Name: Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a concentrar adenovírus de amostras de água usando filtro de celulose de vidro e técnica de concentração secundária sea light. Este método de pequeno volume permite avaliação rápida de variáveis de concentração viral.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Nicholas J. Ashbolt e ao Dr. G. Shay Fout pela revisão do manuscrito.

1. Preparação de material de vidro e Carcaças de filtro <ol style="margin-left: 40px;"><li> Salvo disposição em contrário, esterilizar todos os copos, caixas de filtro e soluções a 121 ° C por 15 min. Para garantir a esterilidade, cobrir todas as aberturas ou as superfícies expostas, quer com a folha de alumínio ou papel fixada com fita antes da esterilização. </li><li> Montar aparelho de filtração, anexando carcaça do filtro (47 mm de diâmetro) para 1 L Erlenmeyer braço lateral. Recolha filtros necessários: 47 milímetros de diâmetro electropositivos / electronegative filtros de disco. </li><li> Prepare 1 L de 1,5% de extracto de carne de bovino (floculação; produz partículas de flocos quando o pH da solução é reduzido para 3,5, ou não-floculação, o que não agregar a pH 3,5), com 0,05 M de glicina, por dissolução de 15 g de extracto de carne em 1 L de água desionizada e adição de 3,75 g de glicina. NOTA: extractos de carne não-floculantes irá requerer a adição de celite antes da concentração terciária. </li><li> Adicionar eluição polyph aditivo de sódioosphate de extracto de carne a uma concentração de 0,1%. </li><li> Adicionar uma solução de ácido clorídrico M, gota a gota, a mistura de extrato de carne, o pH da solução de pH desejado. Extracto de carne autoclave durante 15-30 min a 121 ° C. </li><li> Meça 0,1 g de pó fino, médio ou grande celite de partículas (para uso com o não-floculação apenas extrato de carne). </li><li> Prepare vácuo / aspiração, anexando tubo compatível para Erlenmeyer de braço lateral e para a saída de vácuo. </li></ol> 2. Preparação de Soluções e vírus Stock <ol style="margin-left: 40px;"><li> Prepare 1 litro de 1 M de HCl. </li><li> Prepare 1 L de NaOH 1M. </li><li> Preparar a solução de PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 1,47 mM de K 2 PO 4, e 4,3 mM de NaH 2 PO 4). <ol><li> Ajustar o pH de 1x PBS a 9,0 usando NaOH 1 M. </li></ol></li><li> Prepare e diluir vírus estoque para 10 4 -10 5 número mais provável (NMP) ml -1 misturando 1 ml de vírus estoque com 9 ml de PBS (pH7), como anteriormente descrito 8,13. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 1 ml. <ol><li> Esterilizar estoque de vírus por meio de filtragem seringa (0,22 tamanho dos poros) para remover contaminantes potenciais. </li></ol></li><li> Água da torneira sem cloro <ol><li> Medida 1 L de água da torneira esterilizada utilizando um cilindro graduado estéril e despeje em um copo de 2 L contendo uma barra magnética. </li><li> Adicionar 0,7 g de tiossulfato de sódio e misturar até dissolver grânulos. Ajustar o pH da água da torneira para 7-7,5, se necessário usando 1 M HCl ou solução de NaOH 1 M. </li><li> Spike vírus Thaw (1 ml) e adicionar volume inteiro de pico para 1 L de água sem cloro torneira esterilizada. Mistura-se durante 10 min. </li><li> Preparar um método em branco (sem água declorada adenovírus) com cada experimento e processo da mesma maneira como a amostra enriquecida. