Name: 3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a rastrear lisossomos em 3D em células vivas usando microscopia de dois fótons modificada com método de rastreamento orbital. Esta técnica permite observar dinâmica de organelas e interações vesiculares em alta velocidade.

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Este projeto foi apoiado por bolsas NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 e P50-GM076516

Preparação 1 Amostra <ol><li> Manter células CHOK1 em frascos de cultura de tecidos, utilizando meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 UI / ml de penicilina de 50 ug / ml de estreptomicina. Incubar as células em uma incubadora humidificada 5% CO 2 a 37 ° C. </li><li> Colheita e, em seguida, as células CHOK1 prato sobre um diâmetro de micro-reservatório 14 mm, com uma espessura de superfície de 0,16 mm. Células de sementeira para a densidade óptima para a imagiologia, cerca de 60-70% de confluência. </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2. Lavam-se as células três vezes em HBSS (Solução Salina Tamponada de Hank), e incubar as células numa solução que contém 50 nM de Lyso Tracker DND26 verde e 150 nM de verde tubulina rastreador. Incubar as células durante 1 hora a 37 ° C. Passo opcional: Antes da incubação, realizar uma mancha adicional coloração com um corante de matriz mitocondrial (25 nM). </li><li> Lavam-se as células três vezes em HBSS para remover qualquer corante não ligado. Adicionar meio de crescimento DMEM fresco antes de imagção das células. </li></ol> 2. Microscópio Configurações O microscópio para o rastreamento de partículas descrito no protocolo de vídeo está montado na armação de um microscópio invertido comercialmente disponível (Figura 4). No entanto módulos comerciais para 3D rastreamento de partículas orbital já estão disponíveis. <ol><li> Use a Ti Coherent Chameleon-Ultra II: fonte de luz laser de excitação femtosegundo Sa, com um comprimento de onda de saída ajustável entre 690 nm-1040 nm. </li><li> Certifique-se de que o feixe de laser é alinhado na porta traseira do microscópio usando espelhos revestidos por IR. O feixe de laser é atenuado usando uma placa de meia onda rotativa seguida por um polarizador linear calcite. Atenuar o feixe de modo a que a potência média da amostra está entre 0,5 e 2 mW. NOTA: O feixe de laser é reflectido por um par de espelhos accionados galvanómetro-motores que permitem o controlo da posição e da trajectória do feixe focado no plano da amostra. Numaconfiguração típica do feixe laser colimado de sair dos espelhos galvanométricos ampliada (10x), que passa através de um expansor de feixe, antes de entrar na parte de trás da objectiva de microscópio, após reflexão no espelho dicróico de curta passagem. </li><li> Recolha a luz de fluorescência da amostra através da colocação de um objectivo água abertura numérica elevada (60X, NA 1.2) no caminho da luz. Escolher um cubo de filtro de fluorescência de acordo com os comprimentos de onda de emissão desejadas em uma ou duas configurações de canal. Empregam filtros de banda de emissão para seleccionar ainda mais a gama espectral da fluorescência emitida. </li><li> Colocar a amostra para um palco motorizado, e ajustar o movimento fino da objetiva do microscópio usando um piezo-controlador objetivo. </li><li> Dirigir a luz a partir do cubo de filtro em tubos fotomultiplicadores, onde o sinal é discriminados e enviadas para um I / O cartão de aquisição de dados digital. NOTA: Os utilizadores são formas de onda da saída analógica da placa de I / O e são provided para os scanners sistema eletrônico. A entrada de contagem de fótons dos fotomultiplicadores e do sinal de saída para os scanners são medidos e controlados através do cartão de I / O por do Laboratório de Fluorescência software Dynamics SimFCS. </li></ol> 3 Imagens <ol><li> Posicione as células no palco e se concentrar utilizando transmitida iluminação de luz. </li><li> Mudar para a imagem raster varredura para identificar as células que incorporaram o corante e visualizar os microtúbulos subjacentes. Identificar a área inicial onde o movimento vesícula está presente. </li><li> Uma vez que uma vesícula isolada é identificado, definir os seguintes parâmetros para o rastreamento orbital: <ol><li> Seleccione o raio da órbita para definir o tamanho da varredura circular de acordo com o tamanho da partícula a ser rastreado. Para um ponto emissor, definir o raio da órbita igual à cintura da Função propagação ponto (PSF) do feixe de excitação para maximizar a sensibilidade e de resposta. </li><li> Defina o axialdistanciar para definir a distância entre as duas órbitas que são realizados para localizar a posição de partículas ao longo da direcção axial. Defina a distância axial de 1,5-3 vezes a cintura PSF. </li><li> Define o tempo de permanência de acordo com o brilho das partículas para definir o tempo gasto em cada ponto da órbita, que também irá determinar a taxa de branqueamento foto-. Use o tempo de espera entre 10-100 ms. </li><li> Defina o número de pontos em cada órbita a 64 ou 128 para produzir períodos de órbita na ordem de 4-32 ms e fornecer uma alta resolução temporal para determinar a posição da partícula. </li></ol></li><li> Alterar o DC offset sinal enviado para os espelhos, a fim de centralizar o feixe sobre a partícula através da interface gráfica do usuário através de uma seleção cursor na imagem digitalizada-raster. </li><li> Começar a acompanhar desligando o modo de microscópio de varredura de geração de imagens para digitalização orbital. </li><li> Ative a coleta feedback e dados. </li></ol> 4. TrajectAnálise ory <ol><li> Usar o software para exibir a fluorescência recolhidos em cada ponto ao longo da órbita e, em cada ponto de tempo sob a forma de um «tapete intensidade &#39;. A intensidade coletadas ao longo do tapete fornece informações sobre a interação da partícula com outros objetos brilhantes. Usar o software para mostrar tanto a informação percurso (isto é, o deslocamento de DC ao longo do tempo de x, y e digitalizadores do -piezo z), bem como a intensidade de fluorescência recolhido a partir do tubo de fotomultiplicador ao longo do tempo sob a forma de séries de tempo. </li><li> Use a representação de séries temporais e as informações &#39;intensidade tapete &quot;para selecionar apenas uma região de interesse na trajetória. </li><li> Use o software para exibir uma projeção 2D da parte selecionada da trajetória da partícula. Selecione os controles apropriados para cor-código a trajetória de acordo com a intensidade de fluorescência de partículas. </li><li> Selecione a opção para exibir o partigo trajetória em 3D, e cor code-lo de acordo com a intensidade de fluorescência. Gire a trajetória em 3D usando os controles para visualizar as características do movimento lisossomo ao longo do microtúbulo. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Apesar dos avanços enormes de técnicas de microscopia de fluorescência e instrumentações, nos últimos anos, alcançando trajetórias de partículas fluorescentes em três dimensões com uma resolução temporal alta manteve-se um desafio no campo. Se alta resolução temporal foi alcançado partículas de rastreio em duas dimensões, a extensão no sentido axial tipicamente traz uma drástica redução na resposta de frequência do sistema 10. Neste protocolo de vídeo, focada na aplicação demonstr...

