A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o efeito dos eventos de hibridização de DNA nos espectros de impedância usando um dispositivo eletroquímico microfluídico. Para fazer isso, um chip eletroquímico é fabricado para permitir uma série de sensores de eletrodo e um chip PDMS microfluídico é fabricado. Para facilitar a introdução de amostras de microvolume, os dois chips são unidos e funcionalizados com sondas de DNA de fita simples.

O DNA de fita simples alvo é então adicionado após a hibridização do DNA, a força de repulsão mais forte entre o DNA de fita dupla carregado negativamente e as moléculas de cianeto de cianeto Ferris carregadas negativamente resulta em maior resistência à transferência de carga. Em última análise, os eventos de hibridização de DNA podem ser detectados medindo as mudanças nos espectros de impedância eletroquímica. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o uso de um leitor de placas ou ensaio de deslocamento J, é que os dispositivos podem executar a mesma técnica com baixo volume de amostra e por uma fração do custo sem sacrificar a sensibilidade ou a especificidade.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa do câncer, detecção de influenza e engenharia genética, permitindo a triagem rápida de sequências de DNA específicas e a investigação da cinética binária de sequências de DNA de fita simples. Como esse método de análise de hibridização de DNA rápido e de alto rendimento pode funcionar com baixo volume de amostra e sem etapas complicadas de preparação de amostras, as implicações dessa técnica se estendem ao nosso diagnóstico de distúrbios genéticos, várias formas de câncer ou doenças com marcadores de DNA específicos, como influenza. Geralmente, indivíduos novos no método terão dificuldades porque o desenvolvimento de micro dispositivos requer parâmetros de processamento de controle e uma abordagem iterativa para resolver problemas como vazamento de solução.

Após a montagem do dispositivo Para padronizar eletrodos de ouro no chip eletroquímico, segure um wafer de silício de quatro polegadas de grau primário em branco com uma pinça e use um frasco de lavagem para enxaguar a superfície de ambos os lados do wafer com acetona, metanol e, em seguida, isopropanol. Este processo é referido a seguir como um A MI limpo sob um fluxo de água deionizada. Enxágue o isopropanol do wafer e, em seguida, use uma pistola de nitrogênio para secar o wafer.

Carregue o wafer em deposição de vapor químico aprimorada por plasma ou equipamento PECDD. Insira os parâmetros para produzir uma camada de dióxido de silício de um micrômetro de espessura e inicie o processo automatizado em seguida, usando uma ferramenta de pulverização catódica DC, deposite uma camada de cromo com 200 angstroms de espessura no wafer e, em seguida, deposite uma camada de ouro com 2000 stroms de espessura. Carregue o wafer em um centrifugador, polvilhe a superfície com uma pistola de nitrogênio e, usando uma pipeta de paster, aplique o centrifugação PR de um giro positivo de fotorresistência para criar um filme uniforme com cerca de 1,6 micrômetros de espessura.

Em seguida, pré-asse o wafer por um minuto a 100 graus Celsius em uma chapa quente. Carregue o wafer com a fotorresistência no equipamento alinhador de máscara. Em seguida, inicie uma exposição de 190 milijoules por centímetro quadrado a 405 nanômetros em que o alinhador de máscara abrirá o obturador e exporá a fotorresistência à luz através de uma máscara com os recursos projetados.

Após a exposição, mergulhe o wafer em um prato de vidro contendo 3 5 2 revelador e incube por 30 segundos com agitação suave. Em seguida, lave o wafer sob uma corrente de água e seque com a pistola de nitrogênio como antes. Em seguida, mergulhe o wafer em um prato de vidro contendo solução de condicionamento de ouro e incube por 1,5 minutos com agitação suave.

Em seguida, transfira o wafer para um prato de vidro contendo o cromo mencionado e incube agitando suavemente até que as marcas de cromo no wafer desapareçam. Isso deve levar cerca de 30 segundos. Lave o wafer com água di e seque com a pistola de nitrogênio segurando o wafer com uma pinça.

Descasque a fotorresistência usando o procedimento de limpeza MI. Em seguida, enxágue com água DI e seque com a pistola de nitrogênio usando duas camadas de luvas. Mergulhe o wafer em um prato de Teflon com solução limpa de piranha por um minuto.