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de filtro Millipore Aparelho <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retirar cobertura estéril sobre caixa do filtro. Garantirbom ajuste entre a caixa do filtro bacia superior e inferior da tela do filtro para evitar a fuga de amostra durante a filtração. </li><li> Retirar cobertura estéril a partir de 1 frasco L Erlenmeyer. Assegure-se que a cortiça da unidade de filtro se encaixa perfeitamente na abertura superior do balão de Erlenmeyer, criar uma boa vedação. </li><li> Remover bacia superior do filtro do filtro de tela menor e coloque 47 milímetros disco filtro electropositive diretamente sobre a tela com uma pinça estéril. Anexar caixa do filtro tigela para a tela de fundo e bloquear no lugar por torção anti-horário. </li></ol> 4. Toque em Filtragem de água (Concentração Primário) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Medir 100 ml de vírus cravado água da torneira usando estéril proveta graduada. </li><li> Despeje 100 ml de vírus cravado a água da torneira em carcaça de filtro contendo um filtro de 47 milímetros de vidro plissado / celulose ou de um filtro de disco de fibra nano-alumina / vidro. </li><li> Deixe a água passar lentamente pelo filtro. Aplicar vácuo suave para remover os resíduos restantes oágua da torneira f da superfície do filtro. </li><li> Se utilizando tratamento com tripsina, adicionar 5 ml de tripsina a 0,25% para filtrar superfície e incubar durante 5 min. </li><li> Lavar tripsina da superfície do filtro com 50 ml de água desionizada estéril. </li></ol> 5. Vírus de eluição Filtrar <ol style="margin-left: 40px;"><li> Remover caixa do filtro de 2 balão L Erlenmeyer, e coloque-frasco de 250 ml de braço lateral. </li><li> Medir 100 ml de extrato de carne usando proveta graduada. Juntar cuidadosamente 100 ml de extrato de carne em carcaça de filtro. </li><li> Permitir extrato de carne bovina para derramar através do filtro, captando extrato de carne em um pequeno (250 ml) Erlenmeyer. Aplicar vácuo para puxar através de extrato de carne residual de filtro. </li></ol> 6. Celite Concentração Secundário <ol style="margin-left: 40px;"><li> Frascos de transferência contendo os vírus eluídas a uma placa de agitação. Adicionar estéril barra magnética e lugar na placa de agitação, mistura para criar ligeiro vórtice. </li><li> Adicionar 0,1 g de celiteem pó a 100 ml de extracto de carne e permitir celite para dispersar. Coloque sonda pH estéril em extrato de carne. </li><li> Adicionar gota a gota 1 M HCl de extrato de carne bovina para atingir pH 4.0. Permitir que a mistura lentamente, durante 10 min. </li><li> Colocar 47 milímetros pré-filtro no alojamento do filtro (como descrito anteriormente) utilizando um balão de Erlenmeyer de 2 L. </li><li> Despeje 100 ml de extrato de carne / mistura celite sobre pré-filtro. Permitir extrato de carne bovina para derramar through. Aplique uma leve vácuo para puxar através de extrato de carne residual de filtro. </li><li> Coloque clipe de tubo de metal no final do bico caixa do filtro. Anexar estéril 15 ml tubo de coleta de polipropileno para o clipe tubo de metal. Coloque caixa do filtro de volta para Erlenmeyer. </li><li> Adicionar 5 ml de tampão 1x PBS, pH 9.0 sobre celite recolhido em pré-filtro. </li><li> Permitir PBS a gotejar através de pré-filtro. Aplique uma leve vácuo para puxar através PBS residual em 15 ml tubo de coleta. </li></ol> 7. Floculação Organic Concentração Secundário <ol style="margin-left: 40px;"><li>Transfira os copos contendo o vírus eluída a uma placa de agitação. Adicionar estéril barra magnética a 100 ml de extrato de carne e misture para criar