Name: Produção e Isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica Usando filtros porosos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a produzir e isolar axônios de neurônios sensoriais usando filtros porosos para análises bioquímicas. Este método permite obter amostras axonais puras de culturas de gânglios da raiz dorsal embrionários.

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Este projeto foi apoiado por MOP62827 de financiamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde.

NOTA: Os seguintes procedimentos estão em conformidade com as directrizes aprovadas pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal. Todos os esforços são para minimizar a dor eo sofrimento dos animais durante os procedimentos. 1. Revestimento de Filtros Nota: Quando as inserções de filtro de cultura são colocadas em poços de placas de poços múltiplos, dois compartimentos são definidos: o compartimento de cima é a região superior da inserção e do compartimento inferior é o que está abaixo do inserto Figura 1A.ab. Os explantes são semeados na parte superior do compartimento onde se fixam para o lado de cima do filtro; muitos axónios crescer através do filtro e prolongar sobre o lado inferior do filtro, dentro do compartimento inferior Figura 1A.c. Os volumes de trabalho padrão (ou seja, para a aplicação de solução de revestimento, lavagens, meios de cultura, etc) são 2 ml para o compartimento inferior e 1 ml para o compartimento superior e vão ser referidos no protocolo como &quot;; Volumes normais &quot;. Adicionar as soluções de partida, com o compartimento de fundo, colocando a ponta da pipeta no espaço entre o inserto e o lado do poço. Além disso, a inserção de inclinar para um lado, enquanto a distribuição da solução para evitar que as bolhas de ser preso na parte inferior do filtro. <ol><li> Inicie o revestimento dos filtros no dia antes do plaqueamento. De acordo com o tecido de cultura esterilizado capa, colocar 24 inserções de filtro mm numa placa de 6 alvéolos de recepção. Incubar inserções com poli-D-lisina em água (1 mg / ml) durante 1 hora à temperatura ambiente usando volumes padrão: 2 ml no compartimento inferior e um ml do topo. </li><li> Aspirar poli-D-lisina e lavar uma vez com água. Aspirar água, feche a tampa e deixe as placas para secar no capô O / N. Durante a aspiração de líquidos, certifique-se de remover um remanescente de líquido que fica preso diretamente sob o filtro. </li><li> Na manhã seguinte, diluir em água laminina (10 ug / ml), misturar e quente a 37 ° C. Incubar inserções com laminina 1 hr no cell incubadora a 37 ° C, utilizando-se volumes padrão. </li><li> Laminina aspirado e adicionam colagénio em água (0,1 mg / ml) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Neste caso utilizam 2 ml para o compartimento inferior e 2 ml para o compartimento superior. </li><li> Colagénio Aspirar e lavar uma vez com água estéril. Os filtros já estão prontos para receber meios de cultura e explantes DRG, conforme descrito no passo 3. </li></ol> 2. Dissecação Embryonic gânglio de raiz dorsal (DRG) explantes <ol><li> Anestesiar um rato fêmea grávida de 13 dias por uma injeção IP de Avertin (250 mg / kg). Espere 10-15 minutos e verifique se há falta de reflexos de retirada da córnea e pedais. Uma vez que os reflexos estão ausentes, realizar deslocamento cervical. </li><li> Desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos e abdômen feminino com etanol 70%. Permitir instrumentos para secar. Mantenha a pele do abdómen e cortar através das camadas da pele e músculo para expor a cavidade abdominal. </li><li> Remover o útero por descolamento do colo do útero e ovários. Numa Sterile capô, retire os embriões do útero com uma tesoura e coletá-los em uma placa de Petri cheia de mídia L15 gelada. Mantenha no gelo. NOTA: Consulte relatórios técnicos anteriores para obter mais detalhes sobre como obter embriões de 13 dias de gestação 17,18. </li><li> Sob o microscópio, estava o embrião de um lado e usar uma tesoura pequena mola para remover a cabeça. Faça uma incisão ao longo das laterais para descartar o peito, barriga, pernas e cauda. Mantenha as costas contendo a coluna vertebral, deitados lado ventral para cima e remova todos os órgãos viscerais. </li><li> Com uma tesoura