Name: Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a obter gravações de unidade única de interneurônios inibitórios corticais identificados opticamente em camundongos anestesiados usando ChR2. Este método acessível utiliza eletrodos de alta impedância e luz azul para isolar células geneticamente identificadas com alta relação sinal-ruído.

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Este trabalho foi financiado pela Whitehall Foundation e pelo NIH. Agradecemos a Clifford Dax (Administração de Suporte Técnico da Universidade de Oregon) por sua ajuda e experiência no projeto de um circuito para entrega de luz.

NOTA: O seguinte protocolo está de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde como diretrizes aprovados pela Universidade de Oregon Animal Care e do Comitê Use. 1. Cirurgia aguda <ol><li> Anestesiar o animal com um cocktail de cetamina-medetomidina, via intraperitoneal (ip) (Tabela 1). NOTA: Os ratos usados ​​nestas experiências são gerados pelo cruzamento de um ChR2-EYFP line10 transgénico dependente de cre a Interneuron linhas de driver (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Entrega Viral de ChR2 ou opsinas relacionados devem funcionar igualmente bem, assumindo níveis de expressão semelhantes são obtidos. </li><li> Antes de iniciar a cirurgia, garantir que as exposições de animais não resposta a uma pitada toe suave. Re-administração de anestésicos durante todo o experimento como necessário para manter este profundidade da anestesia. Se usar anestésicos injetáveis, opcionalmente implantar um cateter ip para injeções de manutenção. </li><li> Manter o animal hidratado com solução de Ringer com lactato ao longo da experiência (aproximadamente 3 ml / kg / h), por exemplo, utilizando um cocktail de anestésico apropriadamente diluído para injecções de manutenção (Tabela 1) ou solução salina. </li><li> Colocar o animal em um aparelho de cabeça-holding estereotáxica ou outro. Certifique-se que o crânio é bem protegido. Isto é essencial para a manutenção de gravações de célula única estáveis. </li><li> Aplicar pomada opthalamic aos olhos para evitar o ressecamento. Manter a temperatura corporal a 36,5-37 ° C. </li><li> Realize um dreno cisternal para a estabilidade de gravação adicional. Usando uma lâmina de bisturi, remover o tecido a partir da face posterior do crânio para expor a cisterna magna. Faça um pequeno corte na dura para drenar o líquido cefalorraquidiano. Use somente a ponta da lâmina, e evitar entrar em contato com a haste cerebelo ou cérebro. </li><li> Usando o bisturi, realizar uma craniotomia pequena (~ 2 milímetros 2) sobre a área cortical de interesse (por auditivocórtex, cerca de -2,3 mm posterior do bregma, 4.5 mm lateral da linha média). </li><li> Remover a dura-máter e cobrir o córtex exposto, com uma camada de agarose a quente 0,5-1 mm de espessura (1,5% de agarose em solução salina, 0,9% de NaCl; aplicam-se a ~ 37 ° C). Manter a húmido de agarose ao longo da experiência pela aplicação periódica de várias gotas de solução salina. </li></ol> 2. Gravação de Set-up <ol><li> Prepare um eletrodo de tungstênio (14/07 mohms, 127 mm de diâmetro, 12 ° ponta cônica, epóxi-revestido). Supercola o eletrodo a um tubo capilar de vidro e adicione psiquiatra tubulação de calor para grip (Figura 1). </li><li> Monte o eletrodo em um micromanipulator motorizada (ou hidráulica), definida para viajar ortogonal à superfície cortical. Deslize um fio terra sob a pele, contra o crânio. Evitar o contacto com os músculos do lado da cabeça e a parte de trás do pescoço enquanto eles podem gerar artefactos eletromiográficas. </li><li> Amplificar o sinal elétrico usando um amplificador extracelularli er fi adequado para a gravação em uma única unidade, de preferência equipado com um modo de verificação de impedância. Monitorar a atividade spiking em curso (passa-banda 300 - 5000 Hz) com dois osciloscópios e um conjunto de alto-falantes. Aqui, os dados gravados são digitalizados de forma contínua a uma taxa de amostragem de 10 kHz; picos são extraídos off-line. </li><li> Avance o eléctrodo através da agarose até que a ponta atinge a superfície do córtex. Observe este passo através de um microscópio. &quot;Zero&quot; esta posição no micromanipulator. </li><li> Para aproximar melhor a profundidade de gravação, confirmar visualmente que a ponta do eléctrodo sai da superfície cortical, a uma profundidade de zero