ligeiro vórtice. </li><li> Coloque sonda pH estéril em extrato de carne. </li><li> Adicione 1 HCl M gota a gota a extrato de carne e ajustar o pH para 3,5. Mistura-se durante 30 min. </li><li> Verter o eluído em 250 ml de tubos de centrífuga cónicos e centrifugar a 2500 xg durante 15 min a 4 ºC. </li><li> Deitar fora sobrenadante tomando cuidado para não para não perturbar o sedimento. Ressuspender o sedimento em 5 ml de 1x PBS, pH 9. </li><li> Centrifugar a suspensão a 4000 xg durante 10 min a 4 ºC. Retirar o sobrenadante e descartar o pellet. </li><li> Ajustar o pH a 7-7,5, filtro de esterilização através de filtro de seringa de 0,22 um e congelamento a -80 ° C. </li></ol> 8. Viral Extraction Nucleic Acid <ol style="margin-left: 40px;"><li> Extrai-se os ácidos nucleicos virais utilizando um kit comercial adequado de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 9. AdV 40/41 qPCR <ol style="margin-left: 40px;"><li> Use iniciadores e sondas, bem como mistura de reacção e perfis de ciclos térmicos como publicado 8,13. NOTA: O limite de detecção estimado para o ensaio é de cerca de 5 unidades de qPCR por reacção. </li><li> Adicionar componentes de misturas de amplificação por PCR em concentrações como se segue: Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, 4,5 mM de MgCl 2, 10 mM dNTPs, 10 uM iniciadores e sonda de 1 uM e 0,5 jil de polimerase de modo a que os volumes finais de 45 ul pode ser adicionado ao número adequado de poços no prazo de uma placa de 96 poços de reacção de PCR. </li><li> Carga 45 ul de mistura de amplificação de PCR a cada poço adequado de uma de 96 poços, de reacção rápida placa de PCR. </li><li> Adiciona-se 5 ul de amostra de ADN extraído a poços apropriados da placa de PCR. </li><li> Espelho com vedação da tampa resistente ao calor, girar a placa para mover as gotas para o fundo da PCR poços da placa. </li><li> Definir ciclos de amplificação de PCR como Follows: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. </li></ol> 10. Análise de Dados <ol style="margin-left: 40px;"><li> Analisar as medições em triplicado de diluições em série de 5 vezes das amostras distribuidas 1: 5 a 1: 625 de diluição intervalo, a fim de determinar o número mais provável (MPN) das partículas virais, como anteriormente descrito 8,13. </li><li> Analise diluições em série de 5 vezes de picos experimentais adenovirus abrangendo 1: 5 a 1: 15.625 gama de diluição, a fim de determinar o número mais provável (MPN) das partículas virais. </li><li> Usando a calculadora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), ajustar a calculadora para contabilizar tipo de diluição (1: 5 ou 1:10), o número de diluições realizadas e número de duplicados de amostras em séries de diluição. </li><li> Realizar log 10 de transformação dos dados, seguido por normalização para uma unidade de volume (por exemplo, 1 ml, 100 ml, etc. </em&gt;). Calcular as recuperações para dada experiência por divisão do número de partículas virais presentes na amostra concentra com o número de partículas virais presentes em pontos experimentais. </li><li> Avaliar o efeito das diferentes variáveis ​​experimentais (por exemplo, diferentes tipos de Celite, gamas de pH, os diferentes tipos de filtros e diferentes técnicas de concentração secundários) sobre recuperações por AdV realizar testes estatísticos paramétricos ou não-paramétricos (por exemplo, teste-t emparelhado, um ou dois -way ANOVA), dependendo da distribuição dos dados e do desenho experimental. </li></ol>

