Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

O objetivo geral deste procedimento é usar uma técnica baseada em impedância para seguir a proteção citogênica em tempo real de uma linha celular neuronal para delinear o envolvimento das vias do segundo mensageiro no processo de proteção. Isso é feito primeiro cultivando uma linha celular neuronal sob condições proliferativas em um analisador de células em tempo real baseado em impedância. Na segunda etapa, potencialmente relevante.

As vias do segundo mensageiro são inibidas farmacologicamente antes de submeter a linhagem celular a tratamentos neuroprotetores. Em seguida, o status da linhagem celular neuronal é acompanhado usando um analisador celular em tempo real sob as diferentes condições experimentais. Em última análise, a análise estatística pode ser usada para avaliar o envolvimento em tempo real das vias do segundo mensageiro na proteção citogênica das células neuronais.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como ensaios de neurotoxicidade de endpoint, é que ela permite que a proteção Tito e a toxicidade tito sejam avaliadas em linhagens celulares neuronais em tempo real e sob condições livres de marcadores. Este método pode ajudar a responder a perguntas rápidas no campo da neurobiologia molecular, contribuindo para uma avaliação de alto rendimento de potenciais compostos neuroprotetores in vitro e fornecendo informações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na neuroproteção Comece lavando uma camada de linha celular neuronal aderente. Por exemplo, aqui, as células SKN H do neuroblastoma humano são usadas com PBS e depois tripsina nas células por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Remova a tripsina por centrifugação e, em seguida, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio de proliferação. Depois de contar as células, dilua as células para uma concentração de três vezes 10 elevado ao quinto de células por mililitro com mais meio de proliferação e, em seguida, equilibre cada poço de um EPL 96 com 100 microlitros de meio de proliferação em uma capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, insira o EPL 96 em uma estação de análise de células em tempo real em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e inicie o software analisador de células em tempo real.

Em seguida, na página de layout, selecione os poços apropriados para o experimento e insira o tipo de célula, o número da célula e os nomes e concentrações dos compostos químicos de interesse nas caixas de edição na página do software de programação, pois a primeira etapa é predefinida. Para a medição em segundo plano, selecione adicionar uma etapa e defina a etapa dois para medir o índice da célula a cada 15 minutos por 96 horas. Em seguida, clique em iniciar para iniciar a etapa um e medir a impedância de fundo da mídia.

Agora remova o EPL e adicione 100 microlitros da suspensão de células do neuroblastoma. Para cada poço experimental, gire suavemente o EPL 96 para revestir uniformemente os poços e, em seguida, incube a placa em temperatura ambiente na capa de cultura de tecidos para permitir que as células se assentem após meia hora, carregue o EPL 96 de volta na estação do analisador de células em tempo real e inicie a etapa dois. Para monitorar os valores do índice de células durante todo o experimento, exiba as curvas de células na página de plotagem e os dados brutos do índice de células na página de índice de células 24 horas.

Depois de revestir as células, pause o experimento e remova a placa da estação do analisador de células em tempo real. Dispensar um microlitro dos inibidores de interesse recentemente diluídos em cada alvéolo e, depois de recarregar o EPL 96, retomar as medições experimentais do índice celular após 30 minutos, pausar novamente a experiência e remover o meio de proliferação de cada alvéolo com rapidez, mas com cuidado, direcionando a borda da ponta da pipeta para o canto do poço para evitar a ruptura da camada celular aderente. Em seguida, adicione imediatamente 200 microlitros de meio de privação sérica a cada poço, um microlitro dos compostos neuroprotetores recém-diluídos de interesse e um microlitro dos inibidores da via do segundo mensageiro de interesse aos poços apropriados.

Em seguida, continue com as medições do índice de células a cada 15 minutos por 96 horas, conforme definido anteriormente para analisar os dados, agora selecione o índice de célula normalizado e as funções de tempo normalizadas na página de plotagem para normalizar o índice de célula para o último ponto de tempo antes das modificações na cultura de células. Reduzir a variação entre os experimentos. Realce os poços na página de plotagem para as condições experimentais de interesse e clique em adicionar para plotar as curvas de índice de células normalizadas.

Em seguida, exporte os dados experimentais para todos os pontos de tempo do índice de células da página do software de índice de células para um arquivo de planilha para análise estatística das diferenças nos valores do índice de células sob as diferentes condições de tratamento em pontos de tempo específicos. Selecione os valores do índice da célula em seus respectivos pontos de tempo no arquivo de planilha exportado. Finalmente, analise os valores do índice celular para os pontos de tempo selecionados com uma ou duas vias de análise de variância, seguida de um teste post hoc Usando software estatístico estímulos neurotóxicos para as células levam a uma diminuição nos valores do índice celular aqui um aumento no índice celular quando as células S-K-N-S-H são cultivadas em meio de proliferação e a queda do índice celular seguida por uma estabilização nos novos níveis mais baixos após A troca das células para o meio de privação de soro é mostrada nesses gráficos.

Pode-se observar o efeito neuroprotetor de dois agonistas do receptor serotonina, dois agonistas do receptor a, cinco micromolares, DOI e 20 micromolares IDE adicionados quando as células foram alimentadas com privação sérica, meio. Uma questão importante em estudos de neuroproteção é se um efeito sobre a proliferação celular contribui para o efeito composto observado sobre a sobrevivência celular. Neste gráfico, a falta de efeito do tratamento com DOI de cinco micromolares na proliferação de células SKNS é mostrada, sugerindo que a proliferação não contribui para o efeito neuroprotetor observado.

Neste gráfico final, pode-se observar o efeito do tratamento com 10 micromolares do inibidor inicial de três quinases fosfatidil LY 2 9 4 0 0 2 na sobrevivência celular e o efeito neuroprotetor do DOI nas células SK NSH privadas de soro. LY 2 9 4 0 0 2 preveniu o efeito neuroprotetor do DOI durante o estágio de privação sérica, mas também exibiu algum efeito tóxico próprio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como seguir a proteção CTO em uma linha celular neuronal usando um analisador de células em tempo real e delinear o envolvimento das vias do segundo mensageiro na proteção.