Name: Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda a usar análise de impedância em tempo real para monitorar citoproteção em linhagens neuronais e elucidar vias de segundos mensageiros. Este método permite avaliar neurotoxicidade e identificar compostos neuroprotetores de forma contínua e sem marcadores.

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O apoio financeiro para os experimentos apresentados no estudo foi fornecido pelo programa Marie Heim-Vögtlin da Swiss National Science Foundation.
Agradecemos à Sra. Johanna Nyffeler por desenvolver um conjunto de programas MATLAB modificados para triagem de diferenças estatisticamente significativas nos dados do analisador de células em tempo real e ao Dr. Yama Abassi pela discussão útil.

1 Preparação <ol><li> Coloque a estação do analisador de células em tempo real num incubador de cultura de tecido fixado a 37 ° C e com 5% de CO 2. Realizar toda a manipulação de cultura de células e tratamentos farmacológicos em um capuz de cultura de tecidos em condições de esterilidade. </li><li> NOTA: Neuronal linhas celulares que requerem ajustes de temperatura diferentes em relação às condições normais de cultura, deve ser ajustada em conformidade. Para as linhas de células fracamente aderentes, utilizar agentes de revestimento para facilitar a interacção das células com os microeléctrodos de ouro no fundo dos poços da placa de E-96. </li><li> Preparar soluções 1000X ações dos compostos farmacológicos para o tratamento de cultura de células (agentes neuroprotetores ou inibidores vias de segundo mensageiro no solvente apropriado - dimetilsulfóxido ou água estéril) e armazená-los a -20 ° C. Use o solvente como veículo nos seguintes tratamentos. </li><li> Cultura de células de neuroblastoma humano SK-N-SH em DMEM / F12 suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) (meio de proliferação) em frascos de cultura de células com 175 cm 2, a densidade de superfície de cerca de 75%. Manter passagem número de células dentro de uma gama de (cerca de 10 passagens) para verificar a coerência entre as experiências em termos de taxa de proliferação celular e resposta a citotoxicidade. São preferidos os números de passagem inferior. </li><li> Lava-se a camada de células SK-N-SH aderente com PBS, e trypsinize com solução de tripsina-EDTA a 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Centrifugar as células a 170 x g durante 5 minutos para remover a tripsina. Ressuspender as células em 10 ml de meio de proliferação. Contar as células com o contador de células Scepter e ajustar o número de células de 300.000 células / ml, diluindo as células com meio de proliferação. </li></ol> 2. Galvanização e proliferação de SK-N-SH Células <ol><li> Adicionar meio de proliferação de 100 ul a cada poço da placa de E-96 e deixá-lo por 30 minutos na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente para equilibrar. Insira o E-Plate 96 em tempo real a estação analisador de células na incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Inicie o software em tempo real analisador de células. Na página de layout, selecione os poços incluídos no experimento e entrar nas caixas de edição a informação sobre o tipo de celular, número de células, nomes e concentrações de compostos químicos utilizados para o tratamento de células. NOTA: Para efeitos do presente protocolo, pelo menos, 4 repetições são recomendados para cada tratamento. </li><li> Na página de software Programação determinar &quot;Passos&quot; incluídos no experimento, selecionando o número de varreduras de medição Índice de celular eo intervalo entre as varreduras para cada etapa. Desde Passo 1 é pré-determinado para a medida de fundo, selecione &quot;Adicionar uma etapa&quot; e defina o Passo 2 para medir o Índice de celular a cada 15 minutos durante 96 horas. NOTA: Para os tratamentos, no qual são esperados efeitos com cinética rápida, definir varreduras em intervalos mais curtos. </li><li> Clique em Iniciar para iniciar a etapa pré-determinado automaticamente ume medir a impedância dos meios de fundo. Este valor é automaticamente subtraídos pelo programa em cada ponto de dados uma vez que as células são adicionadas aos poços. </li><li> Utilizar a suspensão de células previamente preparada no passo 1.5) de 300.000 células / ml em meio de proliferação. 