Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água
3 de fevereiro de 2015
Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.
O objetivo geral do experimento a seguir é otimizar a recuperação de vírus da água utilizando uma técnica em pequena escala originalmente projetada para otimizar a concentração de vírus. Um filtro de celulose de vidro mostrou-se o melhor filtro eletropositivo para concentrar adenovírus da água. Para a eluição secundária, uma técnica de concentração secundária com celite mostrou-se a melhor para eluir adenovírus das superfícies do filtro. A técnica resultante recupera a maior quantidade de adenovírus da água da torneira, com base nas maiores porcentagens de recuperação observadas entre todas as combinações testadas de filtros e eluições.
A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a concentração em larga escala por volume, é que ela utiliza volumes menores de amostra, permitindo que uma variedade de variáveis de concentração sejam avaliadas de forma rápida e fácil.
Ao se preparar para este protocolo, tenha todas as soluções necessárias prontas, incluindo a solução viral filtrada em 0,22 mícron a 10 a 100.000 MPN por mililitro.
Comece medindo um litro de água da torneira estéril. Transfira-o para um béquer de dois litros com uma barra magnética de agitação. Enquanto agita a água, adicione 0,7 gramas de tiossulfato de sódio e deixe dissolver completamente. Em seguida, ajuste o pH para um valor entre 7 e 7,5 adicionando gota a gota soluções estoque de ácido ou base 1 molar. Depois, adicione o vírus à água. Acrescente um mililitro completo da solução de vírus preparada. Cubra o frasco com uma envoltura estéril e deixe o vírus se misturar à água por 10 minutos.
Enquanto isso, prepare o filtro Millipore. Primeiro, retire-o da embalagem e certifique-se de que ele se encaixe firmemente entre a tigela superior e a tela inferior. Em seguida, verifique se o material de cortiça do filtro se ajusta bem à borda de um frasco Erlenmeyer de um litro com saída lateral. Agora, remova a tigela superior do filtro e, com pinça, coloque um disco de filtro eletropositivo de 47 milímetros exatamente sobre a tela do filtro. Em seguida, recoloque a tigela e fixe-a com um giro no sentido anti-horário.
Meça 100 mililitros da água da torneira contaminada utilizando um cilindro estéril. Em seguida, transfira a água para o suporte de filtro preparado no frasco de dois litros. O disco eletropositivo no filtro pode ser de vidro-cellulose pregueado ou fibra de vidro de nano-alumina. Pode-se utilizar vácuo suave para fazer passar a água residual através do filtro.
Agora, transfira o suporte do filtro para um frasco erlenmeyer de 250 mililitros com saída lateral. Meça 100 mililitros de extrato de carne e despeje lentamente sobre o filtro. Deixe o extrato passar lentamente e utilize um vácuo suave para puxar o resíduo remanescente.
Em seguida, prossiga com uma das duas opções secundárias de concentração.
Para concentrar o vírus utilizando celite, transfira o conteúdo do frasco de 250 mililitros, que contém o vírus, para uma placa de agitação. Usando uma barra de agitação, crie um pequeno vórtice. Em seguida, adicione 0,1 gramas de pó de celite a 100 mililitros de extrato de carne. Deixe a celite se dispersar e prepare-se para ajustar o pH da solução. Com adições gota a gota de ácido clorídrico 0,1 molar, reduza o pH para 4,0.
Em seguida, deixe a solução misturar por 10 minutos. Durante a mistura, fixe o seu pré-filtro de 47 mililitros em um frasco de dois litros. Agora, despeje 100 mililitros da mistura de extrato de carne-celite através do pré-filtro. Pode-se usar um leve vácuo para finalizar.
Em seguida, coloque um clipe metálico no bico do suporte do filtro. No clipe, acople um tubo coletor estéril de 15 mililitros de polipropileno e, então, remonte o filtro no frasco.
