Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar modelos de astrocitoma geneticamente modificados a partir de tipos de células definidos para caracterização fenotípica in vitro e in vivo. Isso é conseguido através da colheita de células primárias do tipo selvagem de camundongos geneticamente modificados condicionais neonatais não Cree para cultura in vitro. Na segunda etapa, as células primárias são infectadas com um vetor adenoviral que codifica a recombinação Cree para induzir a recombinação genética dos alelos F flox in vitro.

Em seguida, as células recombinadas são cultivadas em série para sua caracterização fenotípica. Em última análise, se as mutações definidas promovem glioagenesia em tipos específicos de células neurais é determinado pela caracterização de fenótipos tumorogênicos relevantes in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder às principais questões neuro-oncológicas, como Quais são as consequências fenotípicas das mutações associadas ao astrocitoma?

As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento pré-clínico de medicamentos para astrocitomas, pois essas células geneticamente definidas podem ser usadas in vitro e in vivo, em camundongos singenéticos imunocompetentes. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de coleta de células e injeção ortotópica são tecnicamente difíceis e requerem uma identificação precisa das estruturas anatômicas. Demonstrando o procedimento estará Ryan Bash, um técnico do meu laboratório Para colher o tecido cerebral.

Comece usando uma tesoura de dissecação esterilizada com etanol para fazer um corte sagital na pele sobre o crânio de um camundongo neonatal sacrificado de um a três dias de idade, geneticamente modificado, da medula espinhal ao nariz. Em seguida, faça um corte no crânio ao longo da sutura sagital, começando pela medula espinhal e estendendo-se além dos bulbos olfatórios. Em seguida, use uma pinça curva para descascar suavemente cada hemisfério do crânio lateralmente para longe do cérebro usando uma micropinça reta.

Em seguida, aperte suavemente a porção dorsal de cada hemisfério cortical, tomando cuidado para evitar o cerebelo e o bulbo olfatório, e coloque o tecido cerebral em uma placa de cultura de tecidos contendo HBSN. Sob um microscópio de dissecação, use dois pares de micropinças para remover suavemente as meninges de cada hemisfério cortical e coloque a placa de cultura de tecidos de volta no gelo para homogeneizar o tecido cerebral. Primeiro, use uma lâmina de barbear limpa para finalmente cortar os hemisférios corticais.

Em seguida, mova a placa para uma capa de cultura de tecidos e transfira os pedaços de tecido para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Enxágue o prato com um mililitro de HBSS gelado e transfira a lavagem para o tubo também. Depois de remover o excesso de HBSS a dois mililitros de temperatura ambiente, viaje com EDTA para o tubo e associe os fragmentos de tecido pipetando para cima e para baixo cerca de 10 vezes com uma pipeta de um mililitro.

Incube a suspensão celular a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Misturando cuidadosamente a solução celular por inversão a cada cinco minutos após a incubação, misture três mililitros de meio completo na suspensão celular para inibir a tripsina pipetando para cima e para baixo 10 vezes, como acabamos de demonstrar. Em seguida, gire para baixo os astrócitos dissociados.

Remova cuidadosamente o snat com uma pipeta de um mililitro e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de 37 graus Celsius. Mídia completa. Em seguida, transfira a suspensão de astrócitos para um frasco de cultura de tecidos com tampa de rosca T 75 e mantenha os astrócitos corticais a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono aproximadamente 16 horas após a colheita.

Lave o balão com quatro mililitros de HBSS a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio completo e mantenha os astrócitos corticais a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Quando a cultura atingir cerca de 95% de confluência, agite a cultura durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, remova o meio contendo as células destacadas e lave a placa com mais quatro mililitros de HBSS de 37 graus Celsius. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio completo fresco e incube as células novamente 24 horas após o enriquecimento da cultura para astrócitos corticais. Refresque a cultura com dois mililitros de mídia completa.

Em seguida, incube as células com um mililitro de meio completo contendo um microlitro de pelo menos uma vez 10 do 10º pfu por mililitro do adenovírus de interesse a 32 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono a cinco. A infecção por Gfab CRE causa uma vantagem proliferativa em astrócitos gfab recombinados, aumentando a pureza dos astrócitos de 59% para mais de 90% após cinco a nove passagens em cultura. Após seis horas, remover o meio que contém o vírus e reincubar a cultura em meio fresco e completo.