30.000 células / poço de toxicidade celular / estudos de neuroproteção e 15.000 células / poço para estudos de proliferação celular. Retire o E-Plate e adicionar 100 mL de suspensão de células por poço para os estudos de toxicidade celular / neuroproteção e adicionar suspensão de células de 50 mL e meio de proliferação 50 ul por poço para os estudos de proliferação celular. O número de células plaqueadas por cavidade tem de ser optimizada para cada linha celular empiricamente. </li><li> Agite suavemente o E-Plate 96, mesmo para metalização das células. Deixar a placa de E-96 durante 30 minutos na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente para permitir que as células assentar uniformemente ao fundo dos poços. </li><li> Insira o E-Plate 96 no tempo real da estação analisador de células e começar Passo 2 no Cronograma pidade. Monitorar valores do Índice de celular em todo o experimento, exibindo as curvas de celulares na página Plot e os dados do Índice de celular matérias sobre o celular Index página do software. </li></ol> 3. Serum Privação <ol><li> 24 h após o plaqueamento das células, uma pausa na experiência, e remover a placa de E-96 a partir da estação em tempo real analisador de células. Dilui-se inibidores de segundo mensageiro de estoques 1000X com meio livre de soro / DMEM F12 - 200 × a concentração final. Tratar as células com 1 ul inibidores das vias de segundo mensageiro a ser testado para o seu envolvimento na neurotoxicidade / neuroprotecção 30 min antes de se iniciar a citotoxicidade, para inibir as respectivas vias. Retorne o E-Plate 96 para a estação e retomar as medições do Índice célula experimental. </li><li> Depois de uma pausa de 30 minutos novamente a experiência. Remova cuidadosamente meio de proliferação plenamente do E-placa de 96 poços com uma pipeta (ou multi-canal pipeta), tomando cuidado para não romper a camada de células aderentesdirigindo a extremidade da ponta da pipeta para o canto do poço. Adicione 200 ^ l / poço de DMEM isento de soro / meio F12 (meio privação de soro). Assegurar a troca rápida de meio de cultura de células, para minimizar a agitação mecânica das células. </li><li> Dilui-se os compostos a ser testados quanto aos seus efeitos neuroprotectores de 1000X estoque com meio DMEM / F12 isento de soro de 200 × a concentração final. Adicionar 1 ul compostos a ser testados quanto aos seus efeitos neuroprotectores e 1 ul inibidores das vias de segundo mensageiro em poços individuais de acordo com o plano experimental. </li><li> Em células para estudos de proliferação não mudam médio. Dilui-se os compostos a ensaiar a partir de estoque 1000X de 200 × a concentração final no meio de proliferação, trata-se com 1 ul por poço e continuar a cultura no meio de proliferação. </li><li> Retomar a experiência para continuar com celulares medições índice a cada 15 minutos durante 96 horas como definido anteriormente. </li></ol> 4 Dados Análise <ol><li> Para neurotoxicidade / dados de neuroproteção normalizar Índice celular para o último ponto de tempo antes do tratamento farmacológico ou mudança de meio para reduzir a variação entre os experimentos, selecionando &quot;Índice celular normalizado&quot; e &quot;normalizar Time&quot; na página Plot. </li><li> Destaque os poços na página Plot para as condições experimentais de interesse e clique em &quot;Adicionar&quot; para traçar as curvas de índice de celular normalizados. Observar a cinética do efeito neurotóxico / neuroprotectora, ou de inibição segundo mensageiros como curvas normalizadas Índice celular como uma função do tempo. </li><li> Observar as curvas Índice celular para os tratamentos com fármacos testados em meio de proliferação, como uma função do tempo para avaliar se um efeito sobre a proliferação está envolvido no efeito neuroprotector / neurotóxico. </li><li> Exportar a informação experimental para todos os pontos celular tempo Índice da página em software celular índice em um arquivo do Excel para iniciar a avaliação estatística dos resultados <br/&gt; NOTA: Como passo inicial na análise estatística de um conjunto de programas modificados MATLAB que usam o teste t de Welch, com o valor de p plotados semilogarithmically, utilizar eixo invertido contra a escala de tempo (fornecido como arquivos de código complementar). Estes programas permitem a detecção de valores de p ao longo do tempo de toda uma experiência em tempo real analisador de células e, assim, ajudar a seleção de pontos de tempo para a análise estatística mais detalhada. Veja o material suplementar para obter informações detalhadas sobre os programas. </li><li> Para a análise estatística das diferenças de valores do Índice de celulares em diferentes condições de tratamento em momentos específicos, selecione valores do Índice de celular em respectivos tempos de arquivo exportado Excel. Analisar os valores do Índice de celular para os pontos de tempo seleccionados com unidirecional ou bidirecional análise de variância (ANOVA) seguida do teste post-hoc usando o software estatístico. </li></ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
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<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
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<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

Os custos de publicação para o atual vídeo-artigo foram patrocinados pela &quot;ACEA Biociências&quot;.

