Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

O objetivo geral deste procedimento é estudar o revestimento olfativo e a formação de memória usando acesso de longo prazo a dois estágios independentes de processamento neuronal em abelhas que se comportam. Isso é feito primeiro montando eletrodos multicanais de baixo custo a partir de microfios de cobre isolados e suportes personalizados. O próximo passo é preparar uma abelha viva removendo uma seção de sua cápsula da cabeça para inserir dois eletrodos tratados com um corante fluorescente no cérebro exposto.

O terceiro passo é registrar as duas neuropílulas ou tratos independentes na via olfativa, enquanto estimula com odores florais e feromônios. Mais tarde, depois de dissecar o cérebro, um marcador fluorescente diferente é injetado no lóbulo da antena para preencher os neurônios-alvo. As trilhas preenchidas e os traçados dos eletrodos são então visualizados para produzir uma reconstrução tridimensional da arquitetura neuronal.

Em última análise, as relações no revestimento de odor entre as duas populações de neurônios em diferentes níveis de processamento, como o lóbulo da antena e o corpo do cogumelo, podem ser melhor compreendidas usando essas técnicas. Portanto, as principais vantagens desta técnica dos métodos existentes é que nossos eletrodos multicanais são muito pequenos e podem ser usados em combinação, o que significa que podemos gravar simultaneamente em diferentes áreas do cérebro após serem ancorados. Os fios flexíveis permitem uma lembrança estável por várias horas em animais que se comportam.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuropatologia, como entender como os animais recebem, percebem e, finalmente, calculam as fábricas de olf na vida de seu ambiente. Essa técnica de gravação dupla pode fornecer informações sobre o mecanismo subjacente da codificação de odores e redes neuronais em geral. Também pode ser aplicado a outros organismos modelo em invertebrados ou afeto e neurobiologia.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é necessário muito treinamento para identificar os neurônios das abelhas usando apenas pontos de referência morfológicos, como o lobo interno ou o lobo vertical do corpo do cogumelo. Para este protocolo, construa um adaptador de eletrodo para caber em uma placa de interface de eletrodo padrão. Primeiro solde três pedaços curtos de fios isolados em um conector de 18 pinos.

Em seguida, corte um pedaço de placa de acrílico e insira uma ranhura rasa ao longo do lado mais comprido. Em seguida, aparafuse as alças de solda na placa de plexiglass e cole a placa na parte superior do conector. Em seguida, conecte a base às alças usando os três fios curtos.

Em seguida, posicione um capilar de vidro na ranhura da placa de plexiglass. O capilar deve ser capaz de deslizar e ser preso por um parafuso Usando um pino minuciano, estenda o capilar de vidro para fora cerca de cinco milímetros. O capilar e o pino serão usados para apoiar e estabilizar os microfios do eletrodo.

Em seguida, posicione três microfios. Com o auxílio de fita adesiva para melhor acesso, o capilar de vidro pode ser removido com cola agulha de solda de 12 volts. Os fios juntamente com a cera dentária LMP não colam o último terço dos fios.

Agora conecte este conjunto de microfios multicanal ao adaptador de eletrodo. Posicione o capilar de vidro estendido paralelo aos microfios. Prenda este acessório com cera dental ao longo do capilar de vidro sobreposto e do pino minuciano.

Em seguida, apare os fios do eletrodo deixando dois a três centímetros estendendo-se do pino minuciano e dois a três centímetros estendendo-se da extremidade do eletrodo. Em seguida, prenda o capilar no adaptador do eletrodo e use um parafuso para estabilizar tudo no lugar. A 360 graus Celsius.

Solde as extremidades dos fios perpendicularmente às alças. Em seguida, verifique se há um contato elétrico suficientemente forte, verificando se sua impedância é de cerca de 300 quilo-ohms a um quilohertz. Agora conecte os canais do segundo adaptador de eletrodo ao eletrodo mestre e solde os eletrodos de referência e músculo à base dos eletrodos mestre.

Por fim, monte o eletrodo mestre na placa de interface do cabeçote stage. Fixe o segundo eletrodo em um adaptador separado depois de obter as abelhas resfrie um no gelo até que esteja imobilizado. Em seguida, fixe a abelha em um suporte de plexiglass padrão com a cabeça exposta.

Aplique cera dentária aquecida na base dos olhos e na junção entre a cabeça e o tórax, fixando assim a cabeça. Continue usando a cera para imobilizar o olho de fuga das antenas na cápsula da cabeça. Evite aplicar cera no fagel, que precisa apontar para a frente.

O Pro Bois deve estar livre de impactos. Verifique se ele pode se mover. Agora raspe a cápsula da cabeça para melhorar a acessibilidade.

Em seguida, alimente a abelha com todos os 30% de sacarose que ela consumirá. Isso garante uma boa preparação, viabilidade e umidade do tecido. Agora, usando um micro bisturi, corte verticalmente ao longo da borda do olho e horizontalmente acima das bases da antena.