pequena mola, expor toda a medula espinal por corte da coluna vertebral a partir do seu lado ventral na linha média. Segurar a carcaça para baixo com um par de pinças (# 3) e com um segundo par de segurar a medula espinal por seu aspecto mais rostral. </li><li> Lenta e delicadamente puxe o cabo longe da cavidade vertebral e beliscar fora DRGs da medula espinhal usando fórceps ultra-finas (# 5). Grupo dos DRGs que devem ser recolhidaso fundo do prato. </li><li> Colete DRGs agrupados por aspiração com uma pipeta de 200 mL que foi cortado para ampliar a sua abertura. Coloque as GDH num tubo e deixar em gelo até a recolha de DRG está terminado. NOTA: Branco dicas / transparentes são os preferidos porque DRGs não aderem às paredes desta ponta (em comparação com pontas amarelas padrão). Dicas Flushing com a mídia antes do uso impede mais DRGs de degola para suas paredes. </li></ol> 3. Sementeira e Manutenção de gânglio de raiz dorsal explantes em Filtros <ol><li> Adicionar mídia DRG completa a 37 ° C para as pastilhas revestidas utilizando volumes padrão. Suplemento da mídia compartimento inferior com 15 ng / ml de NGF, enquanto se mantém a parte superior do compartimento de NGF livre. NOTA: Apesar de NGF difunde de forma eficiente através do filtro e sua concentração equilibra dentro de horas, temos observado que a aplicação de NGF ao compartimento inferior diretamente antes da semeadura aumenta significativamente o rendimento axonal no bottom superfície do filtro. </li><li> Transferir os DRGs do tubo para os filtros, utilizando uma pipeta de 1000 ul com uma ponta cortada para aumentar a sua abertura. </li><li> Desenhe mídia na ponta 2-3x antes de coletar os DRGs. Isto evita que fiquem coladas ao lado de dentro da ponta. A mesma ponta pode ser re-utilizado para todos os poços. O uso de dicas uncolored (versus pontas azuis padrão) reduz DRG degola para a superfície da ponta. </li><li> Para transferir DRGs, defina a pipeta de 800 mL. Aspirar cerca de 200 mL de mídia a partir do lado superior do filtro, em seguida, ir para o tubo contendo DRG e pipetar um volume pequeno para cima e para baixo - para voltar a suspender DRGs que se afundaram para o fundo. Aspirar todo o volume e GDH submergindo a ponta da pipeta no meio do inserto. </li><li> Uma vez que todas as inserções são carregados, feche a tampa e agite a placa placa de 10x, tocando-o com cuidado no banco capô entre cada redemoinho. Estes movimentos aumentar o rendimento axonal, ajudando explantes DRG pia eanexar ao filtro. Isto também ajuda a distribuir uniformemente explantes de modo que a partir de axônios diferentes explantes não se sobrepõem. NOTA: O procedimento de semeadura explante descrito nas etapas anteriores, aumenta significativamente a taxa global de fixação explante para o substrato (até 75%). Mais significativamente, o processo de pipetagem prontamente impede explantes de flutuar sobre a superfície dos meios de comunicação em vez de afundar para o fundo do inserto. </li><li> Para as análises bioquímicas, DRGs sementes de um embrião (cerca de 30) por filtro. Para as análises morfológicas, use metade ou um terço dos DRGs de um embrião (10-15). Esta decisão deve ser tomada antes de coletar os DRGs em tubos, de modo que todos os DRGs de um tubo são semeadas em um único poço (se é 30, 15 ou 10 DRGs). </li><li> Manter as culturas numa incubadora celular a 37 ° C, alterando mídia a cada 2-3 dias. Para mudar de suporte, aspirar o compartimento de topo em primeiro lugar, seguido do compartimento inferior. Adicionar mídia frescas em volume padrãos a partir do compartimento inferior. NOTA: Para evitar que células / axônios de secagem, não mudam de mídia em mais de três inserções ao mesmo tempo. DRGs cultivadas em filtros na presença de NGF vai estender axônios longos, atingindo até 2 mm ao fim de 2 dias em cultura. </li></ol> 4. Fator Trófico Tratamento Retirada Retirada NGF induz degeneração axonal com a fragmentação axonal (determinado pelo contraste de fase e β-III-tubulina SE), que aparece pela primeira vez em torno de 12 horas após a retirada. Fragmentação completa é alcançada em 36 horas. