Imagens ao vivo de Drosophila larval Neuroblastos

O objetivo geral deste procedimento é detalhar a dissecção do SNC intacto das larvas do terceiro Instar oph. Com o objetivo de estudar a diferenciação celular e morfogênese de divisões celulares assimétricas. Isso é feito primeiro explantando o SNC do corpo larval por dissecção macroscópica.

O segundo passo é isolar o cérebro intacto dos tecidos periféricos por microdissecção fina usando ferramentas personalizadas. Em seguida, os cérebros saudáveis são montados para imagens de células vivas ou submetidos a fixação química e imunofluorescência, em última análise, a microscopia confocal de disco giratório é usada para mostrar os eventos que governam as divisões de células-tronco neurais e fornecer uma visão mecanicista para o desenvolvimento do SNC. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do câncer de células-tronco e do desenvolvimento neural.

Ao contribuir para nossa compreensão de como a proliferação de células-tronco é regulada, sabemos que a divisão de células-tronco ABER está associada à tumorgênese e microcefalia, e nossos estudos de imagem revelam os mecanismos que regulam essas divisões de células-tronco. A demonstração visual deste método é crítica porque a microdissecção e a montagem do cérebro são difíceis de aprender, pois exigem mãos firmes, paciência e prática. Comece este procedimento colocando duas gotas de mídia de dissecação quente em uma única lâmina de vidro, uma para dissecção macroscópica e outra para dissecção fina.

Em seguida, transfira várias larvas para uma das gotas de mídia. Depois disso, transfira a lâmina de vidro com larvas para um microscópio de dissecação. Agora amplie a gota contendo as larvas de modo que as extremidades anterior e posterior das larvas sejam visíveis.

Segure a região média de uma única larva com um par de pinças e segure outra região ao lado dela com um segundo par de pinças. Em seguida, rasgue as larvas ao meio. Repita os procedimentos para todas as larvas na tampa, deslize e descarte as metades posteriores.

Amplie as larvas para que os ganchos anteriores da boca sejam claramente visíveis. Depois disso, faça uma pequena incisão ou entalhe no lado oposto dos ganchos da boca larval entre a terceira banda torácica e a primeira banda abdominal do CLE. Em seguida, segure os ganchos da boca com a pinça.

Retire suavemente a cutícula na direção anterior para posterior e continue até que o SNC fique exposto. Em seguida, rasgue os tecidos para isolar o SNC do resto das larvas. Tenha cuidado para não danificar o SNC e descarte amostras danificadas com um cordão nervoso ventral rasgado ou lobos ópticos distorcidos.

Repita os procedimentos para todas as larvas na lamínula. Em seguida, transfira o tecido explantado saudável para o outro meio limpo. Coloque a lamínula para dissecção fina.

Use os pinos de dissecação para remover os tecidos periféricos do cérebro. Deslize o bisturi entre o cérebro e o tecido indesejado e prenda o tecido conjuntivo na lâmina de vidro. Use o gancho para remover suavemente o tecido indesejado enquanto pressiona simultaneamente o bisturi na lamínula nos movimentos da gangorra.

Trabalhe lenta e deliberadamente para remover todos os discos de cada cérebro. Tenha cuidado para não perturbar a morfologia do cérebro. Um cérebro saudável terá um cordão nervoso ventral intacto e lobos ópticos redondos simétricos.

Agora inverta uma placa de cultura permeável a gás de 50 milímetros com uma película transparente voltada para cima e deposite uma pequena gota de meio no centro da placa. Em seguida, use um gancho para recolher os cérebros sob os lobos ópticos e transferi-los para a gota de meio no prato, um por um. Colete de cinco a 10 cérebros na queda do meio.

Em seguida, empurre-os para o fundo um por um, pois muitos deles ficarão presos no menisco depois. Oriente os cérebros para permitir que o neuroblasto seja visualizado para visualizar o neuroblasto ventral anterior. Coloque os cérebros com o cordão nervoso ventral voltado para cima, alinhe os cérebros de modo que todos os cordões nervosos ventrais apontem na mesma direção dentro do plano XY.

Use uma seringa ou pipeta de transferência de plástico para colocar quatro gotas de óleo de carbono halo na membrana permeável ao gás. O volume de cada gota de óleo deve ser equivalente entre si e à gota do meio. Depois de concluídos, os cinco drops se parecerão com as cinco facetas dos dados de estilo ocidental.