Um grande número de abordagens têm sido desenvolvidas até agora para controlar partículas fluorescentes em três dimensões utilizando um microscópio. A maioria das abordagens se baseiam na utilização de câmeras rápidas, ideal para acompanhar em duas dimensões, normalmente combinados com modificações personalizadas da óptica de emissão do microscópio para alcançar rastreamento na direção axial. Microscópios de varredura a laser (ou confocal ou dois fótons) convencionalmente pode acompanhar uma partícula fluorescente através da realização de uma seqüência de tempo de z-stacks, embora este processo é normalmente demorado, e produz resolução de tempo razoável (10 Hz) somente se a partícula ser rastreado é mantida no centro de uma pequena região de imagem raster por um mecanismo de feedback activo 2. A ideia de bloqueio em que a partícula é a base do método de controle orbital. Em vez de um raster digitalizar uma órbita circular é realizada em torno da partícula fluorescente. A intensidade da fluorescência ao longoa órbita localiza com precisão a posição de partícula 4. A posição localizada da partícula pode então ser utilizado para accionar os scanners de microscópio e centro-re a órbita na posição de partícula. Os scanners galvanométricos do microscópio são accionados por uma tensão analógica. O componente AC desta voltagem permite realizar uma órbita com o feixe de laser focado, ou seja, um seno e co-seno de onda aplicada aos X e Y digitalização espelhos irá permitir a realização de uma órbita circular. O desvio do sinal de corrente contínua facilita a mudança de posição do centro da órbita. Depois de um período de órbita, é determinada e a forma de onda para o sinal de corrente alternada está configurada, o sistema de realimentação tem de actualizar apenas o componente DC do sinal. Um software capaz de ler o sinal de fluorescência recolhido dos detectores é necessário para controlar os leitores e detectores, para calcular a posição da partícula e actualizar o CC foradefinido. Para uma reacção de sucesso imagens de uma cuidadosa escolha dos parâmetros da órbita (tamanho e de sincronização) é necessária e estes parâmetros têm de ser ajustadas com base nas características das partículas fluorescentes que é necessário para controlar. Os fundamentos físicos e matemáticos da técnica foram descritos no passado de 4,5 para ambas as aplicações de 2D e 3D. Neste protocolo, descrevemos resumidamente os principais componentes da configuração de hardware, e em mais detalhe a escolha dos parâmetros e a preparação da amostra necessária para uma experiência típica, permitindo-nos a seguir o deslocamento de um lisossoma em alta resolução temporal dentro de uma célula viva.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Rastreador de tubulina Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcite Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Espelho de motor galvanômetro</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Estágio motorizado</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>Tubo fotomultiplicador PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Cartão de aquisição de dados</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>LFD</td><td>Global para imagens-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d orbital rastreamento em um microscópio de dois fotões modificação: uma aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

