3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar como rastrear organelas em movimento rápido, como lisossomos, movendo-se em 3D dentro de uma célula viva. Isso é feito primeiro colorindo os lisossomos e os microtúbulos usando corantes comerciais específicos dentro de células vivas cultivadas. O segundo passo é usar um microscópio de varredura a laser e empregar o método de rastreamento orbital para seguir o movimento do lisossomo em alta velocidade, o tamanho da órbita e outros parâmetros, como a resposta de frequência do sistema, são então selecionados para realizar experimentos de rastreamento.

Em última análise, os resultados mostram que é possível seguir lisossomos em movimento rápido em três dimensões e detectar interações com outras organelas coradas com fluorescência encontradas ao longo da órbita do laser durante o rastreamento. As principais vantagens do método de rastreamento 3D sobre outros métodos existentes, que são baseados, por exemplo, em Astigmatídeos, é que o método de rastreamento 3D de withal nos permite rastrear uma gama muito grande da demência. Este método pode ajudar a fazer uma pergunta-chave no campo do transporte vesicular, como a forma como as vesículas se movem ao longo dos microtubos.

Embora este método possa ser usado para estudar a dinâmica endossômica. Também pode ser empregado em outros sistemas onde é possível rotular fluorescentemente partículas isoladas, como receptores de membrana de nanopartículas go, complexos de portas nucleares agregadas ou loci genéticos, células de ovário de hamster chinês mantidas ou células CH K one, conforme descrito no protocolo de texto. Após a colheita das células, coloque-as em um diâmetro de 14 milímetros.

Micro poço com uma espessura de superfície de 0,16 milímetros de células de sementes para densidade ideal para imagens de cerca de 60 a 70% de fluência de Co incubar células durante a noite a 37 graus Celsius 5%CO2 no dia seguinte, lavar as células três vezes em solução salina tamponada de Hank ou H-B-S-S-H-B-S-S é usado para remover células mortas ou detritos da placa de cultura e preparar as células para a etapa de coloração. Em seguida, incubar as células em uma solução HBSS contendo uma concentração final de 50 anos molar lyo tracker e 150 anos molar de tubulina tracker verde por uma hora a 37 graus Celsius após a incubação. Lave as células três vezes em HBSS para remover qualquer corante não ligado.

Adicione meio de crescimento DMEM fresco antes de obter imagens das células. O microscópio para o rastreamento de partículas descrito no protocolo de vídeo é montado na estrutura de um microscópio invertido disponível comercialmente. Uma fonte de luz de excitação a laser de femtossegundo de safira de titânio camaleão coerente ultra dois é usada com uma faixa de comprimento de onda de saída ajustável entre 690 nanômetros e 1040 nanômetros.

Certifique-se de que o feixe de laser esteja alinhado na porta traseira do microscópio. Usando espelhos revestidos de infravermelho, o feixe de laser é atenuado usando uma placa rotativa de meia onda colocada na frente de um polarizador de calcita, atenue o feixe de modo que a potência média na amostra esteja entre 0,5 e dois miliwatts. Colete a luz de fluorescência da amostra colocando uma objetiva de água de alta abertura numérica no caminho da luz.

Em seguida, coloque a amostra em uma platina motorizada e ajuste o movimento fino da objetiva do microscópio. Usando um controlador pizo objetivo. Escolha um cubo de filtro de fluorescência de acordo com os comprimentos de onda de emissão desejados em uma configuração de um ou dois canais.

Empregue filtros de banda de emissão passada. Para selecionar ainda mais a faixa espectral da fluorescência emitida, direcione a luz do cubo do filtro para tubos fotomultiplicadores onde o sinal é amplificado e discriminado e enviado para um cartão de aquisição de dados de entrada e saída digital para obter imagens das células, posicioná-las no palco e focar usando iluminação de luz transmitida. Mude para imagens de varredura raster para identificar as células que incorporaram o corante e, para visualizar os microtúbulos subjacentes, identifique a área inicial onde o movimento da vesícula está presente.

