In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

Este artigo descreve a microinjecção e a electroporação de testículo do rato in vivo, como uma técnica para a transfecção de células de testículo de rato para estudar os processos exclusivos da espermatogénese. O protocolo apresentado envolve os passos de preparação de capilar de vidro, através da conduta de microinjecção eferente, e transfecção por electroporação.

O objetivo deste procedimento é realizar microinjeção de construções genéticas no testículo de camundongo, seguida de eletroporação InVivo. Isso permite a realização de análises genéticas abrangentes com foco na espermatogênese e na função testicular. Isso é feito primeiro obtendo acesso ao testículo por meio de uma incisão abdominal diretamente acima das glândulas PrepU.

O segundo passo é preparar o ducto eferente anexado ao testículo para microinjeção, liberando o vaso de seu tecido adiposo. Em seguida, o ducto otorrinolaringológico é perfurado com uma pipeta de microinjeção carregada e a solução de construção genética da coloração é administrada aos túbulos ferosos testiculares. A etapa final é a transfecção por eletroporação multilateral do testículo.

Por fim, o testículo transfectado é extraído após três dias para avaliar a transfecção por microscopia de fluorescência ou por medições de luminômetro, dependendo das construções gênicas relatadas utilizadas. Esta combinação de técnica de operação de intelecto de microinjeção para testículos de camundongos como métodos de transfecção transitória certamente fornecerá muitas vantagens sobre as abordagens existentes, como animais transgênicos ou camundongos nocauteados. Garante um desempenho rápido, baixo custo e a necessidade de apenas habilidades técnicas moderadas.

Espera-se que essa abordagem metodológica seja sábia para a técnica disponível no campo da pesquisa sobre fertilidade masculina. Pode ser essencialmente útil para abordar um amplo espectro de questões relativas aos genis experimentais e aos processos de fertilidade. Isso seria particularmente possível ao usar este método para análise genética na forma de ganho de todos os experimentos de perda de função.

Presumivelmente, será muito útil também para investigar elementos regulatórios de, por exemplo, genes específicos da espermatogênese. Para iniciar o procedimento, anestesiar um camundongo macho de seis a oito semanas com uma mistura de 10% de cetamina e 2% de xilazina por via subcutânea. Em seguida, certifique-se de que o mouse esteja sob anestesia profunda beliscando o dedo do pé.

Aplique pomada nos olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, remova os pelos abdominais com um barbeador elétrico e desinfete a área cirúrgica em seguida. Faça uma incisão ventral diretamente acima das glândulas PrepU no centro da área abdominal.

Para isso, puxe a pele e faça um pequeno corte cutâneo transversal. Em seguida, continue ao longo da camada muscular abdominal. Puxe as almofadas de gordura abdominal com cuidado para expor o testículo anexado e coloque-o em um papel estéril no abdômen.

Posteriormente, use um microscópio estéreo para encontrar o ducto otorrinolaringológico para microinjeção. É a junção do vaso fino entre o testículo e o epidídimo e está localizada adjacente à artéria testicular. Remova o tecido adiposo que cobre o ducto otorrinolaringológico com uma pinça fina.

Depois disso, coloque o ducto de liberação em uma tira de papel estéril, garantindo que o ducto seja facilmente visível sem prejudicar o ambiente. Mais adiante, conecte a pipeta de microinjeção, que foi carregada com a solução de plasmídeo colorida antes, à unidade injetora do micromanipulador. Depois disso, coloque a agulha de microinjeção paralela ao ducto EENT com a ponta apontando para o testículo REIT.

Em seguida, use uma pinça fina para descascar o duto sobre a pipeta de microinjeção. Certifique-se de que a pipeta seja mantida paralela ao duto enquanto a puxa. Direcione a agulha cuidadosamente em direção ao testículo e pare assim que ela penetrar no testículo REIT diretamente abaixo da túnica albugínea.

Em seguida, defina os parâmetros do microinjetor. Posteriormente, comece a injetar a solução de construção do gene. Monitore todo o processo de injeção observando o status de enchimento dos testículos.

Com a ajuda da solução de plasmídeo colorido, construa o testículo apenas até dois terços de seu volume. Para permitir a eletroporação eficaz. Mergulhe os eletrodos da pinça em PBS de uma vez para garantir a condutância adequada.

Em seguida, aperte o teste ligeiramente entre os eletrodos úmidos e meça a resistência elétrica com o eletro parata. Em seguida, ajuste o eletro adequadamente, garantindo que a corrente possa ser aplicada ao testículo com um número total de oito pulsos quadrados. Em quatro locais diferentes do testículo, execute a eletroporação de forma abrangente ao redor de todo o testículo.

Após o término da eletroporação, coloque o testículo de volta no abdômen o mais próximo possível de sua localização original. Portanto, a camada muscular interna foi sutura cirúrgica absorvível. Em seguida, feche a pele com clipes de sutura.

Permita que o mouse se recupere da anestesia. Em uma caixa estéril aquecida em uma almofada térmica de 37 graus Celsius, preparada com algumas toalhas de papel. A almofada deve garantir o aquecimento de apenas metade da gaiola, criando um gradiente de calor.

Além disso, cubra o mouse com outra folha de papel toalha para reduzir ainda mais o estresse. Depois que o animal acordar completamente, transfira-o para uma nova gaiola limpa e completamente equipada. Mas mais recuperação, monitore o processo de recuperação até que você finalmente devolva o mouse ao biotério.

Esta figura mostra todos os testículos de Mount três dias após a eletroporação in vivo por detecção de fluorescência, os testículos transfectados de um camundongo C 57 preto de seis mostram proteína fluorescente verde aprimorada ou proteína fluorescente vermelha mostrada. Aqui estão as seções histológicas de um testículo. Três dias após a eletroporação unilateral com PE eeg, FPC um, as células tubiais seminíferas transfectadas são ilustradas por fluorescência verde, juntamente com sua estrutura típica esfericamente organizada.

Seus núcleos foram contra-corados com dois pró-três em azul. Enquanto você estiver realizando este procedimento, é importante ter em mente que os processos de identificação do ducto otorrinolaringológico e sua liberação de tecido adiposo são bastante sofisticados. Portanto, você pode praticar em animais mortos antes de realizar a experiência real in vivo.

Após o anti-procedimento de eletroporação por microinjeção e colheita de teste final, muitas técnicas são possíveis de serem realizadas, como navio Q-R-T-P-C-R e Western blotting. Portanto, o xingamento do gene do testador são padrões de expressão de proteínas, bem como modificações pós-traducionais, são garantidos. Assim, por meio dessas ferramentas, uma grande variedade de tópicos pode ser atacada, como a espermatogênese, por exemplo, com seus mecanismos e regulamentos complexos subjacentes.