O objetivo deste protocolo de vídeo é discutir como executar e analisar uma fluorescente orbital experimento de rastreamento de partículas tridimensional usando uma versão modificada do microscópio de dois fótons 1. Ao contrário de abordagens convencionais (digitalização raster ou campo grande baseado em uma pilha de quadros), o monitoramento orbital 3D permite localizar e seguir com uma alta espacial (precisão nm 10) e resolução temporal (frequência de resposta de 50 Hz) o deslocamento 3D uma partícula fluorescente passar comprimento escalas de centenas de microns 2. O método baseia-se num algoritmo de realimentação que controla o hardware de um de dois fotões microscópio de varrimento laser, a fim de realizar uma órbita circular em torno do objecto a ser rastreado: o mecanismo de realimentação vai manter o objecto fluorescente no centro através do controlo da deslocação da o feixe de varrimento 3-5. Para demonstrar as vantagens desta técnica, seguimos uma organela em movimento rápido, o lisossoma, dentro de alcélula iving 6,7. As células foram semeadas de acordo com protocolos convencionais, e corados com um corante comercialmente lisossoma. Discutimos brevemente a configuração de hardware e de forma mais detalhada o software de controle, para realizar um experimento de monitoramento orbital 3D dentro de células vivas. Discutimos detalhadamente os parâmetros necessários, a fim de controlar o microscópio de varredura e permitir o movimento do feixe em uma órbita fechada em torno da partícula. Conclui-se, demonstrando como esse método pode ser efetivamente usado para rastrear o movimento rápido de um lisossoma marcado ao longo dos microtúbulos em 3D dentro de uma célula viva. Lisossomas podem mover-se com velocidades na gama de 0,4-0,5 um / seg, exibindo tipicamente um movimento dirigido ao longo da rede de microtúbulos 8.

De acordo com este protocolo de rastreio rápido 3D única partícula pode ser realizada dentro de células vivas utilizando um microscópio de dois fotões modificado para controlar o deslocamento de lisossomos marcados com fluorescência. O experimento realizado consiste em acompanhamento de um lisossoma isolado em movimento no interior da célula após o processo de maturação endosome 9. Os lisossomos foram coradas utilizando um corante fluorescente verde e animado em 930 nm exploram dois fótons de excitação. Os no...