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Filtros electropositiva são úteis na concentração vírus de água; no entanto, estes filtros podem diferir na sua estrutura e composição, que por sua vez poderia alterar a sua eficácia. Para agravar este problema, as estruturas do capsídeo e encargos variam entre cepas de vírus que requerem ser adaptados técnicas de concentração para garantir a recuperação óptima 15. Através de modificações simples das técnicas de concentração existentes (por exemplo, filtros electropositivos, extracto de carne de elui...

Vírus entéricos humanos são importantes causadoras doenças transmitidas pela água 1-3, mas são geralmente presentes em números baixos nas águas ambientais contaminados, tornando difícil a sua detecção, sem concentração. Os procedimentos usados ​​para concentrar os vírus incluem, tipicamente, uma etapa de filtração, seguido por eluição do filtro, e concentração secundária do eluato filtro. Um procedimento de filtração comum se baseia em uso de membranas carregadas, tais como filtros electropositivos (recentemente revisados ​​em 4,5). Estes filtros dependem de captura de vírus em suspensão em água usando interacções electrostáticas entre a superfície de filtro (carregado positivamente) e partículas de vírus segmentados (carregada negativamente). Dois filtros electropositivos que estão disponíveis comercialmente confiam nesta tecnologia, os filtros de vidro / celulose e nano-alumina / fibra de vidro. Os custos de filtro de vidro / celulose são até 10 vezes maior do que a nano-alumina / fibra de vidro, o que limita o uso do vidro / cefiltros llulose para monitoramento de vírus de rotina. Estudos recentes concluíram que as diferenças são nominais entre estes dois filtros em recuperação de enterovírus de 6,7 água do ambiente, o que justifica o uso de um filtro alternativa mais barata. Outras opções de filtros, como filtros electronegativos e de fibra de vidro foram estudadas, no entanto, que quer impor ao pré-tratamento da água de nascente (filtros electronegativos) ou não estão disponíveis comercialmente (filtros de fibra de vidro). O desenvolvimento de processos de concentração de vírus tenha focado principalmente na optimização das técnicas de concentração primária (filtros), a fim de melhorar a recuperação de vírus a partir de água. No entanto, os procedimentos de concentração secundários, os quais reduzem o volume de eluente, tipicamente de 1 L para mililitro volumes, também pode ter um impacto significativo sobre a recuperação de vírus 8. Concentração Secundária de vírus entéricos normalmente se baseia em um agente de floculação, como alguns tipos de extrato de carne bovina (floccu orgânicamento) ou floculação leite desnatado 9-12 para remover partículas do vírus a partir de superfícies de filtro. Recentemente, um outro processo de concentração secundária utilizando extracto de carne juntamente com a adição de Celite (partícula fina) mostrou-se promissor para a recuperação de adenovírus, enterovírus, e norovírus 8,13,14. Obras de concentração de celite sob princípios semelhantes aos do método de floculação orgânico em que as partículas de vírus para anexar e são libertados de partículas (ou flocos de celite), alterando o pH da solução de suspensão. As comparações entre estas duas técnicas de concentração secundários foram avaliadas em recuperação de adenovírus cravado (Adv) tipos 40 e 41 8. Este estudo concluiu que as duas técnicas de concentração secundários foram estatisticamente semelhantes em recuperação de adenovírus. No entanto, o método de floculação biológica requer um 30 min. de incubação a pH 3,5, enquanto que a técnica de celite requer uma incubação mais curto (10 minutos) a pH 4,0. O flocculat orgânicaião também requer a utilização de equipamento de laboratório caro (centrífugas), para recolher as partículas de flocos durante a concentração terciária, a técnica de celite em contraste utiliza apenas equipamentos básicos de laboratório (filtração no vácuo) para separar as partículas de celite suspensão. Determinadas combinações de filtros e técnicas de eluição secundárias pode também afectar as recuperações de vírus. Um estudo concluiu que certas combinações de (filtros) electropositivos primárias e secundárias técnicas de concentração (Celite ou floculação orgânica) teve um impacto significativo de recuperação de adenovirus 13. Estes resultados sugerem que a optimização é necessária, a fim de recuperar o vírus alvo de forma óptima a partir de uma dada matriz de água quando se utiliza estas técnicas. Optimization é um demorado, árduo processo muitos pesquisadores evitam ativamente desde inúmeras variáveis ​​serão avaliadas (tipo de filtro / marca, solução de eluição pH, Celite / floculação orgânica). Para este study, foi desenvolvido um processo para identificar as condições óptimas para a concentração de vírus a partir da água utilizando adenovírus humano cravado estirpes 40 e 41. Presumivelmente, uma vez que cada tipo de vírus exibe uma morfologia única e capsídeo cápside carga específica, protocolos de concentração pode necessitar de ser optimizado para cada vírus alvo, a fim de alcançar a recuperação viral ideal. Este estudo fornece uma abordagem para AdV 40 e 41 concentração por: 1) avaliar as recuperações de vírus na água da torneira usando discos de filtro electropositivos seguidos de 2) avaliação de um método de floculação orgânica estabelecida versus a técnica de celite como uma concentração secundária, e 3) avaliação da tampões de eluição para a concentração terciária.

<table><tbody><tr><td>Adenovírus 40 estoque</td><td>ATCC</td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>Adenovírus 41 estoque</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>Tiossulfato de Sódio</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 mm</td><td>Argonide</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 mm</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>AP-20 Pré-filtro 47 mm</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>AP2004700</tr><tr><td>Glicina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Polifosfato de Sódio</td><td>Acros Organics</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>BBL Extrato de Carne</td><td>BD Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>Difco Extrato de Carne</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 Sistema de PCR em tempo real</td><td>ABI</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de filtro de aço inoxidável</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XX2004720 Kit de Extração de DNA de Sangue</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr>Calculadora <td></td><td></td><td>EPA MPN</td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

