Name: Isolamento de Murino Linfonodo células estromais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprenda a isolar células estromais de linfonodos murinos usando digestão enzimática com colagenase e DNase seguida de desagregação mecânica. Este método padronizado preserva a viabilidade celular e a expressão de moléculas de superfície para análise por citometria de fluxo.

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Os autores agradecem a Sanjiv Luther e colegas pelas discussões úteis no estabelecimento do atual protocolo de digestão de linfonodos. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas PPOOA-_119204 e PPOOP3_144918 da SNF para S.W.R.

Nesta publicação de vídeo e protocolo, todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovados pela Autoridade Cantonal Basel-Stadt, Suíça. 1. Linfonodos Preparação e Digestão <ol><li> Pré-aquecimento de água num copo a 37 ° C num agitador magnético com placa de aquecimento. </li><li> Prepare médio básico como se segue: DMEM (sem piruvato) suplementado com 2% de FCS, 1,2 mM CaCl2 e Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 ug de estreptomicina). </li><li> Esterilizar todos os instrumentos de dissecção antes do uso. </li><li> Eutanásia camundongos linfonodo doadores por asfixia com CO2 e assepticamente dissecar os gânglios linfáticos. Não dissecar a gordura ao redor. NOTA: Este protocolo é otimizado para o nó periférico de drenagem linfática da pele (inguinal, braquial, axilar). </li><li> Coloque gânglios linfáticos em uma placa de Petri esterilizada, contendo 2 ml de meio de base de gelo frio. </li><li> Interromper o linfonodo capsule usando duas agulhas 25 G fixos em 1 ml seringa. </li><li> Transferir o tecido de linfonodos interrompido num tubo de polipropileno de 5 ml de fundo redondo contendo 750 ul meio básico complementado com 1 mg / ml de colagenase IV, e 40 ug / ml de ADNase I. </li><li> Adicionar um agitador magnético estéril em cada tubo. </li><li> Colocar o tubo no recipiente com 37 ° C pré-aquecido de água e agita-se os tubos a uma velocidade lenta (1 volta / seg) durante 30 min. </li><li> Remover o tubo do agitador magnético com placa de aquecimento e deixar fragmentos de linfonodos resolver. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante enriquecido em &quot;células não-estromal&quot;. NOTA: Se a análise de T, B, células dendríticas e CD45 - gp38 - CD31 - está prevista, salvar a fração &quot;células não-estromais&quot;. </li><li> Lavar o tecido restante linfonodo uma vez com 750 ul meio básico. NOTA: Esta etapa é necessária somente se a trabalhar com camundongos imunocompetentes. </li><li> Vamos fragmentos de linfonodos resolver. </li><li> Remover ofracção flutuante de células não-estromal. </li><li> Adicionar aos fragmentos de nódulos linfáticos meio básico de 750 ul suplementadas com 3,5 mg / ml de colagenase D e 40 ug / ml de ADNase I. </li><li> Colocar o tubo de volta na taça que contém a 37 ° C pré-aquecido a água. </li><li> Digerir o tecido do linfonodo para 5 min, enquanto lentamente mexendo. </li><li> Linfáticos fragmentos de tecido nó desagregados por pipetagem e misturando 700 mL para 10 ciclos em máxima velocidade usando uma pipeta multicanal automatizada. NOTA: Isso atrapalha linfonodo para melhorar a digestão. </li><li> Colocar o tubo de volta no recipiente com água a 37 ° C pré-aquecido. </li><li> Fragmentos de tecidos de linfonodo Digest para mais 10 min, enquanto lentamente agitação. </li><li> Desagregar fragmentos de tecidos de nódulos linfáticos por pipetagem e mistura por 99 ciclos a velocidade máxima utilizando uma pipeta multicanal automatizada. </li><li> Adicionar 7,5 mL de 0,5 M de EDTA para garantir a manutenção da suspensão de célula única. </li><li> Fragmentos de tecidos de linfonodo desagregados por tubotting e mistura por 99 ciclos a velocidade máxima utilizando uma pipeta multicanal automatizada. </li><li> Adicionar meio básico de 750 ul e as células passam através de uma malha de nylon de 70 ^ m. </li><li> Centrifugar a suspensão de células de 5 min a 1500 xg, 4 ° C. </li><li> As células do estroma pode ser agora usado para posterior análise. </li></ol> 2 Coloração de Linfonodo células estromais <ol><li> Use uma combinação de anti-CD45, anti-podoplanina (gp38), os anticorpos anti-CD31 para reconhecer com sucesso células TRC, LEC, BEC e DN. </li><li> Incubar o tecido linfático nó digerido com vivo inoperante rastreador /, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) em 100 uL de HBSS contendo 2 % FCS para, pelo menos, 20 min, 4 ° C, no escuro. </li><li> Lave as células adicionando 500 l de HBSS contendo 2% de FCS </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 3 minutos a 1500 xg, 4 ° C. </li><li> Re-suspender em 100 uL de HBSS contendo 2% de FCS. </li><li> Executar as células marcadas num citómetro de fluxo equed, com as seguintes óptica: fonte de excitação com até três lasers: azul (488 nm, arrefecido a ar, de 20 mW de estado sólido), vermelho (633 nm, 17 mW HeNe), e violeta (405 nm, 30 mW de estado sólido) . </li><li> Portão de CD45 - células para excluir as células hematopoiéticas. </li><li> Singlets Portão (FSC-W) e de células vivas (VIVO / rastreador DEAD) para excluir doublets e células mortas. </li><li> Plot gp38 contra CD31 para visualizar TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) células (ver Figura 1) e DN (gp38 - - CD31). </li></ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stroma+in+the+initiation+and+control+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses.</a> Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cell+-+Immune+Cell+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal Cell - Immune Cell Interactions.</a> Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+lymphocyte+entry%2C+migration%2C+and+territoriality+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes.</a> Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).</li>
<li>Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+construct+the+stromal+reticulum+via+contact+with+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).</li>
<li>Malhotra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+stroma+from+inflamed+and+resting+lymph+nodes+defines+immunological+hallmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks.</a> Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).</li>
<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conduit+system+transports+soluble+antigens+from+the+afferent+lymph+to+resident+dendritic+cells+in+the+T+cell+area+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node.</a> Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).</li>
<li>MartIn-Fontecha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+to+the+draining+lymph+node%3A+impact+on+T+lymphocyte+traffic+and+priming%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming.</a> The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).</li>
<li>Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+the+chemokines+ELC+and+SLC+by+T+zone+stromal+cells+and+deletion+of+the+ELC+gene+in+the+plt%2Fplt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).</li>
<li>Braun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+lymph-derived+T+cells+and+DCs+use+different+chemokine+receptor+CCR7-dependent+routes+for+entry+into+the+lymph+node+and+intranodal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration.</a> Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+lymph+node+stromal+cells+reveals+site-dependent+differences+in+fibroblastic+reticular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells.</a> Frontiers in immunology. 2, 35(2011).</li>
<li>Lukacs-Kornek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+release+of+nitric+oxide+by+nonhematopoietic+stroma+controls+expansion+of+the+activated+T+cell+pool+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).</li>
<li>Siegert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+from+lymph+nodes+attenuate+T+cell+expansion+by+producing+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).</li>
<li>Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+priming+by+lymphoid+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell priming by lymphoid stroma.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).</li>
<li>Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+direct+local+differentiation+of+regulatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells.</a> Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).</li>
<li>Onder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+lymphotoxin-%CE%B2+receptor+signaling+is+critical+for+lymph+node+and+high+endothelial+venule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+directly+present+peripheral+tissue+antigen+under+steady-state+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions.</a> The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).</li>
<li>Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stroma+broaden+the+peripheral+tolerance+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm.</a> Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Lee, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+antigen+display+by+lymph+node+stroma+promotes+T+cell+tolerance+to+intestinal+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self.</a> Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).</li>
<li>Nichols, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+self-tolerance+to+a+melanocyte%2Fmelanoma+antigen+derived+from+tyrosinase+is+mediated+by+a+radio-resistant+cell+in+peripheral+and+mesenteric+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes.</a> J Immunol. 179, 993-1003 (2007).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+mediated+by+extrathymic+Aire-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells.</a> Science. 321, 843-847 (2008).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