Depois que os astrócitos corticais são colhidos a cerca de 90% de confluência e o número de células apropriado é ressuspenso em 5% de metilcelulose gelada. Coloque uma seringa de vidro de 250 microlitros em um dispensador de antígeno de repetição e, em seguida, conecte uma agulha romba de calibre 18 à seringa. Use a agulha de calibre 18 para aspirar os astrócitos corticais para a seringa e remover quaisquer bolhas de ar.

Em seguida, descarte a agulha de calibre 18 e encaixe uma agulha de calibre 27 na seringa. Pressione o botão no dispensador de antígeno até que o fluido seja expelido da nova agulha para implantar os astrócitos. Em seguida, prenda um animal receptor imunocompetente de três a seis meses de idade dentro de uma estrutura estereotáxica e faça uma incisão sobre a sutura sagital de aproximadamente 0,5 centímetros de comprimento entre as orelhas e os olhos.

Localize a interseção das suturas coronal e sagital ou o BRE MA, bem como a interseção do lambdoide nas suturas sagitais ou no Lambda. Depois de se certificar de que o BMA e o lambda estão no mesmo plano horizontal, coloque a seringa e o dispensador de antígeno de repetição na estrutura estereotáxica sobre a cabeça do animal e coloque a ponta da agulha em contato com o bgma. Levante a agulha ligeiramente da superfície do crânio e mova dois milímetros laterais e um milímetro rostral do bgma.

Em seguida, abaixe a agulha cuidadosamente através do crânio até seu destino. Quatro milímetros ventrais do breg MA e ativar o dispensador de antígeno de repetição. Uma vez para injetar cinco microlitros da suspensão celular.

Deixe a agulha no lugar por dois minutos para permitir que a pressão intracraniana se equilibre e, em seguida, retire a agulha lentamente por um período de 30 segundos usando uma troca de algodão para aplicar pressão a qualquer sangramento que possa ocorrer. Por fim, use adesivo de tecido para aproximar as bordas da ferida e fechar a incisão e, em seguida, coloque o animal em uma gaiola limpa e quente para se recuperar. Xenoenxertos de linhagens celulares humanas estabelecidas requerem hospedeiros imunodeficientes e geralmente não recapitulam a histopatologia de astrocitomas humanos.

Por exemplo, os xenoenxertos ortotópicos U 87 MG formam tumores circunscritos que não invadem um cérebro normal. Em contraste, a injeção de astrócitos nulos T RRP nos cérebros de camundongos singênicos imunocompetentes produz tumores que recapitulam as características histológicas de suas contrapartes humanas, particularmente a invasão do tecido cerebral normal. Para monitorar o crescimento do aloenxerto nulo TRP, os camundongos foram sacrificados a cada cinco dias após a injeção celular, e a carga tumoral foi determinada quantificando a área tumoral nas seções cerebrais coradas com h e e.

A área do tumor foi determinada a aumentar exponencialmente ao longo do tempo, e a injeção ortotópica de um vezes 10 elevado ao quinto dos astrócitos TP nll nos cérebros receptores levou à morbidade neurológica. Com uma sobrevida média de 22 dias. A imagem longitudinal in vivo tem sido usada para definir a cinética de crescimento tumoral.

Portanto, neste experimento, astrócitos penais TR e projetados para expressar luciferase foram injetados nos cérebros de singênicos imunocompetentes. Os companheiros de ninhada e o crescimento do tumor foram determinados por imagens seriadas de bioluminescência. Um aumento de 15 vezes na bioluminescência foi observado em um período de 16 dias.

Após este procedimento, o teste de drogas pode ser realizado in vitro e in vivo para determinar a eficácia e testar novas combinações de drogas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colher astrócitos corticais de camundongos geneticamente modificados condicionais que não expressam crea, como induzir a recombinação genética in vitro e como modelar a tumorgênese usando aloenxertos ortotópicos em camundongos imunocompetentes.