O protocolo atual apresenta a utilidade de um analisador de células em tempo real para avaliar de forma contínua e em condições livres de etiqueta os efeitos neuroprotetores / neurotóxicos de compostos em linhas de células neuronais e para obter insights sobre as segundas vias mensageiros envolvidos no efeito. Embora a utilidade do analisador de células em tempo real para estudar a toxicidade e efeitos das drogas sobre a proliferação celular é geralmente reconhecido, poucos estudos têm usado...

Morte das células neuronais desempenha um papel fundamental na fisiopatologia de várias doenças relacionadas com o cérebro 1. A disponibilidade de dados fiáveis ​​e de alto rendimento em ensaios de toxicidade in vitro é fundamental para obter uma melhor visão sobre os mecanismos de neurotoxicidade e ajudar a selecionar moléculas neuroprotetores como candidatos terapêuticas no desenvolvimento de medicamentos 2. No entanto, existem muitas limitações para mais amplamente utilizados em assays.They neurotoxicidade in vitro avaliar a neurotoxicidade / neuroprotecção a um único ponto de tempo, não permitindo resolução cinética; costumam usar etiqueta ou sonda que pode interferir com as vias de sinalização e limitar estudos adicionais na mesma população de células, e muitas vezes são de trabalho intensivo, e em muitos casos não fornecem uma visão mecanicista. No presente estudo demonstram a utilidade de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar a neurotoxicidade e neuroprotecção em uma linha de células neuronais em tempo real e sob livre de marcadorcondições e fornecer informações sobre os mecanismos a jusante, através da análise das vias de segundos mensageiros envolvidos no efeito. Estudos anteriores confirmaram a validade do analisador de células em tempo real para determinar a citotoxicidade, bem como os efeitos sobre a proliferação de células nas linhas de células em comparação com as técnicas convencionais 3,4,5,6. Por exemplo, observou-se uma boa correlação entre as leituras do ensaio padrão de viabilidade celular WST-1 e valores de índice de células em vários pontos de tempo, sob condições de proliferação basal e após dois paradigmas diferentes tóxicos em células HeLa 3. Em A549 e MDA-MB-231 células de proliferação e de citotoxicidade provocada com o paclitaxel microtúbulos estabilizador mostrou valores muito semelhantes, quando avaliada através de medições de índice celular e utilizado de forma padrão a sulforodamina B (SRB) 4. Na linha de célula neuronal de neurônios do hipocampo imortalizados HT-22 Celulares medições do Índice foram validados por sua capacidade to detectar a proliferação de células, a citotoxicidade do glutamato e citoprotecção contra a amplamente utilizado 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil-brometo (MTT) 5. No mesmo estudo os resultados do ensaio de MTT e medições de índice celular também se correlacionou bem na medição neuronal proliferação de células progenitoras, citotoxicidade após privação de fatores de crescimento e resgate de citotoxicidade pelo pan-caspase inibidor QVD 5. A citotoxicidade induzida em células NIH 3T3 por Vandetanib (crescimento endotelial vascular receptor do factor inibidor e do receptor do factor de crescimento epidérmico), mostrou resultados semelhantes medidos com os valores de índice celular ou ensaio de incorporação de vermelho neutro 6. Usámos recentemente o sistema analisador de células em tempo real para avaliar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT 2A) agonista do receptor de cloridrato de (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine (DOI), em uma linha de células neuronais ( células SK-N-SH) e selecionados para o envolvimento de secoª vias Messenger através monitorar o efeito da sua inibição química sobre a neuroproteção observada 7. Curiosamente, o receptor 5-HT 2A tem agonistas tanto alucinógenas e nonhallucinogenic (como o DOI e lisuride, respectivamente), o que pode ativar ambas as segundas vias comuns de mensagem e distintas 8. As vantagens da técnica apresentada é que ela permite a coleta de informações em tempo real sobre a sobrevivência das células no decorrer do dia, para delinear as vias de segundo mensageiro envolvido, para avaliar a possível contribuição de efeitos de proliferação de neuroproteção, e para selecionar um tempo ideal para estudos adicionais de ponto final sobre a mesma população de células. Um diagrama esquemático do fluxo no protocolo actual é apresentado na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp; Pacote de sistema RTCA SP</td><td>ACEA Biosciences</td><td>Nº: 00380601030</td><td>Consiste em Analisador RTCA, Estação RTCA SP e Unidade de Controle RTCA</td></tr><tr><td>Placa E 96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>Nº: 05232368001</td><td>Para cultura das células, inseridas na Estação RTCA SP</td></tr> CÉLULAS <tr><td>SK-N-SH</td><td>ATCC (em parceria com LGC Standards)</td><td>HTB-11</td><td>Pode ser substituído por outra linha de células neuronais aderentes de interesse</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>Meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>Suplementos de proliferação, mas não meio de privação de soro</td></tr><tr><td>Frasco de cultura de tecidos T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>Para células de cultura, que serão posteriormente plaqueadas na placa E 96</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Para tripsinização de células cultivadas em frascos de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Contador de células Scepter 2.0 Contador de células</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Para lavar as células</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-Cloridrato DOI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>5-HT2A agonista para tratamento de cultura celular</td></tr><tr><td>Cloridrato LY-294002</td> Inibidor de PI3-K <td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>para tratamento de cultura celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Maleato de lisurida</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td><td>Composto com atividade agonística 5-HT2A para tratamento de cultura celular</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>Para dissolução de LY-294002 e maleato de lisurida</td></tr></tbody></table>