O estudo das células do estroma dos nódulos linfáticos recentemente tornou-se um foco de investigação devido ao desenvolvimento de dois protocolos de digestão publicados 6,13. Ambos os protocolos são adequados para obter único nó de linfa de células estromais, mas diferem na utilização de enzimas de digestão e tempo de digestão. Uma vez que as células estromais e seus marcadores de superfície são sensíveis à digestão enzimática e tensão mecânica, um protocolo optimizado é necessária. <p class="jove_conten...

Os linfonodos são compartimentos especializados onde as respostas imunes adaptativas contra-antígenos próprios estrangeiros e são iniciadas e coordenadas. O processo aqui apresentado descreve uma digestão enzimática curto combinado com pipetagem automatizada mecânica para obter linfonodo suspensão de células individuais e obter acesso às células viáveis ​​do estroma de nódulos linfáticos, que mantêm a expressão de várias moléculas da superfície. Formar células do estroma linfonodo cadafalso do linfonodo e cumprir três funções principais: primeiro eles filtram líquidos do corpo para provar antígenos, patógenos e sua patógeno padrão molecular associado (PAMPs), bem como as citocinas e perigo associado padrão molecular (amortece) presente no corpo. Em segundo lugar, eles atraem e instruir as células apresentadoras de antígenos (APC) e linfócitos para interagir e iniciar respostas imunes adaptativas; e em terceiro lugar, que proporcionam um ambiente estrutural para a homeostase e diferenciação dos linfócitos 1-3. Durante a inflamação células do linfonodo estromais produzem fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas, adaptar-se, assim, o inchaço organizar a interação entre células dendríticas (DCs), T e células B. A orquestração das respostas imunitárias só é possível devido a arquitectura estrutural complexo formado por diferentes populações de células do estroma. As células do estroma de nódulos linfáticos são células CD45 negativas e pode ser distinguida da expressão de CD31 ou gp38 em células fibroblásticas e endoteliais 1 -6. GP38 + CD31 - define as células da zona T reticulares (TRC, também conhecidos como FRC: células fibroblásticas reticulares), gp38 + CD31 + define células endoteliais linfáticas (LEC), gp38 - CD31 + define as células endoteliais do sangue (BEC). Além disso, a caracterização das subpopulações revelou a existência de outras células do estroma de nódulos linfáticos. De facto, uma pequena população de células-pericyte como foi caracterizado nagp38 - CD31 - população 7. Portanto, a adaptação do procedimento de isolamento é vantajosa para a identificação e caracterização das propriedades funcionais diferentes de células do estroma de nódulos linfáticos. Antes do desenvolvimento de linfonodo células estromais digestão protocolos que o estudo de células estromais de linfonodos foi limitado a observações in situ usando secção de tecido e microscopia. No entanto, estudos estruturais e funcionais apresentaram características importantes de células estromais de linfonodos. As células do estroma de nódulos linfáticos são associados com podoplanina, colagénio e proteínas (ECM) de matriz extracelular de modo a formar uma estrutura tridimensional complexa 3 chamado sistema de conduta, a qual transporta as proteínas linfáticas e massa molecular associada menor do seio subcapsular do nó de linfa para o alto endotélio vênulas na zona de células T 8. DCs estão em contato com células do estroma e pode ser observado saliente no con tubularestrutura duit a amostra de fluido e detectar antigénios 8. A interação das células do estroma dos nódulos linfáticos (TRCs e LECs) com DCs é mediada pela liberação e apresentação das quimiocinas CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 são reconhecidos pelo receptor CCR7 facilitar DCs e as células T migrem para a zona das células T linfonodo 4,11. Apesar de usar quimiocinas semelhantes, as células T e DCs têm diferentes rotas de migração para os linfonodos 12. Mais tarde, utilizando a digestão enzimática do nódulo linfático e isolamento de células do estroma de nódulos linfáticos puros, estudos funcionais foram realizados sobre o papel dos diferentes células do linfonodo estroma e a sua capacidade para interagir com DC e células T / B 6,13. Em primeiro lugar, a interferência entre as células produtoras de IFN-T efectoras e células estromais γ nódulos linfáticos induz a produção do óxido nítrico metabolito mostrado para amortecer as respostas das células T e a proliferação