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental. <ol><li> Após a fase de extensão axonal de 2 dias, a partir de meios de mudar os compartimentos superior e inferior de meios de comunicação, que carece de NGF e que contém os anticorpos anti-NGF (1 ug / ml) para sequestrar qualquer remanescente (ou produzida endogenamente) NGF. </li><li> E volta para as placas da incubadora celular (37 ° C) para permitirNGF degeneração induzida por retirada de proceder para a quantidade de tempo desejada. </li><li> Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7). </li></ol> 5. Axonal transecção para induzir a degeneração walleriana Este procedimento deixa os axónios no lado inferior do filtro separado do seu corpo da célula, mas de outra forma intacto. Posteriormente, esses axônios iniciar rapidamente a degeneração Walleriana. Fragmentação axonal (evidenciado pelo contraste de fase ou β-III-tubulina IF) aparece pela primeira vez por 3 horas após a transecção; por 9 horas, os axônios são completamente fragmentados e são separadas do filtro. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental. <ol><li> Raspe o lado superior do filtro, contendo explantes DRG cultivados, com um raspador de células. Assegurar a remoção completa do material de topo por raspador movendo-se em X, Y e circularindicações. </li><li> Descartar o material da parte superior do compartimento contendo os explantes flutuantes que foram raspados do filtro e substitua com 1 ml de pré-aquecido, meios DRG completo contendo NGF (10 ng / ml). </li><li> Retornar placa para a célula incubadora (37 ° C) para permitir que a degeneração waleriana prosseguir durante o período de tempo escolhido pelo utilizador final. </li><li> Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7). </li></ol> 6. Extração de proteínas das amostras axonais <ol><li> Preencha tubos de coleta (1,5 ml) com 75 mL de tampão de amostra Laemmli. Manter tubos em gelo enquanto colhendo os axônios de todo o conjunto de filtros. </li><li> Lavar o filtro com explantes DRG em PBS e raspar o lado de topo do filtro. Remova a inserção da placa, limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta e aspirar qualquer PBS extra dos lados superior e inferior. </li><li> Coloque inserção de cabeçapara baixo no banco e cortar o filtro da inserção utilizando um bisturi afiada. Mantenha o filtro com uma pinça, de baixo para cima. Fazer um corte a partir da circunferência para o centro do filtro, com uma tesoura. </li><li> Local filtro no topo do tubo de recolha, e com uma pinça, prima do centro do filtro para baixo do tubo. Enquanto isso, um funil devem formar. Empurrar o filtro em forma de funil para o fundo do tubo de maneira que ele é submerso no tampão de amostra Laemmli. </li><li> Extração de proteína completa, fervendo os tubos para 4 min. Retirar o filtro, utilizando um fórceps para colocá-la de cabeça para baixo na parte superior do tubo e realizar uma breve centrifugação (2000 xg durante 15 seg). Descarte os filtros secos. </li><li> Resolver 10 ul da preparação de proteína axonal num SDS-PAGE seguido por Western blot para detectar as proteínas de interesse. NOTA: Como referência, uma preparação axonal de 20 explantes cultivados durante 2 dias e lisadas em 100 ul de tampão de lise RIPA terá uma concentração de proteína de 4-6ug / ul. </li></ol> 7. Exame de imunofluorescência de axônios em Filtros Os passos seguintes descrevem as manipulações gerais para executar se a coloração de elementos filtrantes, exemplificadas pela detecção de β-III-tubulina. Fixação, tempos de incubação, concentrações e outros elementos devem ser otimizados para outros pares de antígeno-anticorpo. <ol><li> Utilize usados ​​anteriormente placas de 6 poços, cuidadosamente limpos, para as seguintes lavagens e incubações das inserções. </li><li> Lava-se rapidamente insertos em PBS. Corrigi-los em recém-preparada de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente no agitador. </li><li> Após a fixação, raspar e limpar o lado de topo do inserto de recolher os axónios que cresceram exclusivamente sobre a superfície inferior do filtro. Prossiga com incubações padrão para IF. </li><li> Incubar inserções em solução de bloqueio (TBS, 0,05% de Tween 20, 5% de leite desnatado), usando volumes padrão, durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Transferência de inserções para anticorpo primário diluído em tampão (anti-β-III-tubulina, 1:5000) de bloqueio, utilizando volumes