Continue cortando sob o olho da célula O e remova a cutícula solta. As glândulas hipofaríngeas devem ser afastadas, assim como a traqueia. Isso limpará o caminho para inserir o eletrodo.

Comece inserindo o eletrodo de referência, um fio de prata de 35 mícrons. Primeiro, faça um pequeno corte no olho composto ipsilateral. Em seguida, passe o eletrodo por ele.

Em seguida, insira o segundo fio na região de projeção muscular abaixo do olho lateral da célula O. Para posteriormente visualizar as posições dos eletrodos, mergulhe os eletrodos em uma solução de cloreto de potássio 0,5 molar e hidrócito 5% Alexa 4 88 por três minutos. Em seguida, usando micro manipuladores, posicione os dois eletrodos no cérebro.

Oriente-se identificando o lóbulo da antena e o lóbulo vertical do corpo do cogumelo. Aqui, um eletrodo está no trato do lobo da antena lateral com 180 mícrons de profundidade e o outro no trato do lobo da antena medial. Inserido com cerca de 300 mícrons de profundidade.

Complete as colocações dos eletrodos ancorando-os usando dois componentes. O silício cobre todo o espaço acima do cérebro, o que também evita que os tecidos sequem. Em seguida, prossiga com as gravações para extrair a atividade unitária do sinal extracelular gravado.

Use o software de classificação de pico disponível. Use os canais de eletrodos diferenciados. Aplique técnicas de correspondência de modelo simultaneamente em todos os três canais de eletrodo para detectar diferentes combinações de formas de onda que respondem por eventos de pico único.

E, finalmente, controle para separação adequada da unidade. Usando a análise de componentes principais nos eventos de pico único dos três canais de eletrodos diferenciados registrados. Depois de fazer as gravações, remova cuidadosamente o silício e os eletrodos da abelha.

Em seguida, enxágue o cérebro com a solução de toque de abelha e remova as glândulas e a traqueia. Em seguida, usando uma micropipeta, injete no lóbulo da antena, 5% de micro rubi dissolvido em um acetato de potássio molar. Isso fornecerá um rótulo anterógrado para as trilhas do lóbulo.

Daqui em diante, execute todas as etapas na escuridão máxima. Enxágue o cérebro com anilhadores de abelha novamente, três vezes, e deixe o corante incubar por 30 a 45 minutos. Imobilize a abelha resfriando-a na geladeira.

Em seguida, isole o cérebro. Fixe o cérebro em 4% de aldeído em PBS 0,1 molar durante a noite a quatro graus Celsius e com agitação suave. Siga isso com protocolos padrão para desidratação e limpeza Após o preenchimento de neurônios de projeção no lóbulo da antena com traçador de micro rubi, uma visão de projeção desses neurônios foi montada a partir de fatias ortogonais ao longo do eixo Z.

O corante Alexa Hydrocyte 4 88 nos dois eletrodos mostra sua inserção no lobo da antena medial traído e no trato do lobo da antena lateral. Uma reconstrução 3D das células-alvo coradas e dos locais de inserção do eletrodo foi usada para fazer um esquema das trajetórias dos dois lobos da antena, a gravação simultânea dos dois tratos do lobo da antena enquanto estimulava a abelha com diferentes concentrações de odor foi usada para investigar o processamento temporal. A atividade foi avaliada nas etapas subsequentes de processamento.

Os neurônios de projeção do lóbulo da antena e a análise do componente principal dos neurônios extrínsecos dos vetores populacionais ilustram que o odor nos neurônios de projeção foi prolongado e durou mais que o estímulo. Em contraste, na população de neurônios extrínsecos, apenas os tipos odor ligado e odor desligado foram representados. Assim, ao visualizar a atividade com o tempo, a população de neurônios extrínsecos à direita mostra a atividade de separação de odores um pouco antes que a população de neurônios de projeção comece a desenvolver sua atividade induzida por odores.

A estimulação do odor é marcada em cinza. Uma vez dominado, leva cerca de 30 minutos para construir um eletrodo. A preparação da abelha e a inserção dos eletrodos nas regiões-alvo podem ser feitas em mais meia hora se forem realizadas corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada etapa exige muita prática e paciência até que seja dominada. Tenha especial cuidado ao elevar os fios do eletrodo até seus pontos de conexão e gravar a partir do alcance desejado do cérebro. É necessário um conhecimento sólido da anatomia do cérebro das abelhas após seu desenvolvimento.

Essa técnica permitiu que pesquisadores no campo da neuropatologia e do olfato de insetos explorassem as relações temporais precisas entre a atividade de diferentes vias neuronais e centros cerebrais no comportamento das abelhas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir e usar eletrodos de microfios multicanal para gravar simultaneamente de duas regiões do cérebro e abelhas se comportando. Você também deve ser capaz de visualizar a localização exata de seus eletrodos de gravação.