dos órgãos linfóides secundários 14-16. Em segundo lugar, n linfaAs células do estroma ode ter sido relatado para suportar a diferenciação de subconjuntos de DC de regulação através da produção de IL-10, 17, e para modular a homeostase da célula T ingénuos através da produção de IL-7 6,18. Em terceiro lugar, a expressão de TLR em células do estroma de nódulos linfáticos sugerem que as células do estroma são susceptíveis ao sinal obtido a partir de uma infecção ou de auto-moléculas libertado durante a lesão de tecidos. De facto, o tratamento de células do estroma de nódulos linfáticos com o ligando de TLR3 de poli (I: C) induz uma regulação positiva modesta de grande expressão de histocompatibilidade classe I e complexa regulação positiva da molécula co-inibidor PD-L1, mas não das moléculas de co-estimulação, resultando em mudanças dramáticas no tecido periférico antígenos expressão 19. Diversos grupos têm apontado células do estroma dos nódulos linfáticos expressar antígenos de tecidos periféricos e induzir tolerância das células T auto-reactivas 19,21-27. Portanto, a compreensão das interacções entre células do estroma dos nódulos linfáticos e outro re migratório ecélulas do linfonodo sident vai ajudar a encontrar novas moléculas alvo para permitir a ativação ou supressão de respostas imunes durante a inflamação. Portanto, é necessária a implementação da separação enzimática publicado do linfonodo. Protocolos previamente publicados usar diferentes combinações de digestão enzimática à base de colagenase com baixo esforço mecânico 6,19,20. No entanto, longas incubações com enzimas da digestão ou a combinação de diferentes tipos de enzima de digestão pode prejudicar várias moléculas de superfície necessárias para analisar o status de ativação e identificar novas células estromais de linfonodos. Dependendo do tipo de análise de células do estroma, o protocolo de ligação ou Fletcher protocolo pode ser mais adequado. No processo descrito, de uma digestão enzimática ligeiramente mais curto é combinado com a desagregação mecânica automatizado para minimizar a degradação da superfície marcador linfáticos viável células estromais nó. Este procedimento permite que o isolamento altamente reprodutível edistinção de nódulos linfáticos de populações de células do estroma com uma baixa variabilidade e de mais do que 95% de viabilidade. As células do estroma de nódulos linfáticos isolados de fresco pode ser usado directamente para a expressão do marcador de superfície, a análise de proteínas, e estudos de transcrição, bem como o estabelecimento de linhas de células estromais de realizar os ensaios funcionais in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Concentração final 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>Concentração final 1,2 mM</td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>>160 unidades por mg de peso seco, uso na concentração final de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>de colagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>uso a 3,5 mg/ml</td></tr><tr><td>de DNAse I</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11284932001</td><td>uso em 40 e micro; g/ml</td></tr><tr><td>Ímãs de agitação</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm de comprimento-2 mm &oslash;</td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de poliestireno 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético com função de aquecimento</td><td>IKA-RCT-standard</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 100 mm, agulhas estéreis</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25 G</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-rato CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>anti-rato CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>anti mouse Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>anti mouse CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, Multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &micro; l volume máximo</td></tr><tr><td>anti-rato CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>anti-rato CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>anti-rato CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>anti-rato I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>anti-rato CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>VIVO/MORTO corrigível Kit de coloração de células mortas de infravermelho próximo</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de murino linfonodo células estromais