Assim que uma vesícula isolada for identificada, defina os parâmetros para o rastreamento orbital. Primeiro, selecione o raio da órbita para definir o tamanho da varredura circular de acordo com o tamanho da partícula que está sendo rastreada. Para um emissor de ponto, defina o raio da órbita igual à cintura da função de propagação de ponto ou PSF do feixe de excitação.

Para maximizar a sensibilidade e a resposta. Defina a distância axial para definir a distância entre as duas órbitas que são executadas para localizar a posição da partícula ao longo da direção axial. Defina a distância axial para 1,5 a três vezes o desperdício de PSF.

Defina o tempo de permanência de acordo com o brilho da partícula, para definir o tempo gasto em cada ponto da órbita, o que também determinará a taxa de branqueamento da foto. Use um tempo de permanência entre 10 e 100 microssegundos. Defina o número de pontos em cada órbita para 64 ou 128 para produzir períodos de órbita na ordem de quatro a 32 milissegundos e fornecer uma alta resolução temporal para determinar a posição da partícula.

Altere o sinal de deslocamento CC enviado aos espelhos para centralizar o feixe na partícula por meio da interface gráfica do usuário por meio de uma seleção de cursor na imagem digitalizada raster. Comece o rastreamento alternando o modo de microscópio de imagem raster para varredura orbital. Ative o feedback e a coleta de dados para análise de trajetória.

Use o software para exibir a fluorescência coletada em cada ponto ao longo da órbita e em cada ponto de tempo na forma de um tapete de intensidade. A intensidade coletada ao longo do tapete fornece informações sobre a interação da partícula com outros objetos brilhantes. Exiba as informações da trajetória e a intensidade de fluorescência coletada do tubo fotomultiplicador ao longo do tempo na forma de séries temporais.

Use a representação da série temporal e as informações do tapete de intensidade para selecionar apenas uma região de interesse na trajetória. Em seguida, exiba uma projeção 2D da parte selecionada da trajetória da partícula. Selecione os controles apropriados para codificar a trajetória por cores de acordo com a intensidade de fluorescência da partícula.

Selecione a opção para exibir a trajetória da partícula em 3D e codifique-a por cores de acordo com a intensidade da fluorescência. Gire a trajetória em 3D usando os controles para visualizar as características do movimento do lisossomo ao longo do microtúbulo. Usando uma coloração de corante verde fluorescente dos lisossomos e dos microtúbulos, é possível obter imagens do movimento de alta velocidade das vesículas ao longo do microtúbulo com um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

No entanto, a imagem de varredura raster não tem a resolução temporal necessária para seguir com precisão o movimento dos endossomos mais rápidos se o rastreamento orbital for usado. Em vez disso, os dados mostram que é possível obter trajetórias de deslocamento x, y, Z com uma resolução temporal de 32 milissegundos. Nessas trajetórias de deslocamento versus tempo, a análise do tapete exibe a intensidade registrada ao longo de cada órbita.

Com o tempo, a trajetória de intensidade fornece informações sobre os arredores fluorescentes da partícula. A região encaixotada corresponde à parte da trajetória entre dois saltos. Os pontos brilhantes fora da região encaixotada correspondem às interações da partícula com outros objetos brilhantes e estão associados a saltos na trajetória à medida que as órbitas se recentram na fonte fluorescente mais brilhante.

Durante o rastreamento, a intensidade integrada da fluorescência emitida pode ser registrada. A trajetória 3D reconstruída exibe um movimento direcionado, como pode ser esperado de uma vesícula que se move na rede de microtúbulos. Além disso, é possível correlacionar a trajetória 3D a um RAs ou digitalizar a imagem da região circundante.

Isso confirma o movimento da partícula ao longo da direção de um feixe de microtúbulos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas se for executada corretamente durante a tentativa. Este procedimento é importante lembrar de usar o nível de potência do laser que não seja prejudicial para sua amostra ao usar a citação fotônica, conforme ilustrado neste protocolo, os níveis de potência de cerca de dois milivolts após as objetivas devem ser mantidos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar um experimento usando o método de rastreamento orbital 3D, que permite rastrear objetos de uma faixa Z muito grande.