Agora, elua o vírus das partículas de Celite em cinco mililitros de PBS 1X com pH nove. Deixe a maior parte do PBS escorrer por gravidade para o tubo de 15 mililitros e aspire o resíduo com uma leve vácuo. Para concentrar o vírus por floculação orgânica, transfira o conteúdo do frasco de 250 mililitros contendo o vírus para uma placa de agitação. Usando um bastão de agitação, crie um pequeno vórtice. Ajuste o pH da solução para 3,5 mediante adições gota a gota de ácido clorídrico 1 M. Em seguida, deixe a mistura sob agitação por meia hora. Posteriormente, transfira a solução para um tubo cônico estéril de centrífuga de 250 mililitros. Centrifugue a solução a 2.500 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, tenha cuidado para não perturbar o pellet ao manipular os tubos. Decante cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS com pH nove. Certifique-se de que o pellet esteja completamente dissolvido. Em seguida, centrifugue a suspensão a 4.000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Agora, colete o sobrenadante, que contém o vírus concentrado. O pellet pode ser descartado.
Ao otimizar este protocolo, foram comparados três tipos de celite. Celite de maior tamanho resultou em menores recuperações tanto do ADV 40 quanto do ADV 41.
A eluição do filtro foi testada em pH entre 7,5 e 12 para determinar qual seria o mais eficaz na coleta de partículas de ADV a partir dos filtros. A maior recuperação foi obtida com um filtro de celulose vítrea combinado com extrato de carne bovina em pH 10 e com celite. O resultado foi o mesmo com ADV 40 e ADV 41.
O extrato de carne em pH 10 mostrou-se superior à floculação orgânica.
O método otimizado foi comparado com a adição de 25% de tripsina e com o suplemento do extrato de carne com 0,1% de polifosfato de sódio. Nenhum dos tratamentos melhorou significativamente a recuperação do ADV.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 45 minutos se executada corretamente.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para otimizar a recuperação de vírus a partir de amostras de água com pequeno volume, com foco específico no adenovírus humano. A abordagem utiliza um filtro de celulose de vidro e uma técnica de concentração secundária para aumentar as taxas de recuperação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Ciência Ambiental
- Qualidade da Água
Antecedentes
- A concentração de vírus a partir de amostras de água é essencial para o monitoramento ambiental.
- Os métodos existentes frequentemente exigem grandes volumes de amostra, limitando sua eficiência.
- A otimização de técnicas de recuperação pode melhorar a detecção e análise de patógenos virais.
- O adenovírus humano serve como modelo para testar métodos de concentração.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma técnica para identificar condições ideais de concentração viral.
- Avaliar diversas combinações de filtros e eluição para recuperação de adenovírus.
- Facilitar a avaliação rápida de variáveis de concentração utilizando volumes pequenos de amostra.
Métodos Utilizados
- Utilização de um filtro de celulose de vidro para concentração de adenovírus.
- Aplicação de uma técnica secundária de concentração com luz do mar para eluição.
- Comparação de diferentes combinações de filtros e eluições.
- Avaliação das taxas de recuperação de amostras de água da torneira.
Resultados Principais
- O filtro de celulose de vidro demonstrou as taxas mais altas de recuperação para adenovírus.
- A técnica secundária de concentração Sea Light eluiu efetivamente o vírus.
- Volumes pequenos de amostra permitiram uma avaliação rápida de múltiplos parâmetros de concentração.
- O método superou as técnicas tradicionais de concentração em grande volume.
Conclusões
- Essa técnica fornece um meio mais eficiente de recuperar vírus de amostras de água.
- Permite a realização rápida de testes sob diversas condições de concentração.
- A abordagem pode ser adaptada para outros alvos virais além do adenovírus.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A otimização da recuperação de vírus a partir de amostras de água de pequeno volume permite a triagem rápida de parâmetros de concentração, apoiando o desenvolvimento inicial de ensaios em virologia ambiental. O método oferece uma abordagem escalável e economicamente eficaz para avaliar combinações de filtros e eluição, reduzindo o consumo de recursos em fluxos de trabalho de detecção de patógenos pré-clínicos. Ao identificar as condições ideais para a concentração de adenovírus, a técnica aumenta a confiança preditiva em aplicações de detecção posteriores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da eficiência de recuperação viral entre diferentes tipos de filtros e condições de eluição, apoiando a validação de alvos na detecção de patógenos ambientais.