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Os órgãos linfóides secundários, incluindo os linfonodos, são compostos de células estromais que fornecem um ambiente estrutural para a homeostase, ativação e diferenciação dos linfócitos. Vários subconjuntos de células estromais foram identificados pela expressão da molécula de adesão CD31 e glicoproteína podoplanina (gp38), células reticulares da zona T ou células reticulares fibroblásticas, células endoteliais linfáticas, células endoteliais do sangue e pericitos semelhantes a FRC dentro da população de células duplamente negativas. Para todas as populações, diferentes funções são descritas, incluindo separação e revestimento de diferentes compartimentos, atração e interação com diferentes tipos de células, filtração dos fluidos de drenagem e contração dos vasos linfáticos. Nos últimos anos, diferentes grupos descreveram um papel adicional das células estromais na orquestração e regulação das respostas das células T citotóxicas potencialmente perigosas para o hospedeiro. 
Os linfonodos são estruturas complexas com muitos tipos de células diferentes e, portanto, requerem um procedimento apropriado para o isolamento das populações de células desejadas. Atualmente, os protocolos para o isolamento de células estromais linfonodais dependem da digestão enzimática com tempos de incubação variados; no entanto, as células estromais e suas moléculas de superfície são sensíveis a essas enzimas, o que resulta em perda de expressão de marcadores de superfície e morte celular. Aqui, é proposto um protocolo de digestão enzimática curto combinado com interrupção mecânica automatizada para obter uma suspensão viável de células monocelulares de células estromais linfonodais, mantendo sua expressão de moléculas de superfície.

O presente protocolo é um protocolo de digestão modificada publicada por ligação et al., 2007 6 com um menor tempo de digestão (45 minutos no máximo), devido à desagregação mecânica com uma pipeta multicanal automatizado. Além disso, o processo é mais padronizado, minimiza a degradação de marcadores de superfície em diferentes células do estroma de nódulos linfáticos e permite a manipulação de mais de uma amostra ao mesmo tempo. Colagenase IV e colagenase D em links de pr...

