Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água
3 de fevereiro de 2015
Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.
O objetivo geral do experimento a seguir é otimizar a recuperação do vírus da água. Usando uma técnica de pequena escala originalmente projetada para otimizar as concentrações de vírus. Um filtro de celulose de vidro foi considerado o melhor filtro eletropositivo para concentrar adenovírus de água para a eluição secundária.
Uma técnica de concentração secundária de luz do mar provou ser a melhor para iludir o adenovírus das superfícies do filtro. O resultado na técnica recupera a maior parte do adenovírus da água da torneira com base em ter a maior porcentagem de recuperações observadas entre todas as combinações de filtro e eluição testadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a concentração de volume em larga escala, é que ela utiliza volumes de amostra menores, permitindo que uma infinidade de variáveis de concentração sejam avaliadas de forma rápida e fácil.
Ao se preparar para este protocolo, tenha todas as soluções necessárias prontas, incluindo a solução viral filtrada de 22 mícrons de 10 a 100.000 MPN por mililitro. Comece medindo um litro de água da torneira estéril. Transfira para um copo de dois litros com uma barra de agitação magnética enquanto mexe a água.
Adicione 0,7 gramas de tiossulfato de sódio e deixe dissolver completamente. Em seguida, ajuste um pH entre sete e 7,5 adicionando um ácido molar em soluções estoque de louro gota a gota. Em seguida, salpique a água com vírus.
Adicione um mililitro cheio da solução de vírus preparada. Cubra o frasco com um filme estéril e deixe o vírus se misturar na água por 10 minutos. Enquanto isso, prepare primeiro o filtro millipore, desembrulhe-o da embalagem e certifique-se de que esteja bem encaixado entre a tigela superior e a tela inferior.
Em seguida, verifique se o material de cortiça no filtro se encaixa perfeitamente na borda de um frasco de arma de um litro. Agora remova a tigela superior do filtro e, com uma pinça, coloque um disco de filtro eletropositivo de 47 milímetros diretamente na tela do filtro. Em seguida, recoloque a tigela e trave-a no lugar com um giro no sentido anti-horário.
Meça 100 mililitros de água da torneira enriquecida usando um cilindro estéril. Em seguida, transfira a água para a carcaça do filtro preparada no frasco de dois litros. O disco eletropositivo no filtro pode ser celulose de vidro plissada ou nano Illumina fibra de vidro vácuo suave pode ser usado para passar a água residual através do filtro.
Agora, mova a carcaça do filtro para um balão de arma lateral de 250 mililitros. Meça 100 mililitros de extrato de carne bovina e despeje lentamente no filtro. Deixe o extrato passar lentamente e use um vácuo suave para puxar o residual.
Em seguida, prossiga com qualquer uma das duas opções de concentração secundária para concentrar o vírus usando luz do mar. Transferir o conteúdo do balão de 250 mililitros, que contém o vírus, para uma placa de agitação. Usando uma barra de agitação, crie um pequeno vórtice.
Em seguida, adicione 0,1 gramas de pó cite a 100 mililitros de extrato de carne bovina. Deixe a luz C se dispersar e prepare-se para ajustar o pH das soluções usando adições gota a gota de ácido clorídrico 0,1 molar. Abaixe o pH para 4,0.
Em seguida, deixe a solução misturar por 10 minutos enquanto mistura. Conecte seu pré-filtro de 47 mililitros em um frasco de dois litros. Agora despeje 100 mililitros da mistura de extrato de carne leve do mar através do pré-filtro.
Um leve vácuo pode ser usado para finalizar. Em seguida, coloque um clipe de tubo de metal na extremidade de um bico de carcaça de filtro para o clipe. Colocar um tubo de recolha de polipropileno estéril de 15 ml e voltar a montar o filtro no balão.
Agora elua o vírus das partículas de luz do mar em cinco mililitros de um XPBS em pH nove. Permita que a maior parte do PBS escorra para o tubo de 15 mililitros por gravidade e puxe o resíduo com um leve vácuo para concentrar o vírus usando floculação orgânica. Transferir o conteúdo do balão de 250 mililitros contendo o vírus para uma placa de agitação.