um procedimento volume pequeno para concentração viral da Água

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

A concentração em pequena escala de vírus (volumes de amostra de 1 a 10 L, aqui simulados com amostras de água enriquecidas de 100 ml) é uma maneira eficiente e econômica de identificar parâmetros ideais para a concentração de vírus. Os vírus podem ser concentrados a partir da água usando filtração (eletropositiva, eletronegativa, lã de vidro ou exclusão de tamanho), seguida de concentração secundária com extrato de carne bovina para liberar vírus das superfícies do filtro e, finalmente, concentração terciária resultando em um concentrado de vírus de volume de 5-30 ml. A fim de identificar os procedimentos de concentração ideal, foram avaliados dois filtros eletropositivos diferentes (um filtro de vidro/celulose [1MDS] e um filtro de nano-alumina/vidro [NanoCeram]), bem como diferentes técnicas de concentração secundária; A técnica Celite onde foram avaliados três diferentes tamanhos de partículas Celite (fina, média e grande) seguida da comparação desta técnica com a do método de floculação orgânica estabelecido. Vários aditivos de eluição também foram avaliados quanto à sua capacidade de aumentar a liberação de partículas de adenovírus (AdV) das superfícies do filtro. A celite de partículas finas recuperou níveis semelhantes de AdV40 e 41 aos do método de floculação orgânica estabelecido quando os picos virais foram adicionados durante a concentração secundária. O filtro de vidro/celulose recuperou níveis mais altos de AdV40 e 41, em comparação com um filtro de nano-alumina/fibra de vidro. Embora não seja estatisticamente significativo, a adição de eluente de extrato de carne bovina corrigido com polifosfato de sódio a 0,1% recuperou 10% mais partículas de AdV em comparação com o extrato de carne bovina não alterado.

<html> Seleção Celite Três tipos diferentes de celite foram testados antes da selecção da variante com melhor desempenho. Celites com multa de partículas de tamanho médio produzido as maiores recuperações de adenovírus. Uso de celites maiores percentagens de recuperação mais baixas para ambos AdV40 e 41 (gama de 32% -100%) (Figura 1). A recuperação média de adenovirus 40 eram de 144% ± 52% (multa), 115% ± 28% (média) e 82% ± 53% celites (grande) de partículas e para AdV41, 13...

Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.

Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

O objetivo geral do experimento a seguir é otimizar a recuperação de vírus da água utilizando uma técnica em pequena escala originalmente projetada para otimizar a concentração de vírus. Um filtro de celulose de vidro mostrou-se o melhor filtro eletropositivo para concentrar adenovírus da água. Para a eluição secundária, uma técnica de concentração secundária com celite mostrou-se a melhor para eluir adenovírus das superfícies do filtro. A técnica resultante recupera a maior quantidade de adenovírus da água da torneira, com base nas maiores porcentagens de recuperação observadas entre todas as combinações testadas de filtros e eluições. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a concentração em larga escala por volume, é que ela utiliza volumes menores de amostra, permitindo que uma variedade de variáveis de concentração sejam avaliadas de forma rápida e fácil. Ao se preparar para este protocolo, tenha todas as soluções necessárias prontas, incluindo a solução viral filtrada em 0,22 mícron a 10 a 100.000 MPN por mililitro. Comece medindo um litro de água da torneira estéril. Transfira-o para um béquer de dois litros com uma barra magnética de agitação. Enquanto agita a água, adicione 0,7 gramas de tiossulfato de sódio e deixe dissolver completamente. Em seguida, ajuste o pH para um valor entre 7 e 7,5 adicionando gota a gota soluções estoque de ácido ou base 1 molar. Depois, adicione o vírus à água. Acrescente um mililitro completo da solução de vírus preparada. Cubra o frasco com uma envoltura estéril e deixe o vírus se misturar à água por 10 minutos. Enquanto isso, prepare o filtro Millipore. Primeiro, retire-o da embalagem e certifique-se de que ele se encaixe firmemente entre a tigela superior e a tela inferior. Em seguida, verifique se o material de cortiça do filtro se ajusta bem à borda de um frasco Erlenmeyer de um litro com saída lateral. Agora, remova a tigela superior do filtro e, com pinça, coloque um disco de filtro eletropositivo de 47 milímetros exatamente sobre a tela do filtro. Em seguida, recoloque a tigela e fixe-a com um giro no sentido anti-horário.Meça 100 mililitros da água da torneira contaminada utilizando um cilindro estéril. Em seguida, transfira a água para o suporte de filtro preparado no frasco de dois litros. O disco eletropositivo no filtro pode ser de vidro-cellulose pregueado ou fibra de vidro de nano-alumina. Pode-se utilizar vácuo suave para fazer passar a água residual através do filtro.Agora, transfira o suporte do filtro para um frasco erlenmeyer de 250 mililitros com saída lateral. Meça 100 mililitros de extrato de carne e despeje lentamente sobre o filtro. Deixe o extrato passar lentamente e utilize um vácuo suave para puxar o resíduo remanescente.Em seguida, prossiga com uma das duas opções secundárias de concentração.Para concentrar o vírus utilizando celite, transfira o conteúdo do frasco de 250 mililitros, que contém o vírus, para uma placa de agitação. Usando uma barra de agitação, crie um pequeno vórtice. Em seguida, adicione 0,1 gramas de pó de celite a 100 mililitros de extrato de carne. Deixe a celite se dispersar e prepare-se para ajustar o pH da solução. Com adições gota a gota de ácido clorídrico 0,1 molar, reduza o pH para 4,0.Em seguida, deixe a solução misturar por 10 minutos. Durante a mistura, fixe o seu pré-filtro de 47 mililitros em um frasco de dois litros. Agora, despeje 100 mililitros da mistura de extrato de carne-celite através do pré-filtro. Pode-se usar um leve vácuo para finalizar. Em seguida, coloque um clipe metálico no bico do suporte do filtro. No clipe, acople um tubo coletor estéril de 15 mililitros de polipropileno e, então, remonte o filtro no frasco. Agora, elua o vírus das partículas de Celite em cinco mililitros de PBS 1X com pH nove. Deixe a maior parte do PBS escorrer por gravidade para o tubo de 15 mililitros e aspire o resíduo com uma leve vácuo. Para concentrar o vírus por floculação orgânica, transfira o conteúdo do frasco de 250 mililitros contendo o vírus para uma placa de agitação. Usando um bastão de agitação, crie um pequeno vórtice. Ajuste o pH da solução para 3,5 mediante adições gota a gota de ácido clorídrico 1 M. Em seguida, deixe a mistura sob agitação por meia hora. Posteriormente, transfira a solução para um tubo cônico estéril de centrífuga de 250 mililitros. Centrifugue a solução a 2.500 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, tenha cuidado para não perturbar o pellet ao manipular os tubos. Decante cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS com pH nove. Certifique-se de que o pellet esteja completamente dissolvido. Em seguida, centrifugue a suspensão a 4.000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Agora, colete o sobrenadante, que contém o vírus concentrado. O pellet pode ser descartado.Ao otimizar este protocolo, foram comparados três tipos de celite. Celite de maior tamanho resultou em menores recuperações tanto do ADV 40 quanto do ADV 41.A eluição do filtro foi testada em pH entre 7,5 e 12 para determinar qual seria o mais eficaz na coleta de partículas de ADV a partir dos filtros. A maior recuperação foi obtida com um filtro de celulose vítrea combinado com extrato de carne bovina em pH 10 e com celite. O resultado foi o mesmo com ADV 40 e ADV 41.O extrato de carne em pH 10 mostrou-se superior à floculação orgânica.O método otimizado foi comparado com a adição de 25% de tripsina e com o suplemento do extrato de carne com 0,1% de polifosfato de sódio. Nenhum dos tratamentos melhorou significativamente a recuperação do ADV. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 45 minutos se executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

A taxa de rotatividade de vírus em sistemas marinhos e de água doce pode ser estimado por uma redução e técnica recorrência. Os dados permitem aos pesquisadores inferir as taxas de mortalidade do vírus mediada microbiana em sistemas aquáticos.

Estimar as taxas de produção de vírus em Sistemas Aquáticos

Os filtros de lã de vidro têm sido utilizados para concentrar os vírus pela água por um número de grupos de pesquisa em todo o mundo. Aqui, mostramos uma abordagem simples para a construção de filtros de lã de vidro e demonstrar os filtros são também eficazes na concentração waterborne virais, agentes patogénicos bacterianos e protozoários.

Vidro Filtros de lã para a concentração de vírus e transmitidas pela água Agrícolas patógenos zoonóticos

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O método EPA 1615 usa um filtro eletropositivo para concentrar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. Este manuscrito descreve o procedimento de coleta de amostras para análises do Método 1615.

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O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

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