padrão. Incubar S / N (~ 18 horas) a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Lavar o primeiro anticorpo duas vezes em PBS (2 x 10 min à temperatura ambiente). </li><li> Transferência insere a anticorpos secundários fluorescentes conjugados diluídos em tampão de bloqueio (cabra anti-ratinho, 1:2000), usando volumes padrão. Incubar coberto da luz durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Lavar 3x anticorpo secundário em PBS (3 x 10 min à temperatura ambiente). </li><li> Depois de IF é completa, tome inserir fora, despeje longe PBS a partir da última lavagem e limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta. Aspirar todo o líquido a partir dos lados superior e inferior. </li><li> Local inserir de cabeça para baixo no banco, e cortar o filtro de inserção com um bisturi afiada. </li><li> Mantenha o filtro com uma pinça, desvantagem, e colocar sobre lâmina de microscopia. Overlay com uma lamela e mou compatível fluorescentemídia NTING. Vamos plana e seca no quarto frio, coberto de luz. Examinar e capturar imagens usando um microscópio fluorescente. NOTA: Quando armazenado a 4 ° C e protegida da luz, estas preparações podem ser mantidas durante semanas, com uma perda mínima de fluorescência. </li><li> OPCIONAL: Como alternativa, se pode ser realizada em filtros que foram removidas a partir da inserção. Para fazer isso, raspar e limpar o lado de cima dos filtros directamente após a fixação. <ol><li> Tome filtros fora das pastilhas com um bisturi afiado filtros e colocar axónios-se na parte inferior de uma placa de seis poços. </li><li> Em seguida, execute incubações para IF como indicado na 7,4-7,8 e 7.11. A vantagem desta alternativa é que poupa reagentes, uma vez que, por exemplo, os volumes de incubação pode ir até 500 mL (em comparação com os 3 ml utilizadas quando os filtros são directamente corados sobre as inserções como mostrado na 7,1-7,11). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Parâmetros importantes a ter em conta aquando da adaptação desta técnica incluem a população neuronal que vai ser estudado, o substrato, o tamanho dos poros do filtro e área de superfície. Todos estes parâmetros terá impacto sobre a especificidade, qualidade e quantidade da preparação neurite obtido e deve ser analisada com cuidado pelo usuário final. Nos exemplos apresentados neste protocolo, o uso de neurônios DRG tem a vantagem de estender apenas axônios, dando assim um puro preparação axonal (específico). <p cla...

O compartimento axonal de neurônios mostra um elevado grau de independência funcional do compartimento do somato-dendrítica. Em neurônios de projeção, os axônios conter a maior parte do 1,2 proteína neuronal. O estudo da fisiologia e fisiopatologia dos axônios ganhou força na comunidade da neurociência porque estudos recentes têm mostrado que a disfunção axonal no início parece ser uma característica comum de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos 3. Parece provável que uma melhor compreensão dos mecanismos axonal exclusiva em condições normais e patológicas vai lançar luz sobre os eventos iniciais que levam a disfunção. O presente protocolo descreve como utilizar inserções de cultura tendo uma membrana porosa (filtro) para obter grandes quantidades de material axonal puro que é adequado para análises bioquímicas e imunocitoquímica. O uso de filtro insere estudar biologia axonal foi implementado pela primeira vez por Steward e4 colegas e desenvolvido por Twiss e colegas 5 a sua configuração actual. A técnica é agora de uso corrente por parte de grupos que estudam diferentes aspectos da biologia axonal e dendritos, com ligeiras modificações, em cada caso para acomodar a população de neurônios estudados, os tratamentos realizados eo tipo de análises bioquímicas usadas 6-9. O presente protocolo não pretende acomodar todas as alternativas para uma tal variedade de aplicações, mas sim fornecer uma abordagem simples que é adequado para a maioria das aplicações. Em particular, o protocolo descrito aqui utiliza uma camada tripla que maximiza o rendimento axonal para análises bioquímicas e é o mais apropriado para estudar revestimentos degeneração axonal outros descritos na literatura produziu menos axónios que retraem e degeneram mais rápido quando privados de