quando a retirada do eléctrodo na extremidade de uma penetração. NOTA: A discrepância entre a leitura do manipulador e da posição do eletrodo observado indica que ele se afastou em relação ao tecido. Isto pode ser causada pela instabilidade do cérebro ou animal, ou manipulador deriva. <ol><li> Como uma verificação adicional para garantir queeste conjunto de ponto zero corresponde à superfície do córtex, monitorizar potenciais de campo evocadas por estímulo enquanto avança através das primeiras várias centenas de micrómetros de tecido. Ao monitorar potenciais de campo, diminuir o menor corte do filtro passa-banda do amplificador extracelular para 10 Hz. Confirmar que a polaridade do potencial de campo local inverte em torno de uma profundidade de ~ 100 pm, perto da fronteira I / II 13 camada. Este é um ponto de referência confiável para o córtex auditivo, mas pode variar para outras áreas corticais. </li></ol></li><li> Montar uma fibra óptica acoplada a uma fonte de luz azul (Figura 2) para um micromanipulador manual. Utilizando o microscópio, posicionar a ponta da fibra tão perto da superfície da agarose quanto possível. Centrar o feixe em que o eléctrodo vai entrar no tecido. </li><li> Regular a saída da fonte de luz com uma unidade de controle capaz de entregar um TTL (lógica transistor-transistor) trem de pulsos de largura e duratio especificadon- por exemplo, um Arduino (Figura 3), um cartão de computador de I / O (como mostrado), ou um gerador de impulsos disponíveis comercialmente. <ol><li> Monitorar o sinal em ambos os osciloscópios. </li></ol></li><li> Meça a potência total da luz (mW) na ponta da fibra óptica, utilizando um medidor de potência. Use esse valor para calcular a irradiância (mW / mm 2), dividindo pela área da secção transversal do núcleo da fibra. Comece com um valor de intensidade no intervalo de 10 - 15 mW / mm 2 e ajuste para baixo, se necessário, até artefactos são eliminados. </li><li> Verifique a existência de artefatos de luz com o eletrodo na agarose, pronta para entrar no tecido. Comece a busca de trem de pulso (por exemplo, 30 pulsos de luz ms, 500 ms intervalo interstimulus (ISI)). <ol><li> Elimine artefactos de luz transitórios (Figura 4) por reposicionamento da fibra óptica relativa ao eléctrodo para mudar o ângulo da luz incidente. Se artefatos persistir, tente diminuir o poder da luz. Em the caso raro que os artefatos não podem ser completamente eliminados (apenas minimizado), prolongar a duração do pulso de pesquisa. Isto pode ajudar a identificar os verdadeiros pontos neuronais. </li></ol></li></ol> 3. Em linha reta PINP-in &#39; <ol><li> Avance o eléctrodo lentamente através do cérebro, a uma taxa de aproximadamente 1 mm / seg. Use um osciloscópio para monitorar a atividade em curso. Por outro lado, desencadear os pulsos de laser. </li><li> Escutar para o &#39;de hash &quot;fraco de picos de luz evocado no monitor de áudio, o que indica que o eléctrodo está a aproximar de uma célula ChR2 + e pode muitas vezes ser percebido bem antes de o sinal eléctrico é aparente no osciloscópio. Diminuir a taxa de antecedência. NOTA: Se a célula situa-se no caminho do eletrodo, a atividade de luz evocada vai crescer mais (e mais alto). À medida que o eléctrodo se aproxima de uma única interneurónio, vai resolver o hash em pequenos mas bem definidas picos de tamanho e forma uniforme. </li><li> Assim que lispikes evocado-GHT são grandes o suficiente para desencadear de individualmente no osciloscópio, começar a fazer isso. Ajustar a escala no eixo horizontal para observar a forma exacta da forma de onda de pico. </li><li> Pare e espere o tecido para resolver. Resistir à tentação para mover o eléctrodo mais perto da célula. Este passo é crítico para uma leitura estável. Se depois de vários minutos a relação sinal-para-ruído não melhorou - isto é, o tecido tem resolvido, mas não trouxe a célula mais perto da ponta do eléctrodo - 5 um avanço adicional e esperar de novo. <ol><li> Repita esse processo até que o pico ou a calha do potencial de ação pode ser capturada de forma confiável com um limiar de tensão definir bem acima do ruído de fundo (por exemplo, +/- 300 mV ou mais). NOTA: Há pouco risco de resultados falso-positivos ou ambigüidade quando PINPing interneurônios inibitórios. A maioria das células pode facilmente seguir um trem de pulsos com duração de 30 ms e inter-pulintervalo de 500 ms si só, ou mais rápido, com