Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

O objetivo geral do experimento a seguir é obter gravações extracelulares de unidade única de alta qualidade de neurônios intercorticais em camundongos que expressam o canal rootin dois. Isso é conseguido avançando um eletrodo de gravação de alta impedância através do tecido para identificar neurônios inter de respostas de pico a pulsos de luz azul. O sinal elétrico é monitorado quanto a mudanças que indicam a taxa apropriada de avanço e a probabilidade de obter um registro estável e isolado do poço.

Se um bom isolamento de unidade única não puder ser alcançado ou, inversamente, neurônios responsivos à luz raramente forem encontrados, substitua o eletrodo de registro. Os resultados mostram que a confiabilidade da luz evoca respostas de neurônios opticamente identificados e a relação sinal-ruído típica obtida com essa estratégia. A abordagem de fotoestimulação é uma maneira acessível e barata de atingir tipos de células geneticamente identificadas usando um amplificador extracelular padrão e luz azul.

Esta é a nossa estratégia para proxenetizar neurônios internos específicos no córtex auditivo anestesiado, mas os pontos mais gerais se aplicam a outras áreas corticais do que tipos de células esparsas Para iniciar este procedimento. Depois que o animal tiver sido anestesiado com cetamina meine cocktail via injeção intraperitoneal, coloque-o em um aparelho estereotáxico ou outro aparelho de fixação da cabeça, certifique-se de que o crânio esteja bem preso. Isso é essencial para manter gravações estáveis de uma única célula.

Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento e mantenha a temperatura corporal do animal em 37 graus Celsius para realizar um dreno esternal de IC para estabilidade de registro adicional, remova o tecido da parte posterior do crânio com uma lâmina de bisturi para expor o esterno magna do IC. Em seguida, faça um pequeno corte na Dora com a ponta da lâmina para drenar o líquido cefalorraquidiano. Agora, usando o bisturi, faça uma pequena craniotomia sobre a área cortical de interesse.

Depois disso, remova a dura-máter e cubra o córtex exposto com a camada de aros quente. Mantenha os agros úmidos com solução salina. Prepare um eletrodo de suporte de línguas.

Cole o eletrodo em um tubo capilar de vidro com super cola e acelerador. Em seguida, adicione tubos termorretráteis para aderência. Em seguida, monte o eletrodo em um manipulador micrométrico motorizado ou hidráulico e configure-o para se deslocar ortogonalmente à superfície cortical.

Deslize um fio terra sob a pele contra o crânio. Evite o contato com os músculos da lateral da cabeça e da nuca, pois eles podem gerar artefatos miográficos. O sinal elétrico é amplificado usando um amplificador extracelular adequado para gravação de unidade única, de preferência equipado com um modo de verificação de impedância.

A atividade contínua de pico é monitorada com dois osciloscópios e um conjunto de alto-falantes amplificados. Agora avance o eletrodo através dos agros e teste sua impedância para garantir que esteja dentro de sete a 14 mega ohms. Quando a ponta romper a superfície do córtex, zere essa posição no manipulador microm.

Para estimar melhor a profundidade do registro, confirme visualmente se a ponta do eletrodo sai da superfície cortical a uma profundidade de zero. Ao retirar o eletrodo no final de uma penetração no córtex auditivo para garantir que esse ponto de ajuste zero corresponda ao nível do córtex, monitora os potenciais de campo evocado por estímulo. Enquanto avança o eletrodo através das primeiras centenas de micrômetros de tecido, confirme se a polaridade do potencial de campo local se inverte em torno de uma profundidade de 100 micrômetros.

Em seguida, monte uma fibra óptica acoplada a uma fonte de luz azul em um micromanipulador manual. Regule a saída da fonte de luz com a unidade de controle capaz de fornecer um trem de pulso TTL de largura e duração especificadas. Em seguida, monitore o sinal em ambos os osciloscópios.

Meça a potência total da luz na ponta da fibra óptica usando um medidor de potência. Use esse valor para calcular a irradiância dividindo-a pela área da seção transversal do núcleo da fibra. Comece com o valor na faixa de 10 a 15 miliwatts por milímetro quadrado.