factores tróficos 9. Neste procedimento, os corpos celulares neuronais permanecer isolada sobre os filtros de whaxônios ile passar através dos poros e crescer ao longo de sua superfície inferior. Axónios puros (livres de células da glia e os contaminantes do corpo da célula neuronal), que crescem sobre a superfície inferior do filtro pode ser recolhido para análises bioquímicas ou pode ser fixada in situ e examinadas por meio de técnicas de imunocitoquímica 9. O procedimento baseia-se na utilização de neurónios sensoriais embrionárias a partir de gânglios da raiz dorsal (DRG). DRGs embrionárias são amplamente usados ​​para o estudo da biologia axonal porque neurites a partir dessas células sofrem um crescimento rápido e robusto, in vitro, quando mantidos em factor de crescimento do nervo (NGF), e porque rapidamente sofrer degeneração quando privados deste factor. Além disso, os neurónios DRG falta dendritos, de modo que todas as neurites recolhidos por este método são meramente axónios. Filtrar inserções representam uma grande vantagem em comparação com outras abordagens utilizadas para estudar os axônios. Estudos que dependem da utilização de microscopia de diferenciar os processos que ocorrem na célula do soma daquelas numaXONs fornecer informação bioquímica limitado. Como outro exemplo, os sistemas de cultura (por exemplo, em compartimentos, câmaras Campenot 10 ou dispositivos de microfluidos 11) são úteis para abordagens de imagem e para o tratamento diferencial de compartimentos celulares, mas fornecer apenas pequenas quantidades de material axonal, impedindo o uso destas técnicas para análises bioquímicas que requerem quantidades relativamente grandes de amostra. Além disso, seu uso requer treinamento significativo, bem como dispositivos especializados, e eles são demorados. Outra abordagem frequentemente usada para isolar os axônios a partir de explantes é remover manualmente um centro de explante (contendo corpos celulares neuronais) antes da coleta de amostra axonal. Embora este pode produzir grandes quantidades de preparações enriquecidas dos axónios, os axônios nesta preparação pode ser envolto em células gliais e removendo rapidamente corpos 20 do explante consecutivamente a partir de 6 poços (como um exemplo de uma experiência mínima) é demorado e no limite de viabilidade. Em contraste, o método aqui apresentado produz preparações axonais abundante e pura, que pode, então, ser analisados ​​por virtualmente qualquer técnica bioquímica que é vulgarmente utilizado para analisar os lisados ​​de células inteiras, como Western blot, imunoprecipitação 6, northern blot 5 espectrometria de massa 6, a purificação de ARN 7,12,13, entre outros. Além disso, o protocolo pode ser aplicado para imunofluorescência (IF) de técnicas, como é possível a fixação de axónios em crescimento no lado inferior do filtro para os examinar ainda por IF. Esta abordagem facilita muito a análise dos processos específicos de axonal já que não há corpos celulares na preparação final. Esta é uma vantagem significativa uma vez que um sinal de alta imunofluorescência de corpos celulares muitas vezes prejudica o exame e análise de um sinal mais fraco proveniente de estruturas finas, tais como axónios. Duas aplicações do método de cultura para estudar axonal ar degeneraçãoe descritos; um modelo de poda de desenvolvimento e um modelo de degeneração induzida por lesão (comumente referido como degeneração Walleriana). A modelagem da poda de desenvolvimento baseia-se no fato de que os neurônios sensoriais in vivo competem para limitar a quantidade de NGF derivado do alvo e aqueles não receber suficiente neurotrófico degenerado apoio 14. Este fenómeno pode ser mimetizado em culturas de DRG embrionárias mediante a retirada do NGF do meio de cultura, o que, como acontece in vivo, inicia a degeneração axonal seguida da destruição de células do corpo. Para modelar a degeneração Wallerina, o lado superior do filtro com os corpos celulares é raspado. Os axônios que tinham crescido para o lado inferior do filtro tornar-se fisicamente separados dos corpos celulares e, posteriormente, submeter-se ao processo degenerativo rápido e estereotipado conhecida como degeneração Walleriana 15, em homenagem a A. Waller que primeiro relatou o fenômeno em 1850 16.