um primeiro pico de latência de confiança de 2-5 mseg (Figura 5). A maioria das células fotovoltaicas +, em particular, pode sustentar a disparar para um total de 1 seg (Figura 6). Porque estes são neurônios inibitórios, disynaptic ativação (indireto) não é uma grande preocupação. </li></ol></li><li> Durante a gravação, monitorar a atividade em curso no primeiro osciloscópio. Mantenha um olhar atento sobre o tamanho ea forma dos picos usando o segundo osciloscópio. Observe a qualidade de seu som no alto-falante. <ol><li> Ouça com atenção para mudanças abruptas, que indicam que a célula é qualquer desenho muito próximo ao eletrodo (onde corre o risco de ser empalado ou danificado), ou está se afastando. Se os picos se tornam grandes e distorcida, voltar para fora; se tornam menores, avançar o eletrodo. Mova-se lentamente em 2 mm etapas. </li><li> Confirme a qualidade da gravação post-hoc sobrepondo todas as formas de onda de pico, alinhados ao pico ou vale. Variar os thres tensãosegurar. Através de uma ampla gama de valores de limiar, não só deve ser sempre uma forma consistente pico de altura uniforme (Figura 5a). </li></ol></li><li> Se em algum momento o sinal torna-se contaminado com pontas de um neurônio vizinho, seguir em frente. Avance lentamente, no off-chance de que o eletrodo vai passar fora do alcance da célula vizinha, mas permanecem na faixa do neurônio alvo. (Isto é geralmente sem sucesso.) </li><li> Mover o eléctrodo através de toda a profundidade do córtex (900 + im) em cada penetração. Se nenhuma luz neurônios responsivos são encontradas depois de muitas penetrações ou, pelo contrário, as gravações são rotineiramente contaminados com picos de células ChR2- vizinhos, tente um novo eletrodo. NOTA: Mesmo dentro de um único lote, a geometria de impedância e ponta de eletrodos individuais podem variar consideravelmente. Ambos os fatores contribuem para a efetiva &quot;Raio escuta&quot; do eletrodo, o que deve ser grande o suficiente para detectar picos de luz evocados while pesquisa, ainda restringido o suficiente para permitir a gravação de um único interneurónio isoladamente. </li><li> Teste a impedância de eléctrodos como desejado. Para evitar danificar o tecido, fazer isso com a ponta do eléctrodo na parte superior da camada de agarose, bem fora do cérebro. Dentro da faixa de 7-14 mohms, a impedância exata não é um preditor certeza de desempenho, ou rendimento, para esta aplicação. Dito isto, é um proxy razoável para o raio de escuta: eletrodos de baixa impedância pegar mais unidades; de alta impedância, menos. </li><li> No fim do experimento, os animais a eutanásia por meio institucional-aprovados, tais como sobredosagem anestésica, ou luxação cervical sob um plano de anestesia profunda. </li></ol>

<ol><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Moore, A. K., Wehr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+inhibitory+interneurons+in+auditory+cortex+are+well-tuned+for+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency.</a> J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).</li>
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<li>Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+circuit+for+spatial+summation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neural circuit for spatial summation in visual cortex.</a> Nature. 490, 226-231 (2012).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
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<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-dependent+temporal+response+properties+in+core+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex.</a> J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).</li>
<li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons%3A+chandelier+versus+basket+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8, 70553(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Embora PINP é conceitualmente simples, ele pode ser um desafio na prática. Um dos principais determinantes do sucesso é a escolha do eletrodo. O raio de audição eléctrica é o parâmetro crítico. Ele deve ser suficientemente grande para detectar picos de luz evocado quando a ponta é ainda a certa distância a partir de uma célula ChR2 +, de modo que se pode ajustar a velocidade de avanço em conformidade. Ao mesmo tempo, deve ser restringido o suficiente para permitir um bom isolamento única unidade. Ou seja, o eletrodo não...