- Valor Operacional: Utiliza pequenos volumes de amostra (1-10 L simulados com 100 mL) para testar rapidamente múltiplas variáveis, acelerando a geração de hipóteses para a otimização da concentração de vírus.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de recuperação (porcentagem de recuperação de AdV40 e AdV41) para subsidiar a padronização e reprodutibilidade de ensaios em plataformas de detecção viral.
- Valor Operacional: Prepara sistemas biológicos validados (vírus concentrado em 5-30 mL) para aplicações posteriores, como ensaios de infectividade ou análise genômica.
- Valor Estratégico: Apoia a preparação para triagem ao permitir a comparação rápida de filtros eletropositivos (vidro/celulose versus nano-alumina/vidro) e técnicas secundárias de concentração (celite versus floculação orgânica).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza o adenovírus humano como modelo relevante para doenças na avaliação do desempenho de métodos de concentração, apoiando o desenvolvimento translacional de biomarcadores para patógenos veiculados pela água.
- Valor Operacional: Garante continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, fornecendo vírus concentrado adequado para caracterização adicional.
- Valor Estratégico: Facilita decisões de avanço com base no risco, identificando combinações de filtração e eluição com alta recuperação (filtro de celulose vítreo com extrato de carne bovina em pH 10 e luz do mar).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos promissores na detecção de patógenos ambientais, permitindo iteração rápida nas variáveis de concentração antes da ampliação para volumes maiores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre variáveis de filtração e eluição para esclarecer os mecanismos de liberação do vírus de superfícies e otimizar a eficiência de recuperação.
- Triagem: Fornece concentrações de vírus prontas para ensaio (5-30 mL) com resultados quantitativos (porcentagem de recuperação) para comparação de condições entre tipos de filtro e aditivos de eluição.
- Análises: Permite a medição de variáveis dependentes (recuperação viral por qPCR ou infectividade) para avaliar estatisticamente o impacto de variáveis independentes (tipo de filtro, pH de eluição, tamanho das partículas de celite).
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer adenovírus concentrado adequado para validação subsequente em culturas celulares ou modelos animais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para otimizar a concentração de vírus em múltiplos alvos virais além do adenovírus, reduzindo o desenvolvimento redundante de métodos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em métodos de recuperação de vírus ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio da avaliação sistemática dos parâmetros de filtração e eluição.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de etapas definidas (eluição com extrato de carne, concentração secundária com sea light, ajuste de pH para 4,0) e pontos finais quantificáveis (porcentagem de recuperação de AdV40 e AdV41).
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir no desenvolvimento de ensaios de detecção de patógenos ao identificar as condições ótimas (filtro de celulose de vidro, extrato de carne em pH 10, sea light) com maior recuperação observada.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de métodos de concentração para programas de monitoramento ambiental, reduzindo falhas em estágios avançados dos fluxos de trabalho de detecção de patógenos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em virologia, técnicas de filtração e manipulação precisa de líquidos para as etapas de inoculação viral, montagem do filtro e centrifugação.
- Depende de instrumentação, incluindo sistemas de filtração a vácuo, placas agitadoras, medidores de pH, centrífugas (capazes de 2.500 G e 4.000 G) e tubos estéreis para tubulação e coleta.
- Necessita padronização entre equipes na preparação de soluções (extrato de carne, celite, HCl, PBS) e nos controles ambientais (centrifugação a 4°C, condições estéreis) para garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes tipos de vírus ou matrizes aquosas, já que a eficiência de recuperação pode variar conforme as propriedades virais (por exemplo, sorotipo de adenovírus) e a composição da amostra (água da torneira versus fontes ambientais).
- As limitações práticas incluem a necessidade de técnica asséptica durante o manuseio de vírus e a variabilidade potencial no desempenho entre diferentes lotes de filtros, o que pode afetar a consistência da eluição.