<table><tbody><tr><td>Camundongo CD-1, gravidez cronometrada E13</td><td>Charles River</td><td></td><td>As gestações cronometradas em casa podem ser feitas acasalando camundongos e verificando se há tampões vaginais (Dia E0)</td></tr> <tr><td>Inserções de cultura de células de falcão</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &micro; m tamanho do poro, se encaixa na placa receptora de 6 poços</td></tr><tr><td>Placas companheiras de cultura de células Falcon</td><td>Placas</td> receptoras <td>Corning 353502</td><td>para inserções</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Usado a 1 mg/ml em água. Pode reutilizar uma vez.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Usado em 10 &micro; g/ml em água. Pegue 100x estoque de -80 &deg; C e descongelar O/N a 4 &graus; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de colágeno bovino PureCol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Pode ser substituído por DMEM</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplemento sem soro</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-desoxiuridina (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, subunidade beta)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NGF</td><td>Preparado internamente</td><td></td><td>Conforme descrito em: Acheson, A. et al. Detecção de atividade semelhante a fator neurotrófico derivado do cérebro em fibroblastos e células de Schwann: inibição por anticorpos para NGF. Neurônio. <forte>7</forte>, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Opção</td><td></td>comercial</tr><tr><td>Anticorpo anti-tubulina</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo anti-camundongo de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DRG meio de cultura</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium 2% B27 Suplemento Neurobasal 2 mM l-Glutamina 1% Penicilina-estreptomisina 10 &micro; M FDU 15 ng/ml NGF (apenas compartimento inferior)</td></tr><tr><td colspan="4">1x tampão de amostra Laemmli</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6,8) 5% Glicerol 0,01% (p/v) Azul de bromofenol</td></tr></tbody></table>

produção e isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica usando filtros porosos

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Os axônios neuronais usam mecanismos específicos para mediar a extensão, manter a integridade e induzir a degeneração. Um equilíbrio apropriado desses eventos é necessário para moldar os circuitos neuronais funcionais. O protocolo descrito aqui explica como usar insertos de cultura de células com uma membrana porosa (filtro) para obter grandes quantidades de preparações axonais puras adequadas para exame por técnicas bioquímicas ou imunocitoquímicas convencionais. A funcionalidade desses insertos filtrantes será demonstrada com modelos de poda de desenvolvimento e degeneração walleriana, utilizando explantes de gânglio da raiz dorsal embrionária. A integridade e a função axonal estão comprometidas em uma ampla variedade de patologias neurodegenerativas. De fato, agora está claro que a disfunção axonal aparece muito mais cedo no curso da doença do que a perda do soma neuronal em várias doenças neurodegenerativas, indicando que os processos específicos axonais são direcionados principalmente para esses distúrbios. Ao obter amostras axonais puras para análise por técnicas moleculares e bioquímicas, essa técnica tem o potencial de lançar uma nova luz sobre os mecanismos que regulam a fisiologia e a fisiopatologia dos axônios. Isso, por sua vez, terá um impacto em nossa compreensão dos processos que impulsionam as doenças degenerativas do sistema nervoso.

Explantes gânglio da raiz dorsal de ratos E13.5 crescer extensivamente sobre filtros sequencialmente revestidas com poli-D-lisina, laminina e colágeno (Figura 1B, à esquerda), atingindo até 2 mm de dentro de 2 dias em cultura. Esta combinação de substrato produz um crescimento particularmente exuberante; outras combinações produzir axónios que são consideravelmente mais curto (Figura 1B, à direita). Além disso, os GDH mantidos em filtros estender mais e mais longos do que os axónios DRG...

Este artigo descreve um sistema de cultura neuronal que pode ser usado para obter grandes quantidades de amostras axonais puras para análises bioquímicas e imunocitoquímicas. Esta técnica permitirá uma melhor compreensão da fisiologia axonal normal e das vias de sinalização que levam à neurodegeneração.

