Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

O objetivo geral deste procedimento é utilizar uma técnica baseada em impedância para acompanhar em tempo real a citoproteção de uma linhagem celular neuronal, a fim de delinear o envolvimento das vias de mensageiros secundários no processo de proteção. Isso é realizado primeiramente cultivando uma linhagem celular neuronal sob condições proliferativas em um analisador celular em tempo real baseado em impedância. Na segunda etapa, potencialmente relevante.

As vias de mensageiros secundários são inibidas farmacologicamente antes de submeter a linhagem celular a tratamentos neuroprotetores. Em seguida, o estado da linhagem celular neuronal é monitorado utilizando um analisador celular em tempo real sob diferentes condições experimentais. Por fim, a análise estatística pode ser utilizada para avaliar o envolvimento em tempo real das vias de mensageiros secundários na citoproteção das células neuronais.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como ensaios de neurotoxicidade em ponto final, é que ela permite avaliar a proteção Tito e a toxicidade Tito em linhagens celulares neuronais em tempo real e em condições livres de marcadores. Este método pode ajudar a responder rapidamente perguntas no campo da neurobiologia molecular, contribuindo para uma avaliação mais em alto rendimento de compostos neuroprotetores potenciais in vitro e fornecendo insights sobre os mecanismos moleculares envolvidos na neuroproteção. Comece lavando uma camada de linhagem celular neuronal aderente. Por exemplo, aqui são utilizadas células de neuroblastoma humano S-K-N-S-H com PBS, seguido de tripsinização das células por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Remova a tripsina por centrifugação e, em seguida, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio de proliferação. Após a contagem das células, dilua-as até uma concentração de três vezes 10 à quinta células por mililitro com mais meio de proliferação, depois equilibre cada poço de uma placa EPL 96 com 100 microlitros de meio de proliferação em uma cabine de cultura celular à temperatura ambiente. Após 30 minutos, insira a placa EPL 96 em uma estação de analisador de células em tempo real em um incubador de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e inicie o software do analisador de células em tempo real.

Em seguida, na página de layout, selecione as placas apropriadas para o experimento e insira o tipo celular, o número de células e os nomes e concentrações dos compostos químicos de interesse nos campos de edição na página do software de programação, já que o passo um está predefinido. Para a medição de fundo, selecione adicionar um passo e configure o passo dois para medir o índice celular a cada 15 minutos durante 96 horas. Em seguida, clique em iniciar para iniciar o passo um e para medir a impedância de fundo do meio.

Agora remova o EPL e adicione 100 microlitros da suspensão de células de neuroblastoma. Em cada poço experimental, agite suavemente o EPL 96 para revestir uniformemente os poços e, em seguida, incube a placa em temperatura ambiente na cabine de cultura de tecidos para permitir que as células sedimentem. Após meia hora, recoloque o EPL 96 na estação do analisador de células em tempo real e inicie o passo dois. Para monitorar os valores do índice celular durante todo o experimento, visualize as curvas celulares na página de gráficos e os dados brutos do índice celular na página do índice celular após 24 horas.

Após o plaqueamento das células, pause o experimento e remova a placa da estação analisadora de células em tempo real. Adicione um microlitro dos inibidores de interesse recém-diluídos em cada poço e, após recarregar o EPL 96, reinicie as medições do índice celular após 30 minutos. Em seguida, pause novamente o experimento e remova rapidamente, mas com cuidado, o meio de proliferação de cada poço, direcionando a borda da ponteira de pipeta para o canto do poço para evitar perturbar a camada de células aderentes. Então, adicione imediatamente 200 microlitros de meio de privação de soro a cada poço, um microlitro dos compostos neuroprotetores de interesse recém-diluídos e um microlitro dos inibidores de vias de mensageiros secundários de interesse nos poços apropriados.

Em seguida, prossiga com as medições do índice celular a cada 15 minutos durante 96 horas conforme configurado anteriormente para analisar os dados. Agora, selecione as funções de índice celular normalizado e tempo normalizado na página do gráfico para normalizar o índice celular ao último ponto temporal antes das modificações no cultivo celular, a fim de reduzir a variação entre os experimentos. Destaque as poças na página do gráfico para as condições experimentais de interesse e clique em adicionar para traçar as curvas do índice celular normalizado.

Em seguida, exporte os dados experimentais de todos os pontos temporais do índice celular da página do software de índice celular para um arquivo de planilha, a fim de realizar a análise estatística das diferenças nos valores do índice celular sob diferentes condições de tratamento em pontos temporais específicos. Selecione os valores do índice celular nos respectivos pontos temporais dentro do arquivo de planilha exportado. Por fim, analise os valores do índice celular para os pontos temporais selecionados por meio de análise de variância unidirecional ou bidirecional, seguida de um teste post hoc. Usando software estatístico, estímulos neurotóxicos aplicados às células levam à redução dos valores do índice celular; aqui, observa-se um aumento do índice celular quando as células S-K-N-S-H são cultivadas em meio de proliferação e a queda do índice celular seguida por uma estabilização em novos níveis mais baixos após a troca para meio com privação de soro é demonstrada nestes gráficos.

O efeito neuroprotetor de dois agonistas do receptor de serotonina 2A, cinco micromolar de DOI e 20 micromolar de IDE, adicionados quando as células foram cultivadas em meio com privação de soro, pode ser observado. Uma questão importante nos estudos de neuroproteção é se um efeito sobre a proliferação celular contribui para o efeito do composto observado na sobrevivência celular. Neste gráfico, a ausência de efeito do tratamento com cinco micromolar de DOI sobre a proliferação de células SKNS é demonstrada, sugerindo que a proliferação não contribui para o efeito neuroprotetor observado.

Neste gráfico final, pode-se observar o efeito do tratamento com 10 micromolar do inibidor da fosfatidilinositol 3-quinase LY 2 9 4 0 0 2 sobre a sobrevivência celular e o efeito neuroprotetor do DOI em células SK-N-SH privadas de soro. O LY 2 9 4 0 0 2 impediu o efeito neuroprotetor do DOI durante a fase de privação de soro, mas também exibiu um certo efeito tóxico próprio. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como acompanhar a proteção contra CTO em uma linhagem celular neuronal utilizando um analisador celular em tempo real e de como delinear o envolvimento das vias de mensageiros secundários na proteção.