Neste protocolo de vídeo, rastreamos - em alta velocidade e em três dimensões - lisossomos marcados com fluorescência dentro de células vivas, usando o método de rastreamento orbital em um microscópio modificado de dois fótons.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar como rastrear organelas em movimento rápido, como lisossomos, movendo-se em 3D dentro de uma célula viva. Isso é feito primeiro colorindo os lisossomos e os microtúbulos usando corantes comerciais específicos dentro de células vivas cultivadas. O segundo passo é usar um microscópio de varredura a laser e empregar o método de rastreamento orbital para seguir o movimento do lisossomo em alta velocidade, o tamanho da órbita e outros parâmetros, como a resposta de frequência do sistema, são então selecionados para realizar experimentos de rastreamento.Em última análise, os resultados mostram que é possível seguir lisossomos em movimento rápido em três dimensões e detectar interações com outras organelas coradas com fluorescência encontradas ao longo da órbita do laser durante o rastreamento. As principais vantagens do método de rastreamento 3D sobre outros métodos existentes, que são baseados, por exemplo, em Astigmatídeos, é que o método de rastreamento 3D de withal nos permite rastrear uma gama muito grande da demência. Este método pode ajudar a fazer uma pergunta-chave no campo do transporte vesicular, como a forma como as vesículas se movem ao longo dos microtubos.Embora este método possa ser usado para estudar a dinâmica endossômica. Também pode ser empregado em outros sistemas onde é possível rotular fluorescentemente partículas isoladas, como receptores de membrana de nanopartículas go, complexos de portas nucleares agregadas ou loci genéticos, células de ovário de hamster chinês mantidas ou células CH K one, conforme descrito no protocolo de texto. Após a colheita das células, coloque-as em um diâmetro de 14 milímetros.Micro poço com uma espessura de superfície de 0,16 milímetros de células de sementes para densidade ideal para imagens de cerca de 60 a 70% de fluência de Co incubar células durante a noite a 37 graus Celsius 5%CO2 no dia seguinte, lavar as células três vezes em solução salina tamponada de Hank ou H-B-S-S-H-B-S-S é usado para remover células mortas ou detritos da placa de cultura e preparar as células para a etapa de coloração. Em seguida, incubar as células em uma solução HBSS contendo uma concentração final de 50 anos molar lyo tracker e 150 anos molar de tubulina tracker verde por uma hora a 37 graus Celsius após a incubação. Lave as células três vezes em HBSS para remover qualquer corante não ligado.Adicione meio de crescimento DMEM fresco antes de obter imagens das células. O microscópio para o rastreamento de partículas descrito no protocolo de vídeo é montado na estrutura de um microscópio invertido disponível comercialmente. Uma fonte de luz de excitação a laser de femtossegundo de safira de titânio camaleão coerente ultra dois é usada com uma faixa de comprimento de onda de saída ajustável entre 690 nanômetros e 1040 nanômetros.Certifique-se de que o feixe de laser esteja alinhado na porta traseira do microscópio. Usando espelhos revestidos de infravermelho, o feixe de laser é atenuado usando uma placa rotativa de meia onda colocada na frente de um polarizador de calcita, atenue o feixe de modo que a potência média na amostra esteja entre 0,5 e dois miliwatts. Colete a luz de fluorescência da amostra colocando uma objetiva de água de alta abertura numérica no caminho da luz.Em seguida, coloque a amostra em uma platina motorizada e ajuste o movimento fino da objetiva do microscópio. Usando um controlador pizo objetivo. Escolha um cubo de filtro de fluorescência de acordo com os comprimentos de onda de emissão desejados em uma configuração de um ou dois canais.Empregue filtros de banda de emissão passada. Para selecionar ainda mais a faixa espectral da fluorescência emitida, direcione a luz do cubo do filtro para tubos fotomultiplicadores onde o sinal é amplificado e discriminado e enviado para um cartão de aquisição de dados de entrada e saída digital para obter imagens das células, posicioná-las no palco e focar usando iluminação de luz transmitida. Mude para imagens de varredura raster para identificar as células que incorporaram o corante e, para visualizar os microtúbulos subjacentes, identifique a área inicial onde o movimento da vesícula está presente.Assim que uma vesícula isolada for identificada, defina os parâmetros para o rastreamento orbital. Primeiro, selecione o raio da órbita para definir o tamanho da varredura circular de acordo com o tamanho da partícula que está sendo rastreada. Para um emissor de ponto, defina o raio da órbita igual à cintura da função de propagação de ponto ou PSF do feixe de excitação.Para maximizar a sensibilidade e a resposta. Defina a distância axial para definir a distância entre as duas órbitas que são executadas para localizar a posição da partícula ao longo da direção axial. Defina a distância axial para 1,5 a três vezes o desperdício de PSF.Defina o tempo de permanência de acordo com o brilho da partícula, para definir o tempo gasto em cada ponto da órbita, o que também determinará a taxa de branqueamento da foto. Use um tempo de permanência entre 10 e 100 microssegundos. Defina o número de pontos em cada órbita para 64 ou 128 para produzir períodos de órbita na ordem de