Produção e Isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica Usando filtros porosos

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

O objetivo deste procedimento é obter preparações axonais puras adequadas para exame por técnicas convencionais, bioquímicas ou imunocitoquímicas. Isso é feito pela primeira cultura de células embrionárias do gânglio da raiz dorsal em inserções de cultura com um filtro de membrana porosa à medida que os neurônios DRG estendem os axônios. Alguns dos axônios crescem através dos poros do filtro e se estendem em sua superfície inferior, enquanto os corpos celulares permanecem isolados na superfície superior Após as manipulações experimentais desejadas, a preparação axonal é obtida removendo fisicamente as células na parte superior dos filtros, mantendo os axônios que cresceram na parte inferior.Em última análise, os axônios isolados podem ser removidos para análises bioquímicas ou fixados para exame imunoquímico produzindo amostras axonais puras adequadas para análise por técnicas bioquímicas convencionais. Este procedimento provou ser muito útil para investigar a fisiologia e fisiopatologia dos axônios. Como você verá, a técnica é relativamente simples de implementar e pode ser adaptada a ambientes experimentais específicos.Vamos demonstrar seu uso no estudo dos mecanismos de degeneração axonal um dia antes do plaqueamento. Comece revestindo os filtros sob uma capa de cultura de tecidos estéril. Primeiro lugar, inserções de filtro de 24 milímetros em uma placa de recepção de seis poços.Em seguida, adicione dois mililitros de um miligrama por mililitro, poli de licina em água no compartimento inferior e um mililitro no superior, e incube as inserções por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o poli de licina, certificando-se de remover o remanescente de líquido que fica preso diretamente sob o filtro. Em seguida, enxágue uma vez com água após aspirar a água, feche a tampa e deixe as placas secarem no exaustor durante a noite.Na manhã seguinte, misture e aqueça uma solução de laminado e água a 37 graus Celsius. Incube as inserções na solução de laminina por uma hora em uma incubadora de células a 37 graus Celsius usando volumes padrão. Após a aspiração.A laminina adiciona 0,1 miligramas por mililitro, colágeno em água e incuba por uma hora em temperatura ambiente, depois aspire o colágeno e lave uma vez com água estéril. Os filtros agora estão prontos para receber meios de cultura e DRG explan depois, após dissecar e decapitar um embrião de camundongo E 13, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque o embrião de lado em uma placa de Petri cheia de meio L 15 enquanto observa através de um microscópio de dissecação, faça uma incisão ao longo dos lados laterais para descartar o peito, os membros da barriga e a cauda.Coloque as costas contendo a coluna com o lado ventral para cima e remova todos os órgãos viscerais usando uma pequena tesoura de mola. Exponha toda a medula espinhal cortando a coluna vertebral de seu lado ventral ao longo da linha média. Segure a carcaça com um par de pinças número três e use um segundo par para segurar a medula espinhal por seu aspecto mais rostral.Agora, lenta e suavemente, puxe o cordão para longe da cavidade vertebral. À medida que os DRGs são expostos, use uma pinça ultrafina número cinco para retirá-los da medula espinhal. Coloque os DRGs destacados no fundo do prato usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros que foi cortada para aumentar.Sua abertura. Aspire os DRGs coletados e coloque-os em um tubo no gelo. Completar o meio do compartimento inferior com 15 nanogramas por mililitro de NGF, mantendo o compartimento superior livre de NGF.Em seguida, adicione mídia DRG completa a 37 graus Celsius aos insertos revestidos usando volumes padrão. Em seguida, usando uma pipeta de 1000 microlitros com uma guarnição de ponta para ampliar sua abertura. Defina a pipeta em 800 microlitros.Em seguida, transfira aproximadamente 200 microlitros de mídia da parte superior do filtro para o tubo contendo DRG pipeta um pequeno volume para cima e para baixo para suspender novamente os D RRGs que afundaram no fundo. Uma vez ressuspenso, aspire todo o volume, agora transfira os DRGs para o filtro submergindo a ponta da pipeta no meio da inserção e expelindo os DRGs. Mantenha as culturas em uma incubadora de células a 37 graus Celsius.Mudando a mídia a cada dois ou três dias para mudar a mídia. Aspire primeiro o compartimento superior e depois o compartimento inferior. Adicione meios frescos em volumes padrão começando com o compartimento inferior para estudar o efeito da retirada do fator trófico nos axônios.Espere dois dias para permitir a extensão axonal. Em seguida, remova a mídia dos compartimentos superior e inferior. Em seguida, para sequestrar qualquer remanescente ou produzido endogenamente e GF, adicione meios que não contenham NGF e contenham anticorpos anti-NGF.Retorne as placas para a incubadora de células a 37 graus Celsius para permitir que a degeneração induzida pela retirada de NGF prossiga pelo tempo desejado para