microscópio e a lâmpada de arco de mercúrio.

Coloque uma lâmina de microscópio com a lamínula voltada para a objetiva na platina do microscópio. Em seguida, selecione o filtro DAPI e abra o obturador. Foque o objetivo enquanto olha através das oculares até que a imagem apareça.

Como todas as células foram coradas com dpi, os núcleos devem ser facilmente observados. Colete imagens usando software de processamento de imagem apropriado nesta figura as lamínulas com CPC e CPD foram tratadas com veículo ou um micromolar do inibidor de SRC. SKI 6 0 6 por 24 horas as células foram então fixadas e coradas.

De acordo com o protocolo descrito, a betacatenina indicada em verde foi visualizada usando um anticorpo específico e um anticorpo secundário acoplado a LOR 4 88, enquanto o núcleo foi corado com DPI indicado em azul. Observe a mudança na localização da beta-catenina do núcleo para a membrana celular. Após o tratamento com SKI 6 0 6.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como corar o esôfago de Barrett com imunofluorescência para investigar a localização da proteína ou a estrutura celular.