analyzer celular baseado em impedância real-time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Muitas doenças relacionadas com o cérebro tem a morte celular neuronal envolvida na sua fisiopatologia. Melhoria em modelos in vitro para estudar os efeitos neuroprotetores ou neurotóxicos das drogas e vias a jusante envolvidos ajudaria a obter insights sobre os mecanismos moleculares de neuroproteção / neurotoxicidade e, potencialmente, poderia facilitar o desenvolvimento de drogas. No entanto, muitos ensaios in vitro de toxicidade existentes têm limitações importantes - mais avaliar a neurotoxicidade e neuroprotecção num único ponto de tempo, não permitindo observar o decurso do tempo e a cinética do efeito. Além disso, a oportunidade de coletar informações sobre as vias de sinalização a jusante envolvidos na neuroproteção em tempo real seria de grande importância. No protocolo corrente que descrevem a utilização de um analisador de células à base de impedância em tempo real para determinar os efeitos neuroprotectores da serotonina 2A (5-HT 2A) agonistas do receptor numa linha de células neuronais sob livre de marcador e em tempo real Conditíons, utilizando medidas de impedância. Além disso, demonstra-se que os inibidores das vias de segundo mensageiro podem ser utilizados para delinear as moléculas jusante envolvidos no efeito neuroprotector. Os requerentes também descrevem a utilidade desta técnica para determinar se um efeito sobre a proliferação celular, contribui para um efeito neuroprotector observada. O sistema utiliza placas de microeletrônica especiais referidas como E-placas que contêm alternando matrizes de microeletrodos de ouro na superfície inferior dos poços, que servem como sensores celulares. A leitura da impedância é modificada pelo número de células aderentes, a viabilidade celular, a morfologia e a adesão. Um parâmetro adimensional chamado Índice celular é derivada das medições de impedância eléctrica e é usado para representar o estado da célula. Em geral, o analisador de células à base de impedância em tempo real permite em tempo real, livre de marcador de avaliação de neuroprotecção e neurotoxicidade, e a avaliação do envolvimento das vias de segundo mensageiro, contribuindo para maisavaliação detalhada e de alto rendimento de potenciais compostos neuroprotetores em vitro, para a seleção de candidatos terapêuticos.

<html> Privação de soro leva à diminuição nos valores de índice de células, que podem ser monitorados continuamente com o analisador de células em tempo real Neurotóxicos estímulos para as células de levar a uma redução nos valores do índice de células, o que pode ser monitorado em tempo real com a técnica apresentada e a dinâmica dos quais é dependente do estímulo neurotóxico específico e do tipo de célula estudada. Figura 2 mostra o aumento em Índice celula...

Ensaios aprimorados de neurotoxicidade in vitro ajudariam na identificação de novos compostos neuroprotetores. A utilidade de um analisador celular baseado em impedância em tempo real para determinar a citotoxicidade e citoproteção em linhagens celulares neuronais e delinear o envolvimento das vias do segundo mensageiro, obtendo assim informações sobre o mecanismo de neuroproteção é apresentada.