quatro a 32 milissegundos e fornecer uma alta resolução temporal para determinar a posição da partícula.Altere o sinal de deslocamento CC enviado aos espelhos para centralizar o feixe na partícula por meio da interface gráfica do usuário por meio de uma seleção de cursor na imagem digitalizada raster. Comece o rastreamento alternando o modo de microscópio de imagem raster para varredura orbital. Ative o feedback e a coleta de dados para análise de trajetória.Use o software para exibir a fluorescência coletada em cada ponto ao longo da órbita e em cada ponto de tempo na forma de um tapete de intensidade. A intensidade coletada ao longo do tapete fornece informações sobre a interação da partícula com outros objetos brilhantes. Exiba as informações da trajetória e a intensidade de fluorescência coletada do tubo fotomultiplicador ao longo do tempo na forma de séries temporais.Use a representação da série temporal e as informações do tapete de intensidade para selecionar apenas uma região de interesse na trajetória. Em seguida, exiba uma projeção 2D da parte selecionada da trajetória da partícula. Selecione os controles apropriados para codificar a trajetória por cores de acordo com a intensidade de fluorescência da partícula.Selecione a opção para exibir a trajetória da partícula em 3D e codifique-a por cores de acordo com a intensidade da fluorescência. Gire a trajetória em 3D usando os controles para visualizar as características do movimento do lisossomo ao longo do microtúbulo. Usando uma coloração de corante verde fluorescente dos lisossomos e dos microtúbulos, é possível obter imagens do movimento de alta velocidade das vesículas ao longo do microtúbulo com um microscópio de varredura a laser de dois fótons.No entanto, a imagem de varredura raster não tem a resolução temporal necessária para seguir com precisão o movimento dos endossomos mais rápidos se o rastreamento orbital for usado. Em vez disso, os dados mostram que é possível obter trajetórias de deslocamento x, y, Z com uma resolução temporal de 32 milissegundos. Nessas trajetórias de deslocamento versus tempo, a análise do tapete exibe a intensidade registrada ao longo de cada órbita.Com o tempo, a trajetória de intensidade fornece informações sobre os arredores fluorescentes da partícula. A região encaixotada corresponde à parte da trajetória entre dois saltos. Os pontos brilhantes fora da região encaixotada correspondem às interações da partícula com outros objetos brilhantes e estão associados a saltos na trajetória à medida que as órbitas se recentram na fonte fluorescente mais brilhante.Durante o rastreamento, a intensidade integrada da fluorescência emitida pode ser registrada. A trajetória 3D reconstruída exibe um movimento direcionado, como pode ser esperado de uma vesícula que se move na rede de microtúbulos. Além disso, é possível correlacionar a trajetória 3D a um RAs ou digitalizar a imagem da região circundante.Isso confirma o movimento da partícula ao longo da direção de um feixe de microtúbulos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas se for executada corretamente durante a tentativa. Este procedimento é importante lembrar de usar o nível de potência do laser que não seja prejudicial para sua amostra ao usar a citação fotônica, conforme ilustrado neste protocolo, os níveis de potência de cerca de dois milivolts após as objetivas devem ser mantidos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar um experimento usando o método de rastreamento orbital 3D, que permite rastrear objetos de uma faixa Z muito grande.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra como as vesículas neuronais são marcadas com proteínas fluorescentes específicas para visualizar seu movimento. Primeiro, um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente é incubado com um agente de transfecção e, em seguida, introduzido em uma cultura de neurônios. Posteriormente, imagens dos neurônios são adquiridas e analisadas para rastrear o movimento das vesículas.

Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

Este detalhes de protocolo a construção e operação de um microscópio de rastreamento em tempo real 3D única partícula capaz de rastreamento nanoescala fluorescente sondas em alta velocidade difusiva e taxas de contagem de fótons de baixa.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

4D microscopia de levedura

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

A análise de deslocamento quadrado médio (iMSD) derivada de imagem é aplicada a macropinossos para destacar sua natureza intrínseca em termos de propriedades estruturais e dinâmicas. Os macropinossomos são então comparados aos grânulos secretos de insulina (ISGs) como referência para estruturas subcelulares com propriedades estruturais/dinâmicas médias invariantes.

Sondagem de Propriedades Estruturais e Dinâmicas de Nanoestruturas Subcelulares de Tráfico por Espectroscopia de Flutuação Espiotemporal

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Aprenda a rastrear lisossomos em 3D em células vivas usando microscopia de dois fótons modificada com método de rastreamento orbital. Esta técnica permite observar dinâmica de organelas e interações vesiculares em alta velocidade.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares (Vídeo) | JoVE Journal

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

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