Caracterizar a miríade de tipos de células que compõem o cérebro dos mamíferos tem sido um objetivo central, mas há muito indescritível, da neurofisiologia. Por exemplo, as propriedades e funções de diferentes tipos de células inibitórias no córtex cerebral são tópicos de grande interesse, mas ainda são relativamente desconhecidos. Isso ocorre em parte porque as técnicas convencionais de gravação in vivo cegas são limitadas em sua capacidade de distinguir entre diferentes tipos de células. A largura do pico extracelular pode ser usada para separar neurônios inibitórios positivos para parvalbumina de células piramidais excitatórias, mas esse método está sujeito a erros do tipo I e do tipo II2,3. Alternativamente, os neurônios gravados podem ser preenchidos, recuperados e corados para posteriormente confirmar sua identidade morfológica e molecular, mas este é um processo doloroso e demorado. Recentemente, populações geneticamente identificadas de interneurônios inibitórios tornaram-se acessíveis por meio de imagens de cálcio ou gravações de patches guiadas visualmente. Nessas abordagens, a expressão viral ou transgênica de um repórter de cálcio (como GCaMP) ou proteína fluorescente (como GFP) permite a identificação e caracterização de tipos de células definidos pela expressão do promotor. Essas abordagens usam microscopia de 2 fótons, que requer equipamentos caros, e também são limitadas a camadas corticais superficiais devido às propriedades de dispersão de luz do tecido cerebral. 
Recentemente, Lima e colegas1 desenvolveram uma nova aplicação de optogenética para direcionar registros eletrofisiológicos para tipos neuronais geneticamente identificados in vivo, denominada "PINP" – ou Identificação Assistida por Fotoestimulação de Populações Neuronais. As gravações são realizadas em camundongos que expressam Channelrhodopsin-2 (ChR2) em subpopulações neuronais específicas. Os membros da população são identificados por sua resposta a um breve flash de luz azul. Ao contrário de muitas outras aplicações optogenéticas, o objetivo não é manipular a função do circuito, mas simplesmente identificar neurônios pertencentes a uma classe geneticamente definida, que pode ser caracterizada durante a função cerebral normal. A técnica pode ser implementada com equipamento de registro extracelular padrão e, portanto, pode servir como uma alternativa acessível e barata à imagem de cálcio ou ao patch guiado visualmente. Aqui descrevemos uma abordagem para PINPing tipos específicos de células no córtex auditivo anestesiado, com a expectativa de que os pontos mais gerais possam ser aplicados de forma útil em outras preparações e regiões cerebrais.
No córtex, o PINP é particularmente promissor para investigar as propriedades de resposta in vivo dos interneurônios inibitórios. Os interneurônios GABAérgicos compreendem um subconjunto pequeno e heterogêneo de neurônios corticais4. Recentemente, diferentes subtipos, marcados pela expressão de marcadores moleculares específicos, desempenham diferentes papéis computacionais em circuitos corticais5-9. À medida que as ferramentas genéticas melhoram, pode eventualmente ser possível distinguir morfologicamente e fisiologicamente os tipos separáveis que se enquadram nessas classes amplas. Compartilhamos aqui nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Essa estratégia foi desenvolvida especificamente para atingir células positivas para parvalbumina (PV+), mas descobrimos que também funciona para outros tipos de interneurônios, como interneurônios que expressam somatostatina (SOM+) e expressam calretinina (CR+). Embora o PINP seja conceitualmente simples, pode ser surpreendentemente inflexível na prática. Aprendemos uma série de dicas e truques por tentativa e erro que podem ser úteis para outras pessoas que tentam o método.