estudar enquanto a degeneração ariana. Use filtros contendo DRG explan mantidos em NGF por dois dias. Use um raspador de célula para raspar DRGs da parte superior do filtro.Garanta a remoção completa dos corpos celulares neuronais movendo o raspador para frente e para trás nas direções x e y e em círculos. Confirme o sucesso da raspagem verificando se não há X plantas presas ao filtro. Em seguida, descarte o meio contendo os explantes flutuantes do compartimento superior e adicione um mililitro de meio DRG completo pré-aquecido contendo 10 nanogramas por mililitro e gf.Em seguida, retorne a placa para a incubadora de células a 37 graus Celsius para permitir que a degeneração walleriana prossiga pelo tempo desejado para extrair a proteína das amostras axonais. Comece enchendo tubos de coleta de 1,5 mililitro com 75 microlitros de tampão de amostra de folha de cordeiro e coloque os tubos no gelo. Lave o filtro que contém o DRG explan em PBS e raspe a parte superior do filtro como antes.Depois de remover a inserção da placa, use um aplicador de ponta de algodão para limpar a parte superior do filtro. Em seguida, aspire qualquer PBS extra dos lados superior e inferior. Em seguida, coloque a pastilha de cabeça para baixo em uma bancada e use um bisturi afiado para cortar o filtro da pastilha.Em seguida, segurando o filtro com uma pinça. De baixo para cima. Use uma tesoura para fazer um corte da circunferência até o centro do filtro.Agora coloque o filtro em cima do tubo de coleta e, com uma pinça, pressione o centro do filtro para baixo do tubo. Ao fazer isso, um funil se formará, empurre o filtro em forma de funil para o fundo do tubo para que ele fique submerso no tampão de amostra laly. Agora complete a extração de proteínas cobrindo os tubos e colocando-os em água fervente por quatro minutos.Remova o filtro usando uma pinça e coloque-o de cabeça para baixo na parte superior do tubo e centrifugue-o brevemente. Quando terminar, descarte os filtros secos para imunofluorescência. Lave as inserções em PBS em placas de seis poços.Em seguida, fixe as inserções em aldeído paraforme a 4% recém-preparado em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente em um agitador após a fixação, raspe e limpe a parte superior das inserções para garantir que apenas os axônios que cresceram exclusivamente na superfície inferior do filtro sejam manchados. Em seguida, execute a imunofluorescência padrão conforme descrito no protocolo de texto. Uma vez concluídas todas as incubações de imunofluorescência.Despeje o PBS da última lavagem. Limpe a parte superior do filtro com um aplicador de ponta de algodão e aspire qualquer líquido restante dos lados superior e inferior. Coloque a pastilha de cabeça para baixo na bancada e use um bisturi afiado para cortar o filtro da pastilha.Em seguida, segurando o filtro com a pinça de cabeça para baixo. Coloque-o em uma lâmina de microscópio. Use mídia de montagem compatível com fluorescente para colocar uma lamínula sobre o filtro e deixe o filtro secar no escuro a quatro graus Celsius.Finalizado examinando e capturando imagens usando um microscópio fluorescente. O revestimento sequencial de filtros com polilisina, laminina e colágeno resulta em plantas que crescem mais e mais axônios em comparação com aquelas cultivadas apenas com polilisina ou polilisina e colágeno sob o mesmo substrato. Condições de revestimento.O DRG Explan mantido em filtros mostra um crescimento axonal consideravelmente mais exuberante do que as plantas X cultivadas em plástico. A preparação axonal obtida após a raspagem do lado superior do filtro é desprovida de núcleos celulares, demonstrando que os corpos celulares são excluídos do lado inferior do filtro mostrado. Aqui estão exemplos de axônios que se originaram de aproximadamente 17 explan, que se estenderam pelos poros do filtro para crescer na parte inferior de um filtro de 24 milímetros.Immuno blots de lisados coletados de topos de filtro versus fundos demonstram que a histona H três um marcador nuclear está confinado aos topos de filtro. O teor de proteína total foi normalizado nas diferentes amostras. Os experimentos de privação de NGF são demonstrados nessas imagens em diferentes ampliações de preparações axonais de explanação mantidas em NGF ou privadas de NGF por 12 ou 36 horas.Os estudos de degeneração axonal ariana de parede são mostrados nessas imagens de preparações axonais de explantes intactos ou três a 7,5 horas após a transecção, como em outros modelos de degeneração walleriana. Cinco milimolares NAD plus protege da degeneração induzida por transecção Uma vez dominado. Esta técnica é robusta e fácil de reproduzir.Permite a geração de grandes quantidades de preparações axonais confiáveis Desde descrito pela primeira vez por torção e colegas em 2001. Variações dessa técnica têm sido usadas para explorar muitos aspectos da fisiologia dos axônios e dendritos. Consulte as citações no protocolo de texto para descobrir outras aplicações dessa técnica.

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Neuroscience

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