Usando uma barra de agitação, crie um pequeno vórtice, ajuste o pH da solução para 3,5 usando adições gota a gota de um ácido clorídrico molar. Em seguida, deixe a mistura mexer por meia hora depois. Transferir a solução para um tubo de centrifugação cónico estéril de 250 ml.
Girar a solução a 2 500 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius após a centrifugação. Tenha cuidado para não perturbar o pellet ao manusear os tubos com cuidado. Para enlatar o snat e ressuspender o pellet em cinco mililitros de PBS pH nove.
Certifique-se de que o palete esteja dissolvido. Em seguida, centrifugue o Resus a 4.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Agora colete o sobrenadante que contém o vírus concentrado.
O pellet pode ser descartado. Na otimização deste protocolo, três tipos de luz do mar foram comparados maiores. A luz do mar resultou em recuperações mais baixas de um DV 40 e um DV 41.
A eluição do filtro foi testada em PHS entre 7,5 e 12 para determinar qual seria a mais eficaz na coleta de partículas DV dos filtros. A maior recuperação foi obtida a partir de um filtro de celulose de vidro acoplado a extrato bovino em pH 10 e com luz do mar. O resultado foi o mesmo com um DV 40 e um DV 41.
O extrato bovino em pH 10 mostrou-se superior à floculação orgânica. O método otimizado foi comparado com a adição de 25% de tripsina e com a suplementação do extrato bovino com polifosfato de sódio a 0,1%. O tratamento melhorou significativamente.
Uma recuperação de DV Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em 45 minutos se executada corretamente.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para otimizar a recuperação de vírus a partir de amostras de água com pequeno volume, com foco específico no adenovírus humano. A abordagem utiliza um filtro de celulose de vidro e uma técnica de concentração secundária para aumentar as taxas de recuperação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Ciência Ambiental
- Qualidade da Água
Antecedentes
- A concentração de vírus a partir de amostras de água é essencial para o monitoramento ambiental.
- Os métodos existentes frequentemente exigem grandes volumes de amostra, limitando sua eficiência.
- A otimização de técnicas de recuperação pode melhorar a detecção e análise de patógenos virais.
- O adenovírus humano serve como modelo para testar métodos de concentração.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma técnica para identificar condições ideais de concentração viral.
- Avaliar diversas combinações de filtros e eluição para recuperação de adenovírus.
- Facilitar a avaliação rápida de variáveis de concentração utilizando volumes pequenos de amostra.
Métodos Utilizados
- Utilização de um filtro de celulose de vidro para concentração de adenovírus.
- Aplicação de uma técnica secundária de concentração com luz do mar para eluição.
- Comparação de diferentes combinações de filtros e eluições.
- Avaliação das taxas de recuperação de amostras de água da torneira.
Resultados Principais
- O filtro de celulose de vidro demonstrou as taxas mais altas de recuperação para adenovírus.
- A técnica secundária de concentração Sea Light eluiu efetivamente o vírus.
- Volumes pequenos de amostra permitiram uma avaliação rápida de múltiplos parâmetros de concentração.
- O método superou as técnicas tradicionais de concentração em grande volume.
Conclusões
- Essa técnica fornece um meio mais eficiente de recuperar vírus de amostras de água.
- Permite a realização rápida de testes sob diversas condições de concentração.
- A abordagem pode ser adaptada para outros alvos virais além do adenovírus.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A otimização da recuperação de vírus a partir de amostras de água de pequeno volume permite a triagem rápida de parâmetros de concentração, apoiando o desenvolvimento inicial de ensaios em virologia ambiental. O método oferece uma abordagem escalável e economicamente eficaz para avaliar combinações de filtros e eluição, reduzindo o consumo de recursos em fluxos de trabalho de detecção de patógenos pré-clínicos. Ao identificar as condições ideais para a concentração de adenovírus, a técnica aumenta a confiança preditiva em aplicações de detecção posteriores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da eficiência de recuperação viral entre diferentes tipos de filtros e condições de eluição, apoiando a validação de alvos na detecção de patógenos ambientais.