Em seguida, lave o wafer com di água e seque com uma pistola de nitrogênio. Em seguida, padronize os eletrodos de platina, carregue o wafer em um spinner. Limpe a superfície usando uma pistola de nitrogênio e usando uma pipeta paster dispense PR duas fotorresistes positivas na rotação da superfície para criar um filme uniforme com cerca de 1,4 micrômetros de espessura.

Coloque o wafer em uma chapa quente a 100 graus Celsius e pré-asse por um minuto. Após o pré-cozimento, exponha o wafer a 30 milijoules por centímetro quadrado de 405 nanômetros através de uma máscara fotográfica. Em seguida, coloque o wafer em uma chapa quente a 125 graus Celsius e leve ao forno por 45 segundos.

Remova a máscara da máscara, alinhador e inundação. Exponha o wafer com 1000 milijoules por centímetro quadrado no comprimento de onda de 405 nanômetros sem uma máscara fotográfica. Após a exposição, revele o wafer submergindo-o em um prato de vidro contendo seis para um uma solução reveladora Z 400 K.

Incube por dois minutos com agitação suave. Em seguida, lave o wafer com di água e seque com uma pistola de nitrogênio. Usando um sistema de evaporação de feixe E, deposite uma camada de titânio de 400 angstroms de espessura, seguida por uma camada de platina de 1600 angstroms de espessura no wafer.

Coloque o wafer em um prato de vidro cheio de acetona e coloque o prato em um banho ultrassônico por cinco minutos para retirar a foto. Resista então segurando o wafer com uma pinça. Use um frasco de lavagem para enxaguar ambas as superfícies do wafer com acetona e, em seguida, isopropanol.

Lave o wafer com água di e seque com a pistola de nitrogênio. Para preparar o molde para os canais de ensaio, enxágue um wafer de silício de qualidade de grau de teste de quatro polegadas em branco com o procedimento de limpeza MI. Como antes, lave o isopropanol do wafer com di água, seguido de secagem com uma pistola de nitrogênio.

Carregue o wafer em um spinner, polvilhe a superfície do wafer com uma pistola de nitrogênio e, usando uma pipeta de pasti, dispense PR três fotorresistores negativos na superfície para criar um filme uniforme com cerca de 100 micrômetros de espessura. Coloque o wafer em uma chapa quente para pré-assá-lo usando um procedimento de cozimento em duas etapas. Primeiro, aumente a temperatura da temperatura ambiente para 65 graus Celsius a 300 graus Celsius por hora.

Em seguida, mantenha a 65 graus Celsius por 10 minutos. Aumente até 95 graus Celsius a 300 graus Celsius por hora e segure por 30 minutos. Exponha o wafer com 2.500 milijoules por centímetro quadrado a 405 nanômetros de comprimento de onda através de uma máscara fotográfica.

Em seguida, coloque o wafer em uma chapa quente e pós-asse o wafer aumentando da temperatura ambiente para 95 graus Celsius a 300 graus Celsius por hora. Segure a 95 graus Celsius por 10 minutos. Mergulhe o wafer em um prato de vidro contendo propilenoglicol, acetato de éter monometílico ou revelador P-G-M-E-A e deixe-o desenvolver por 10 minutos.

Enxágue o wafer com isopropanol e seque com uma pistola de nitrogênio para fabricar canais de ensaio para encontrar um invólucro ao redor do wafer do molde com papel alumínio e despeje lentamente o poli dimetil suboxano ou PDMS não curado sobre o molde. Asse o molde com o PDMS em um forno de caixa usando um procedimento de cozimento em duas etapas no qual a temperatura sobe da temperatura ambiente para 80 graus Celsius em cinco minutos e permanece em 80 graus Celsius por 17 minutos. Depois que o molde esfriar, retire o PDMS do molde e coloque sobre papel alumínio.

Corte as lascas de ensaio com uma faca cirúrgica e defina os orifícios com uma ferramenta de perfuração de biópsia, conforme mostrado aqui. Alinhe manualmente os canais de ensaio PDMS com os eletrodos de trabalho no chip eletroquímico. O PDMS adere bem ao chip eletroquímico, vedando os canais e evitando vazamentos.

Conecte o tubo flexível a um cotovelo de plástico ou conector reto usando um tubo flexível curto como adaptador para funcionalizar os microcanais verticais. Conecte uma seringa contendo a sonda de DNA de fita simples ao tubo e coloque-a em uma bomba de seringa. Conecte os conectores a cada uma das entradas perfuradas inteiras no dispositivo.