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células estromais dos linfonodos. Isso é feito primeiro interrompendo a cápsula do linfonodo. Na segunda etapa, os fragmentos de linfonodos são digeridos com colagenase quatro e D nase um.As enzimas são então substituídas por colagenase D e D nase, e os fragmentos são mecanicamente desagregados com uma pipeta multicanal automatizada. Em última análise, a expressão da molécula de superfície celular das células linfonodais isoladas pode ser caracterizada por citometria de fluxo. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que, com este método, as células SHR do linfonodo são digeridas usando um procedimento enzimático padronizado complementado por desagregação mecânica que preserva a viabilidade e a expressão da molécula de superfície das células.Comece colocando os gânglios linfáticos dissecados em uma placa de Petri estéril contendo dois mililitros de meio gelado. Em seguida, use duas seringas de um mililitro equipadas com agulhas de calibre 25 para interromper as cápsulas dos linfonodos. Em seguida, transfira o tecido interrompido para um tubo cônico de cinco mililitros contendo 750 microlitros de meio, suplementado com colagenase quatro e DNA um e uma agitação magnética.Em seguida, coloque o tubo em um béquer contendo água pré-aquecida a 37 graus Celsius em um agitador magnético e agite as pastas das células uma rodada por segundo por 30 minutos. Depois de mexer, deixe o fragmento do linfonodo assentar e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Agora enriquecido para células não estromais, transfira para os fragmentos de linfonodos 750 microlitros de meio fresco, suplementado com colagenase D e D nase, e depois agite o tecido por mais cinco minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, use uma pipeta multicanal automatizada para desagregar os fragmentos de tecido do linfonodo em um volume de 700 microlitros por 10 ciclos na velocidade máxima e, em seguida, agite os fragmentos de tecido novamente após 10 minutos. Além disso, desagregue os aglomerados de tecido com a pipeta multicanal automatizada por 99 ciclos na velocidade máxima. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de EDTA 0,5 molar ao tubo e misture a suspensão de tecido por mais 99 ciclos com a pipeta automatizada.Após o último ciclo de desagregação, adicione 750 microlitros de meio à solução celular e filtre as células através de uma malha de nylon de 70 micrômetros. Em seguida, pulverize as células por cinco minutos a 1500 Gs e quatro graus Celsius. Para visualizar as populações de células estromais de linfonodos por citometria de fluxo, core as amostras de células apropriadas com rastreador de mortos vivos e os anticorpos de interesse em 100 microlitros de HBSS contendo 2%FCS por pelo menos 20 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Em seguida, lave as células em 500 microlitros de HBSS com FCS e ressuspenda. Os pellets em 100 microlitros de HBSS e FCS executam as células em um citômetro de fluxo que bloqueia as células positivas do CD 45 para excluir as células hematopoiéticas e, em seguida, marcham na população singlete viva. Finalmente, plote GP 38 versus CD 31 para visualizar as células reticulares da zona T, células endoteliais linfáticas, células endoteliais do sangue e células duplamente negativas.Populações de células. O número total de células recuperadas após a digestão dos subconjuntos de células estromais linfonodais foi ligeiramente maior no protocolo recém-demonstrado em comparação com os protocolos link e Fletcher, demonstrando que a viabilidade das células estromais linfonodal após o isolamento por este protocolo é semelhante àquela recuperada usando protocolos publicados. As células reticulares da zona T e as células endoteliais linfáticas isoladas por meio deste e dos protocolos de ligação e Fletcher foram comparadas para a expressão de IAB CD one 40 a CD 80, PD L one e CD 40.A expressão de todas as cinco moléculas de superfície foi maior após a digestão com o protocolo recém-demonstrado e o protocolo de ligação para ambos os subconjuntos de células estromais, sugerindo que a degradação de algumas moléculas de superfície pela colagenase quatro e D é menos robusta do que com a colagenase p e o espaço DYS. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar com sucesso as quatro principais subpopulações de células do estroma dos linfonodos, preservando a expressão de várias moléculas de superfície úteis para sua caracterização e análise posteriores.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolamento de linfócitos usando a Miltenyi MACs kit é uma maneira confiável para purificar as células de todo homogeneizados de tecido linfóide. Células purificadas usando o sistema Miltenyi são tipicamente ≥ 96% pura. Aqui, nós demonstrar as medidas tomadas para isolar células CD4 + T, um dos muitos kits oferecidos pela Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de...

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

A geração de quimeras de linfonodos/fat pad para o estudo da origem das células estromais dos linfonodos é descrita. O método envolve o isolamento de linfonodos de camundongos recém-nascidos e bolsas de gordura embrionárias, a geração de bolsas de gordura quiméricas para linfonodos e sua transferência sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro.

Geração de Quimeras de Almofada de Gordura de Linfonodo para o Estudo da Origem das Células Estromais de Linfonodos

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Este protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia mesentérica murina segura e bem tolerada em cada uma das quatro estações ao longo da cadeia do linfonodo mesentérico. Esse procedimento é adaptável para permitir a interrupção seletiva da comunicação linfática com o cólon distal, cólon proximal e/ou intestino delgado.

Linfodenectomia mesentérica murina para interrupção seletiva da comunicação linfática com intestino específico de região

Aprenda a isolar células estromais de linfonodos murinos usando digestão enzimática com colagenase e DNase seguida de desagregação mecânica. Este método padronizado preserva a viabilidade celular e a expressão de moléculas de superfície para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

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