<table><tbody><tr><td>Linha ChR2-EYFP</td><td>Colônias Jackson</td><td>12569</td><td></td></tr><tr><td>Linha Pvalb-iCre (PV) Colônias</td><td>Jackson</td><td>8069</td><td></td></tr><tr><td>Linha Sst-iCre (SOM) Colônias</td><td>Jackson</td><td>13044</td><td></td></tr><tr><td>Linha Cr-iCre (CR)</td><td>Colônias Jackson</td><td>10774</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Tipo III-A, Alto EEO</td></tr><tr><td>Micro Point (dural gancho)</td> <td>FST</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>FST</td><td>10003-12 (alça), 10011-00 (lâminas)</td><td></td></tr> <tr><td>Pomada Oftálmica Puralube</td><td>Foster & Manta</td> Homeotérmica Smith <td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparelho Harvard</td><td><a name="RANGE! C11">507220F</A></td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Microelectrodes</td><td>A-M Systems</td><td>577200</td><td>12 M&Omega; Resistência AC, 127 &mu; m de diâmetro, 12&deg; ponta cônica, Tubo de Vidro Capilar Revestido com Epóxi</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>G150TF-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Termo Retrátil</td><td>DigiKey</td><td>A332B-4-ND</td><td></td></tr><tr><td>Acelerador Zapit</td><td>DVA</td><td>SKU ZA/ZAA</td><td>Use com Super Cola padrão.&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplificador AC de Microeletrodo 1800</td><td>AM Systems</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>MP-285 Micromanipulador Motorizado</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscópios Digitais de 4 canais</td><td>Alto-falantes Alimentados</td><td>por TDS2000C</td><td></td>Tektronix</tr><tr><td></td><td></td><td>Modelo Harman JBL&nbsp; Manipulador Manual Duet</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientifica</td><td>LBM-7</td><td></td></tr><tr><td>800 &micro; m Cabo de remendo de fibra óptica</td><td>ThorLabs</td><td>FC/PC BFL37-800</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potência</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D (medidor de energia), S121C (sensor de potência padrão)</td><td></td></tr><tr><td>475 nm Cree XLamp XP-E</td><td>DigiKey</td><td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td><td>A potência e a eficiência do LED estão aumentando continuamente, por isso recomendamos verificar os produtos mais recentes (www.cree.com).</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>DigiKey</td><td>1050-1024-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

um guia para in vivo gravação única unidade de optogenetically identificado cortical inibitória interneurônios

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Um grande desafio em neurofisiologia tem sido a de caracterizar as propriedades de resposta e função dos inúmeros tipos de células inibitória no córtex cerebral. Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção estáveis, bem isoladas gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios identificadas no córtex anestesiado mouse usando um método desenvolvido por Lima e colaboradores um. As gravações são realizadas em ratinhos que expressam channelrodopsina-2 (ChR2) em subpopulações neuronais específicas. Os membros da população são identificados pela sua resposta a um breve flash de luz azul. Esta técnica - chamada de &quot;PINP&quot;, ou Identificação fotoestimulação-assistida de Populações Neuronais - pode ser implementado com equipamento de gravação extracelular padrão. Ela pode servir como uma alternativa barata e acessível a imagiologia de cálcio ou patching visualmente-guiado, com o objectivo de direccionamento gravações extracelulares de células identificadas geneticamente. Here nós fornecemos um conjunto de diretrizes para a otimização do método na prática diária. Nós refinado nossa estratégia especificamente para alvejar as células parvalbumina-positivo (PV +), mas descobriram que ele funciona para outros tipos interneuron, bem como, tais como (CR +) interneurons expressando Calretinin-somatostatina expressando (SOM +) e.

Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção de gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios geneticamente classificados no córtex anestesiado rato, utilizando um método optogenetic desenvolvido por Lima et al. A Tabela 1 detalha o cocktail anestésico sugerido, quetamina-medetomidina-acepromazina (1 ". KMA "). A Figura 1 representa um microeléctrodo de tungsténio, preparado para a gravação. A figura 2 contém um diagrama de ci...

Aqui descrevemos nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Os neurônios que expressam ChR2 são identificados por sua resposta à luz azul. O método usa equipamento de gravação extracelular padrão e serve como uma alternativa barata à imagem de cálcio ou patch guiado visualmente.

Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter gravações extracelulares de unidade única de alta qualidade de neurônios intercorticais em camundongos que expressam o canal rootin dois. Isso é conseguido avançando um eletrodo de gravação de alta impedância através do tecido para identificar neurônios inter de respostas de pico a pulsos de luz azul. O sinal elétrico é monitorado quanto a mudanças que indicam a taxa apropriada de avanço e a probabilidade de obter um registro estável e isolado do poço.Se um bom isolamento de unidade única não puder ser alcançado ou, inversamente, neurônios responsivos à luz raramente forem encontrados, substitua o eletrodo de registro. Os resultados mostram que a confiabilidade da luz evoca respostas de neurônios opticamente identificados e a relação sinal-ruído típica obtida com essa estratégia. A abordagem de fotoestimulação é uma maneira acessível e barata de atingir tipos de células geneticamente identificadas usando um amplificador extracelular padrão e luz azul.Esta é a nossa estratégia para proxenetizar neurônios internos específicos no córtex auditivo anestesiado, mas os pontos mais gerais se aplicam a outras áreas corticais do que tipos de células esparsas Para iniciar este procedimento. Depois que o animal tiver sido anestesiado com cetamina meine cocktail via injeção intraperitoneal, coloque-o em um aparelho estereotáxico ou outro aparelho de fixação da cabeça, certifique-se de que o crânio esteja bem preso. Isso é essencial para manter gravações estáveis de uma única célula.Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento e mantenha a temperatura corporal do animal em 37 graus Celsius para realizar um dreno esternal de IC para estabilidade de registro adicional, remova o tecido da parte posterior do crânio com uma lâmina de bisturi para expor o esterno magna do IC. Em seguida, faça um pequeno corte na Dora com a ponta da lâmina para drenar o líquido cefalorraquidiano. Agora, usando o bisturi, faça uma pequena craniotomia sobre a área cortical de interesse.Depois disso, remova a dura-máter e cubra o córtex exposto com a camada de aros quente. Mantenha os agros úmidos com solução salina. Prepare um eletrodo de suporte de línguas.Cole o eletrodo em um tubo capilar de vidro com super cola e acelerador. Em seguida, adicione tubos termorretráteis para aderência. Em seguida, monte o eletrodo em um manipulador micrométrico motorizado ou hidráulico e configure-o para se deslocar ortogonalmente à superfície cortical.Deslize um fio terra sob a pele contra o crânio. Evite o contato com os músculos da lateral da cabeça e da nuca, pois eles podem gerar artefatos miográficos. O sinal elétrico é amplificado usando um amplificador extracelular adequado para gravação de unidade única, de preferência equipado com um modo de verificação de impedância.A atividade contínua de pico é monitorada com dois osciloscópios e um conjunto de alto-falantes amplificados. Agora avance o eletrodo através dos agros e teste sua impedância para garantir que esteja dentro de sete a 14 mega ohms. Quando a ponta romper a superfície do córtex, zere essa posição no manipulador microm.Para estimar melhor a profundidade do registro, confirme visualmente se a ponta do eletrodo sai da superfície cortical a uma profundidade de zero. Ao retirar o eletrodo no final de uma penetração no córtex auditivo para garantir que esse ponto de ajuste zero corresponda ao nível do córtex, monitora os potenciais de campo evocado por estímulo. Enquanto avança o eletrodo através das primeiras centenas de micrômetros de tecido, confirme se a polaridade do potencial de campo local se inverte em torno de uma profundidade de 100 micrômetros.Em seguida, monte uma fibra óptica acoplada a uma fonte de luz azul em um micromanipulador manual. Regule a saída da fonte de luz com a unidade de controle capaz de fornecer um trem de pulso TTL de largura e duração especificadas. Em seguida, monitore o sinal em ambos os osciloscópios.Meça a potência total da luz na ponta da fibra óptica usando um medidor de potência. Use esse valor para calcular a irradiância dividindo-a pela área da seção transversal do núcleo da fibra. Comece com o valor na faixa de 10 a 15 miliwatts por milímetro quadrado.Usando o