O aspecto mais difícil deste procedimento é fluir a solução nos microcanais sem gerar bolhas. Para garantir o sucesso, flua a solução muito lentamente Para obter um enchimento homogêneo do canal, inicie a bomba a uma taxa de fluxo de 200 microlitros por hora para preencher lentamente cada um dos três microcanais separados com uma solução de incubação de sonda de DNA de fita simples diferente. Após incubação por uma hora, troque o tubo da seringa e o conector para enxaguar os microcanais com PBS Em seguida, troque o tubo da seringa e os conectores para preencher o microcanal com uma solução que consiste em um CAPTO milimolar de seis mer, um HCH de etanol H em PBS 10 milimolar, cloreto de sódio 100 milimolar e TCEP 1.395 milimolar incubar por uma hora.

Em seguida, enxágue com PBS como antes de usar uma pinça. Levante o PDMS girado 90 graus para uma orientação horizontal e colocado no chão. Isso exporá fileiras separadas de câmaras de reação, com cada linha contendo um contador exclusivo e um eletrodo de referência para a análise de hibridização de DNA.

Troque, a tubulação da seringa e os conectores para preencher os microcanais com uma solução de medição de controle de tampão SSC de citrato de sódio sadio concentrado concentrado Forex por 20 minutos após a incubação, troque a seringa para preencher os microcanais com cianeto de Ferris de cinco milimolares cianeto de faraó milimolar em solução de PBS. Em seguida, para registrar os valores de impedância de fundo do sistema eletroquímico para diferentes frequências por espectroscopia de impedância eletroquímica ou EIS, conecte um stat de potencial ao contador de trabalho e aos eletrodos de referência usando pontas de sonda. Insira os parâmetros da medição EIS no software do computador e, em seguida, inicie a medição.

Repita esta medição para cada eletrodo de trabalho nos microcanais para medir a hibridização de DNA para cada troca de alvo de DNA de fita simples não complementar e complementar. O tubo e o conector da seringa. Encha os microcanais com um tampão SSC concentrado de quatro x contendo um micromolar do DNA de fita simples alvo e incube por 20 minutos.

Faça medições iniciando a medição EIS com um software no computador para cada solução de DNA de fita simples alvo para validar a atividade eletroquímica do bio chipp cíclico vol. As medições de telemetria foram feitas nos microcanais preenchidos com um redox eletroativo O cianeto de cianeto de casal mostrado aqui são telegramas de vol cíclico de nove eletrodos de trabalho. A forma, as alturas dos picos e a separação dos picos semelhantes para todos os eletrodos demonstram alta reprodutibilidade para demonstrar a capacidade dos biochips de detectar eventos de hibridização de DNA.

Variações de impedância eletroquímica foram medidas para eventos de hibridização entre três sondas de DNA de fita simples e seus alvos de DNA de fita simples complementares e não complementares, mudanças mais altas na resistência à transferência de carga foram observadas quando o alvo de DNA de fita simples complementar foi introduzido e hibridizado com a sonda em comparação com a introdução de alvos de DNA de fita simples não complementares para demonstrar a sensibilidade do biossensor. Diferentes concentrações de alvo de DNA de fita simples complementar foram introduzidas na sonda de detecção mostrada aqui é um gráfico de nyquist de medições de espectroscopia de impedância eletroquímica após a introdução de concentrações crescentes de DNA de fita simples alvo indicadas pela seta no gráfico. Valores de impedância aumentados foram observados em baixas frequências de cerca de 15 hertz para concentrações de DNA de fita simples alvo mais altas devido às forças de repulsão mais fortes entre o DNA de fita dupla e as moléculas de cianeto de ferro Ferris.

No geral, o BIOCHIPS mostra a capacidade de detectar rapidamente a presença de eventos de hibridização de DNA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver e fabricar um dispositivo eletroquímico microfluídico e usá-lo para detectar eventos de hibridização de DNA. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar vários parâmetros do BIOS, como relação sinal-enfermeiro, estabilidade e sensibilidade após este procedimento.

Outros métodos, como a introdução de alvos de DNA de fita simples com sequências ligeiramente diferentes de ácidos nucléicos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como combinação de mutação de DNA e competição. Não se esqueça de que trabalhar com soluções de processo de microfabricação pode ser extremamente perigoso, e a proteção do corpo, olhos e mãos deve sempre alertar durante a execução deste procedimento.