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar uma técnica baseada em impedância para acompanhar em tempo real a citoproteção de uma linhagem celular neuronal, a fim de delinear o envolvimento das vias de mensageiros secundários no processo de proteção. Isso é realizado primeiramente cultivando uma linhagem celular neuronal sob condições proliferativas em um analisador celular em tempo real baseado em impedância. Na segunda etapa, potencialmente relevante.As vias de mensageiros secundários são inibidas farmacologicamente antes de submeter a linhagem celular a tratamentos neuroprotetores. Em seguida, o estado da linhagem celular neuronal é monitorado utilizando um analisador celular em tempo real sob diferentes condições experimentais. Por fim, a análise estatística pode ser utilizada para avaliar o envolvimento em tempo real das vias de mensageiros secundários na citoproteção das células neuronais.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como ensaios de neurotoxicidade em ponto final, é que ela permite avaliar a proteção Tito e a toxicidade Tito em linhagens celulares neuronais em tempo real e em condições livres de marcadores. Este método pode ajudar a responder rapidamente perguntas no campo da neurobiologia molecular, contribuindo para uma avaliação mais em alto rendimento de compostos neuroprotetores potenciais in vitro e fornecendo insights sobre os mecanismos moleculares envolvidos na neuroproteção. Comece lavando uma camada de linhagem celular neuronal aderente. Por exemplo, aqui são utilizadas células de neuroblastoma humano S-K-N-S-H com PBS, seguido de tripsinização das células por cinco minutos a 37 graus Celsius.Remova a tripsina por centrifugação e, em seguida, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio de proliferação. Após a contagem das células, dilua-as até uma concentração de três vezes 10 à quinta células por mililitro com mais meio de proliferação, depois equilibre cada poço de uma placa EPL 96 com 100 microlitros de meio de proliferação em uma cabine de cultura celular à temperatura ambiente. Após 30 minutos, insira a placa EPL 96 em uma estação de analisador de células em tempo real em um incubador de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e inicie o software do analisador de células em tempo real.Em seguida, na página de layout, selecione as placas apropriadas para o experimento e insira o tipo celular, o número de células e os nomes e concentrações dos compostos químicos de interesse nos campos de edição na página do software de programação, já que o passo um está predefinido. Para a medição de fundo, selecione adicionar um passo e configure o passo dois para medir o índice celular a cada 15 minutos durante 96 horas. Em seguida, clique em iniciar para iniciar o passo um e para medir a impedância de fundo do meio.Agora remova o EPL e adicione 100 microlitros da suspensão de células de neuroblastoma. Em cada poço experimental, agite suavemente o EPL 96 para revestir uniformemente os poços e, em seguida, incube a placa em temperatura ambiente na cabine de cultura de tecidos para permitir que as células sedimentem. Após meia hora, recoloque o EPL 96 na estação do analisador de células em tempo real e inicie o passo dois. Para monitorar os valores do índice celular durante todo o experimento, visualize as curvas celulares na página de gráficos e os dados brutos do índice celular na página do índice celular após 24 horas.Após o plaqueamento das células, pause o experimento e remova a placa da estação analisadora de células em tempo real. Adicione um microlitro dos inibidores de interesse recém-diluídos em cada poço e, após recarregar o EPL 96, reinicie as medições do índice celular após 30 minutos. Em seguida, pause novamente o experimento e remova rapidamente, mas com cuidado, o meio de proliferação de cada poço, direcionando a borda da ponteira de pipeta para o canto do poço para evitar perturbar a camada de células aderentes. Então, adicione imediatamente 200 microlitros de meio de privação de soro a cada poço, um microlitro dos compostos neuroprotetores de interesse recém-diluídos e um microlitro dos inibidores de vias de mensageiros secundários de interesse nos poços apropriados.Em seguida, prossiga com as medições do índice celular a cada 15 minutos durante 96 horas conforme configurado anteriormente para analisar os dados. Agora, selecione as funções de índice celular normalizado e tempo normalizado na página do gráfico para normalizar o índice celular ao último ponto temporal antes das modificações no cultivo celular, a fim de reduzir a variação entre os experimentos. Destaque as poças na página do gráfico para as condições experimentais de interesse e clique em adicionar para traçar as curvas do índice celular normalizado.Em seguida, exporte os dados experimentais de todos os pontos temporais do índice celular da página do software de índice celular para um arquivo de planilha, a fim de realizar a análise estatística das diferenças nos valores do índice celular sob diferentes condições de tratamento em pontos temporais específicos. Selecione os valores do índice celular nos respectivos pontos temporais dentro do arquivo de planilha exportado. Por fim, analise os valores do índice celular para os pontos temporais selecionados por meio de análise de variância unidirecional ou bidirecional, seguida de um teste post hoc. Usando software estatístico, estímulos neurotóxicos aplicados às células levam à redução dos valores do índice celular; aqui, observa-se um aumento do índice celular quando as células S-K-N-S-H são cultivadas em meio de proliferação e a queda do índice celular seguida por uma estabilização em novos níveis mais baixos após a troca para meio com privação de soro é demonstrada nestes gráficos.O efeito neuroprotetor de dois agonistas do receptor de serotonina 2A, cinco micromolar de DOI e 20 micromolar de IDE, adicionados quando as células foram cultivadas em meio com privação de soro, pode ser observado. Uma questão importante nos estudos de neuroproteção é se um efeito sobre a proliferação celular contribui para o efeito do composto observado na sobrevivência celular. Neste gráfico, a ausência de efeito do tratamento com cinco micromolar de DOI sobre a proliferação de células SKNS é demonstrada, sugerindo que a proliferação não contribui para o efeito neuroprotetor observado.Neste gráfico final, pode-se observar o efeito do tratamento com 10 micromolar do inibidor da fosfatidilinositol 3-quinase LY 2 9 4 0 0 2 sobre a sobrevivência celular e o efeito neuroprotetor do DOI em células SK-N-SH privadas de soro. O LY 2 9 4 0 0 2 impediu o efeito neuroprotetor do DOI durante a fase de privação de soro, mas também exibiu um certo efeito tóxico próprio. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como acompanhar a proteção contra CTO em uma linhagem celular neuronal utilizando um analisador celular em tempo real e de como delinear o envolvimento das vias de mensageiros secundários na proteção.