microscópio, posicione a ponta da fibra o mais próximo possível da superfície do aro. Centralize o feixe onde o eletrodo entrará no tecido. Agora verifique se há artefatos de luz com o eletrodo no aros.Forneça uma tensão de pulso. Elimine quaisquer artefatos de luz transitória reposicionando a fibra óptica em relação ao eletrodo para alterar o ângulo da luz incidente. Se os artefatos persistirem, tente diminuir a potência da luz.Em seguida, avance o eletrodo lentamente pelo cérebro a uma taxa de aproximadamente um micrômetro por segundo. Use um osciloscópio para monitorar a atividade contínua do eletrodo. Use o outro para acionar os pulsos de laser.Ouça o hash fraco dos picos evocados pela luz no monitor de áudio, o que indica que o eletrodo está se aproximando de uma célula positiva de opsina de canal. Em seguida, diminua a taxa de avanço assim que a luz for evocada. Os picos são grandes o suficiente para serem acionados individualmente no osciloscópio.Comece a fazer isso. Ajuste uma escala no eixo horizontal para observar a forma exata da forma de onda do pico. Neste ponto, pare de avançar o eletrodo e espere que ele se acomode no tecido.Isso é fundamental para uma gravação estável. Após alguns minutos, se a relação sinal-ruído não melhorar, avance mais cinco micrômetros e aguarde. Novamente, repita esse processo até que o pico ou o vale de um potencial de ação possam ser capturados de forma confiável com um limite de tensão.Defina bem acima do nível de ruído durante a gravação. Monitore a atividade contínua no primeiro osciloscópio. Ao mesmo tempo, preste atenção ao tamanho e à forma dos picos usando o segundo osciloscópio e observe a qualidade do som no alto-falante.Ouça atentamente as mudanças abruptas, que indicam que a célula está se aproximando demais do eletrodo ou se afastando. Se os espinhos ficarem grandes e distorcidos, retire o eletrodo. Se eles ficarem menores, avance o eletrodo.Mova-se lentamente em passos de dois micrômetros para confirmar a qualidade dos picos. Sobreponha toda a forma de onda de pico em uma ampla gama de valores de limite. Apenas uma forma de espigão consistente de altura uniforme deve ser vista.A maioria das células PV positivas pode sustentar o disparo por um segundo completo. Se o sinal for contaminado com picos de um neurônio vizinho, avançar o eletrodo e procurar uma nova célula em cada penetração, abaixe o eletrodo por toda a profundidade do córtex. Se nenhum neurônio responsivo à luz for encontrado após muitas penetrações ou, inversamente, as gravações forem rotineiramente contaminadas com picos do canal vizinho, células negativas de opsina, tente um novo eletrodo.Esta figura mostra gravações de exemplo de três tipos de neurônios inter identificados opticamente. As células respondem ao trem de pulso de busca com uma explosão confiável de picos. Aqui são mostrados os picos de linha de 100 tr e a forma de onda interpolada média.Esses gráficos de lista mostram o tempo consistente de picos evocados de luz. As primeiras latências de pico para uma amostra de energia. Os neurônios inter positivos para volin são apresentados aqui.A abordagem de fotoestimulação é conceitualmente muito simples, mas pode ser surpreendentemente desafiadora e de baixo rendimento. Na prática. Os eletrodos de vidro são fortemente tendenciosos para os neurônios parametálicos, então você não obtém neurônios internos com muita frequência.Por outro lado, com os tetros, você obtém muitos neurônios inter responsivos à luz, mas os picos são pequenos e há muitas formas de onda sobrepostas, por isso é muito difícil classificar de forma confiável em unidades únicas. Tentamos fazer isso de muitas maneiras diferentes e, para os neurônios internos, descobrimos que esses eletrodos nítidos de 10 a 14 mega atingiram o equilíbrio certo em termos de raio de escuta, que deve ser grande o suficiente para detectar a luz de picos de carvalho à distância, mas restrito o suficiente para alcançar um bom isolamento de unidade única. Há um pouco de vodu nisso.Se você não conseguir isso, economizará muito tempo apenas abandonando o eletrodo e passando para o próximo até encontrar um que funcione.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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