Em seguida, abaixe uma lamínula no conjunto de forma que ela atinja todas as cinco gotas ao mesmo tempo. Manter uma pressão uniforme nas amostras reduz a probabilidade de que elas sejam interrompidas. Aguarde cerca de três minutos.

À medida que o óleo e o meio se dispersam sob o peso da lamínula, sob um escopo de dissecação. Abaixe ainda mais a lamínula na superfície do cérebro, removendo o excesso de mídia com um pavio de papel de seda até que a lamínula toque, os cérebros não superam o pavio, pois isso causará distorção do tecido ou explosão cerebral para visualizar o neuroblasto ventral anterial. A lamínula deve ser ligeiramente movida na direção das pontas do cordão nervoso ventral.

Isso faz com que o cérebro gire, o que coloca os lobos cerebrais em contato direto com a lamínula para facilitar a imagem, posteriormente selada a câmara por enc. A lamínula com uma pequena quantidade de óleo de carbono halo. O excesso de óleo escorrendo da lamínula deve ser minimizado e enxugado com um lenço de papel.

Antes da imagem. Adicione uma gota de óleo de imersão à lamínula logo acima dos cérebros montados para ajudar a centralizar a objetiva diretamente acima da amostra. Posicione suavemente a amostra montada na incubadora de estágio de 25 graus Celsius e cubra a câmara com sua tampa.

Em seguida, localize o neuroblasto central do cérebro usando luz transmitida, concentrando-se nas grandes células redondas que residem nas áreas central e medial dos lobos ópticos. Uma vez no lugar, faça exposições rápidas usando o confocal para determinar a localização e a profundidade adequadas do neuroblasto. Limite a profundidade aos primeiros 10 a 15 micrômetros.

Ajuste conforme necessário e tire outra imagem de teste. Para eliminar o desvio axial, use um dispositivo de foco automático contínuo que use um LED infravermelho ou corrija manualmente o plano focal. Uma vez identificado um neuroblasto de interesse, otimize todos os parâmetros antes de fazer a imagem.

Agora imagine todo o neuroblasto coletando de 12 a 14 imagens espaçadas por um micrômetro no eixo Z. Ajuste a resolução de tempo para capturar ciclos celulares únicos ou múltiplos do mesmo neuroblasto. Use intervalos de 10 a 32 para imagens de ciclo celular único e intervalos de um a três minutos para ciclos celulares múltiplos.

Em seguida, confirme se a amostra está saudável monitorando a duração da mitose. Se a mitose demorar mais de 15 minutos, passe para outro cérebro. Um cérebro saudável mostrará muitos neuroblastos dentro do mesmo campo de visão, passando por várias rodadas de mitose.

Quando a imagem estiver concluída, desmonte a câmara de incubação e descarte tudo, exceto os pratos de cultura permeáveis ao gás. Enxágue a superfície da placa de cultura com etanol a 95% e limpe o óleo com um lenço de papel. Repita o procedimento mais duas vezes.

Aqui é mostrada a imagem ao vivo das divisões de células-tronco de neuroblastos em preparações de montagem inteira. Estas são as imagens de lapso de tempo de um único ciclo celular de um neuroblasto expressando GFP Mosin para análise celular fina, um único ciclo celular de neuroblasto é visualizado em intervalos de tempo inferiores a 32. E essas são as imagens de lapso de tempo de ciclos sucessivos de divisão celular de um neuroblasto expressando o marcador de centrossomo marcado com GFP e GFP.

Para obter imagens de vários ciclos celulares de neuroblastos. Os cérebros são normalmente fotografados em intervalos de tempo de um a três minutos durante um período de duas a três horas. As projeções confocais de células-tronco fixas de preparações de montagem doméstica são mostradas aqui.

Para obter imagens de todos os neuroblastos localizados em ambos os lobos ópticos, é usada uma ampliação de 20 x. Esta análise é particularmente útil para examinar a morfologia geral do cérebro e quantificar o número de neuroblastos. A maioria dos neuroblastos de um único lobo óptico pode ser visualizada com aumento de 40x.

Para análise celular detalhada de alguns neuroblastos, deve-se usar uma ampliação de 100 x. Este neuroblasto mutante mostra vários centrossomas em cada pólo do fuso. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar danos fotográficos limitando a quantidade de luz que atinge a amostra.

Essa técnica de imagem de divisões de neuroblastos vivos em preparações de montagens inteiras abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de células-tronco explorarem a divisão celular assimétrica no contexto nativo vivo do cérebro de drosófila em desenvolvimento.