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Neste vídeo, demonstramos o processo de monitoramento em tempo real de eventos celulares, incluindo a proliferação de células aderentes, por meio de um ensaio de impedância celular. Aqui, as células aderentes atuam como isolantes, restringindo o fluxo de corrente entre os eletrodos e aumentando a impedância.

Análise baseada em impedância celular para monitoramento de processos celulares em tempo real

Fonte: Mudduluru, G., et. al. Medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células cancerígenas. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra um ensaio baseado em impedância para medir a invasão e migração de células de glioblastoma. As células degradam a matriz extracelular, movem-se através de membranas microporosas e aderem a eletrodos, gerando impedância. Esta análise em tempo real reflete seu potencial invasivo para aplicações de pesquisa do câncer.

Medições baseadas em impedância de invasão de células cancerígenas cerebrais

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

Este manuscrito descreve como preparar biochips fluídicos com células epiteliais branquiais de truta arco-íris para uso em um sensor de impedância de substrato de célula elétrica portátil de campo.  O protocolo para executar um teste rápido de toxicidade da água potável com o sensor também é descrito.

Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar a capacidade das células cancerígenas de migrare e invadir diversas condições de tratamento é crucial para avaliar estratégias terapêuticas. Este protocolo apresenta um método para avaliar as habilidades metastáticas em tempo real de uma linha de células cancerígenas do glioblastoma.

Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Aqui, demonstramos o uso da impedância elétrica baseada em células (CEI) como um método muito fácil e direto para estudar a infecção e replicação do vírus Zika em células humanas em tempo real. Além disso, o ensaio CEI é útil para a avaliação de compostos antivirais.

Plataforma de impedância elétrica baseada em células para avaliar inibidores do vírus Zika em tempo real

Aqui demonstramos a técnica de uso de biossensores baseados em impedância: ECIS e cellZscope, para medir a força da barreira endotelial cerebral. Detalhamos a preparação e a técnica de adição de vários estímulos a um modelo in vitro do endotélio cerebral. Medimos, registramos e fornecemos uma análise representativa dos resultados.

Medindo mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral com dois biossensores baseados em impedância em resposta a células cancerígenas e citocinas

Nós desenvolvemos um programa de computador para analisar a morfologia neuronal. Em combinação com dois existentes ferramentas de análise de código aberto, o nosso programa realiza análise de Sholl e determina o número de neurites, pontos de ramificação, e dicas de neurite. As análises são realizadas para que as mudanças locais na morfologia neurite pode ser observado.

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Aprenda a usar análise de impedância em tempo real para monitorar citoproteção em linhagens neuronais e elucidar vias de segundos mensageiros. Este método permite avaliar neurotoxicidade e identificar compostos neuroprotetores de forma contínua e sem marcadores.

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais (Vídeo) | JoVE Journal

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

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