- Valor Operacional: Utiliza pequenos volumes de amostra (1-10 L simulados com 100 mL) para testar rapidamente múltiplas variáveis, acelerando a geração de hipóteses para a otimização da concentração de vírus.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de recuperação (porcentagem de recuperação de AdV40 e AdV41) para subsidiar a padronização e reprodutibilidade de ensaios em plataformas de detecção viral.
- Valor Operacional: Prepara sistemas biológicos validados (vírus concentrado em 5-30 mL) para aplicações posteriores, como ensaios de infectividade ou análise genômica.
- Valor Estratégico: Apoia a preparação para triagem ao permitir a comparação rápida de filtros eletropositivos (vidro/celulose versus nano-alumina/vidro) e técnicas secundárias de concentração (celite versus floculação orgânica).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza o adenovírus humano como modelo relevante para doenças na avaliação do desempenho de métodos de concentração, apoiando o desenvolvimento translacional de biomarcadores para patógenos veiculados pela água.
- Valor Operacional: Garante continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, fornecendo vírus concentrado adequado para caracterização adicional.
- Valor Estratégico: Facilita decisões de avanço com base no risco, identificando combinações de filtração e eluição com alta recuperação (filtro de celulose vítreo com extrato de carne bovina em pH 10 e luz do mar).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos promissores na detecção de patógenos ambientais, permitindo iteração rápida nas variáveis de concentração antes da ampliação para volumes maiores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre variáveis de filtração e eluição para esclarecer os mecanismos de liberação do vírus de superfícies e otimizar a eficiência de recuperação.
- Triagem: Fornece concentrações de vírus prontas para ensaio (5-30 mL) com resultados quantitativos (porcentagem de recuperação) para comparação de condições entre tipos de filtro e aditivos de eluição.
- Análises: Permite a medição de variáveis dependentes (recuperação viral por qPCR ou infectividade) para avaliar estatisticamente o impacto de variáveis independentes (tipo de filtro, pH de eluição, tamanho das partículas de celite).
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer adenovírus concentrado adequado para validação subsequente em culturas celulares ou modelos animais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para otimizar a concentração de vírus em múltiplos alvos virais além do adenovírus, reduzindo o desenvolvimento redundante de métodos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em métodos de recuperação de vírus ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio da avaliação sistemática dos parâmetros de filtração e eluição.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de etapas definidas (eluição com extrato de carne, concentração secundária com sea light, ajuste de pH para 4,0) e pontos finais quantificáveis (porcentagem de recuperação de AdV40 e AdV41).
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir no desenvolvimento de ensaios de detecção de patógenos ao identificar as condições ótimas (filtro de celulose de vidro, extrato de carne em pH 10, sea light) com maior recuperação observada.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de métodos de concentração para programas de monitoramento ambiental, reduzindo falhas em estágios avançados dos fluxos de trabalho de detecção de patógenos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em virologia, técnicas de filtração e manipulação precisa de líquidos para as etapas de inoculação viral, montagem do filtro e centrifugação.
- Depende de instrumentação, incluindo sistemas de filtração a vácuo, placas agitadoras, medidores de pH, centrífugas (capazes de 2.500 G e 4.000 G) e tubos estéreis para tubulação e coleta.
- Necessita padronização entre equipes na preparação de soluções (extrato de carne, celite, HCl, PBS) e nos controles ambientais (centrifugação a 4°C, condições estéreis) para garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes tipos de vírus ou matrizes aquosas, já que a eficiência de recuperação pode variar conforme as propriedades virais (por exemplo, sorotipo de adenovírus) e a composição da amostra (água da torneira versus fontes ambientais).
- As limitações práticas incluem a necessidade de técnica asséptica durante o manuseio de vírus e a variabilidade potencial no desempenho entre diferentes lotes de filtros, o que pode afetar a consistência da eluição.