Usando o microscópio, posicione a ponta da fibra o mais próximo possível da superfície do aro. Centralize o feixe onde o eletrodo entrará no tecido. Agora verifique se há artefatos de luz com o eletrodo no aros.

Forneça uma tensão de pulso. Elimine quaisquer artefatos de luz transitória reposicionando a fibra óptica em relação ao eletrodo para alterar o ângulo da luz incidente. Se os artefatos persistirem, tente diminuir a potência da luz.

Em seguida, avance o eletrodo lentamente pelo cérebro a uma taxa de aproximadamente um micrômetro por segundo. Use um osciloscópio para monitorar a atividade contínua do eletrodo. Use o outro para acionar os pulsos de laser.

Ouça o hash fraco dos picos evocados pela luz no monitor de áudio, o que indica que o eletrodo está se aproximando de uma célula positiva de opsina de canal. Em seguida, diminua a taxa de avanço assim que a luz for evocada. Os picos são grandes o suficiente para serem acionados individualmente no osciloscópio.

Comece a fazer isso. Ajuste uma escala no eixo horizontal para observar a forma exata da forma de onda do pico. Neste ponto, pare de avançar o eletrodo e espere que ele se acomode no tecido.

Isso é fundamental para uma gravação estável. Após alguns minutos, se a relação sinal-ruído não melhorar, avance mais cinco micrômetros e aguarde. Novamente, repita esse processo até que o pico ou o vale de um potencial de ação possam ser capturados de forma confiável com um limite de tensão.

Defina bem acima do nível de ruído durante a gravação. Monitore a atividade contínua no primeiro osciloscópio. Ao mesmo tempo, preste atenção ao tamanho e à forma dos picos usando o segundo osciloscópio e observe a qualidade do som no alto-falante.

Ouça atentamente as mudanças abruptas, que indicam que a célula está se aproximando demais do eletrodo ou se afastando. Se os espinhos ficarem grandes e distorcidos, retire o eletrodo. Se eles ficarem menores, avance o eletrodo.

Mova-se lentamente em passos de dois micrômetros para confirmar a qualidade dos picos. Sobreponha toda a forma de onda de pico em uma ampla gama de valores de limite. Apenas uma forma de espigão consistente de altura uniforme deve ser vista.

A maioria das células PV positivas pode sustentar o disparo por um segundo completo. Se o sinal for contaminado com picos de um neurônio vizinho, avançar o eletrodo e procurar uma nova célula em cada penetração, abaixe o eletrodo por toda a profundidade do córtex. Se nenhum neurônio responsivo à luz for encontrado após muitas penetrações ou, inversamente, as gravações forem rotineiramente contaminadas com picos do canal vizinho, células negativas de opsina, tente um novo eletrodo.

Esta figura mostra gravações de exemplo de três tipos de neurônios inter identificados opticamente. As células respondem ao trem de pulso de busca com uma explosão confiável de picos. Aqui são mostrados os picos de linha de 100 tr e a forma de onda interpolada média.

Esses gráficos de lista mostram o tempo consistente de picos evocados de luz. As primeiras latências de pico para uma amostra de energia. Os neurônios inter positivos para volin são apresentados aqui.

A abordagem de fotoestimulação é conceitualmente muito simples, mas pode ser surpreendentemente desafiadora e de baixo rendimento. Na prática. Os eletrodos de vidro são fortemente tendenciosos para os neurônios parametálicos, então você não obtém neurônios internos com muita frequência.

Por outro lado, com os tetros, você obtém muitos neurônios inter responsivos à luz, mas os picos são pequenos e há muitas formas de onda sobrepostas, por isso é muito difícil classificar de forma confiável em unidades únicas. Tentamos fazer isso de muitas maneiras diferentes e, para os neurônios internos, descobrimos que esses eletrodos nítidos de 10 a 14 mega atingiram o equilíbrio certo em termos de raio de escuta, que deve ser grande o suficiente para detectar a luz de picos de carvalho à distância, mas restrito o suficiente para alcançar um bom isolamento de unidade única. Há um pouco de vodu nisso.

Se você não conseguir isso, economizará muito tempo apenas abandonando o eletrodo e passando para o próximo até encontrar um que funcione.