Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é dissecar discos imaginários de larvas de drosófila Para imuno-histoquímica, isso é feito removendo primeiro o complexo da cabeça que consiste em boca, ganchos, olhos e discos tenais e cérebro das larvas. O segundo passo é fixar o complexo da cabeça e incubá-lo com anticorpos primários e secundários. Em seguida, o olho e os discos tenais são separados do complexo da cabeça.

A etapa final é montar os discos imaginais em agente anti-branqueamento em uma lâmina de vidro. Em última análise, repórteres fluorescentes ou LAC Z e coloração de anticorpos podem revelar a expressão espacial e temporal de genes e proteínas dentro dos tecidos imaginais usando microscopia de fluorescência. Embora esta técnica possa ser usada para fornecer informações sobre a localização de genes e proteínas no disco imaginal.

Também pode ser aplicado a outros tecidos imaginários, como a perna da asa e a parada. Aqui. Para iniciar o experimento, encha uma placa de Petri de 35 milímetros com tampão de dissecação. Coloque de 10 a 20 larvas na placa de Petri e deixe-as nadar por cinco minutos.

Para se autolimpar com uma praga, sua pipeta cria um grande conjunto de tampão de dissecação no meio de uma placa de dissecação à base de silício. Coloque três poças menores ao redor da poça grande e use uma pinça para transferir as larvas para a poça inferior. Em seguida, usando uma pinça número cinco, transfira uma única larva limpa da pequena piscina para a maior piscina de tampão de dissecação.

Para iniciar a dissecção grosseira, use um par de pinças para agarrar os ganchos da boca e o outro par de pinças para agarrar as larvas suavemente. Em um terço do comprimento do corpo, mantendo o gancho da boca firme. Puxe rapidamente o resto do corpo com um segundo par de pinças.

Solte a larva da pinça e permita que as entranhas se espalhem, permitindo que os discos imaginários permaneçam em sua confirmação normal. Em seguida, segure os ganchos da boca e use o outro par de pinças para remover os dois terços inferiores das larvas, incluindo as entranhas internas. Em seguida, remova suavemente as glândulas salivares, discos das pernas e outros tecidos.

Os únicos tecidos que devem permanecer são uma pequena quantidade de cutícula sobreposta. Os ganchos da boca, os discos oculares e tenais, os hemisférios cerebrais e o gânglio ventral. Após um máximo de 20 minutos, transferir todos os tecidos dissecados para o aldeído paraforme lisina pária.

Fixador de data ou PLP. Não permita que os discos imaginários permaneçam no tampão de dissecção por mais de 20 minutos, ou eles se degradarão após a dissecção. Transfira os tecidos dissecados em incrementos de 100 microlitros para um vidro de relógio contendo PLP frio.

Use uma pinça para garantir que os tecidos dissecados estejam completamente submersos. Incubar os tecidos dissecados em fixador PLP frio por 45 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, transfira 100 microlitros de tecidos dissecados do PLP para o tampão de lavagem.

Certifique-se de que os tecidos estejam completamente submersos e incuba-os em temperatura ambiente sem agitação por 45 minutos. Em seguida, transfira os tecidos dissecados para um tubo de microfuga de 1,5 mililitro. Remova o tampão de lavagem e substitua-o por 100 microlitros de solução de bloqueio.

Incube os tecidos à temperatura ambiente com rotação suave em um rotador de mesa por 10 minutos. Após o bloqueio, remova a solução e substitua-a por 100 microlitros de solução de anticorpo primário em soro de cabra 10%Normal. Incubar os tecidos à temperatura ambiente com rotação suave durante 16 horas, dependendo da força do anticorpo.

Em seguida, remova o anticorpo primário e substitua-o por 750 microlitros de tampão de lavagem. Coloque o tubo em um mutador em temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o tubo do mutador e deixe as cabeças assentarem no fundo do tubo.

Em seguida, remova o tampão de lavagem e adicione 100 microlitros de solução de anticorpos secundários em 10% de soro normal. Incube o tubo à temperatura ambiente com rotação suave por pelo menos duas horas, dependendo da força do anticorpo. Após a incubação, remova a solução de anticorpo secundário do tecido.

Substitua-o por 500 microlitros de tampão de lavagem e deixe o tecido assentar no fundo do tubo. Coloque três poças de tampão de lavagem em uma placa de dissecação de silicone. Transfira todos os tecidos dissecados para a grande poça de tampão de lavagem que foi colocada no prato de dissecação.

Isso ajuda a remover o excesso de anticorpos secundários para iniciar a dissecção fina, colocar o lado ventral complexo da cabeça para baixo e apertar a cutícula pelos ganchos da boca. Coloque um segundo par de pinças no espaço entre o cérebro e os discos oculares e puxe rapidamente o cérebro para longe dos ganchos da boca para remover os dois lobos do cérebro enquanto continua a segurar os ganchos da boca. Aperte o tecido o mais próximo possível da conexão entre a seção da antena do disco da antena do olho e o gancho da boca.

Continue até que todo o tecido desejado tenha sido dissecado. Em seguida, adicione dois pequenos pedaços de papel de seda do tamanho de lamínulas com três polegadas de distância no prato de dissecação. Coloque uma lâmina de vidro nesses pedaços de papel para evitar que a lâmina grude na base de silicone do prato de dissecação.

Usando uma pipeta P 20, adicione nove microlitros de agente anti-branqueamento ao meio da lâmina do microscópio de vidro para evitar o branqueamento por luz fluorescente do tecido com a mesma ponta não cortada, reúna todos os discos I e tenal e adicione-os à gota de reagente anti-branqueamento. Em seguida, use uma pinça para separar e espalhar os discos oculares e tenais dentro da gota do reagente anti-branqueamento até que nenhum disco imaginário esteja se tocando. Usando um pincel fino, abaixe suavemente uma lamínula sobre a gota do agente anti-branqueamento para evitar a formação de bolhas de ar.

Finalmente, armazene as lâminas a 20 graus Celsius negativos até que estejam prontas para visualizar e visualizar os discos iônicos usando microscopia de luz ou fluorescência. Este método produz de forma confiável material de alta qualidade para análise, conforme transmitido por essas imagens confocais de discos imaginais. Os discos foram tratados com um fórum e um flúor quatro conjugado, que se liga à factina e, portanto, delineia cada célula.

Uma das características mais marcantes do disco ental é o sulco morfogenético, que pode ser visto como um recuo dentro do tecido que corre ao longo do eixo ventral dorsal. À medida que o sulco progride pelo campo ocular, o mar de células desordenadas é transformado em uma matriz ordenada de olhos unitários periodicamente espaçados ou Oma Tedia. A verificação da expressão clonal e a análise do disco imaginal I são possíveis aplicações a jusante deste método.

Os três painéis superiores exibem discos que foram corados com diferentes anticorpos, como ilis, A DPP, LAC Z transcriptional repórter e marcadores específicos de células, como visão embrionária, letal, anormal ou vy, que codifica uma proteína de ligação ao RNA pan-neuronal. Os três painéis inferiores mostram discos nos quais o GFP é usado para marcar populações de células. Uma vez dominado o curso, o isolamento dos complexos da cabeça de 10 a 20 larvas levará aproximadamente 10 minutos e, além disso, o isolamento fino do disco tenal iônico desses complexos também levará cerca de 10 minutos.