Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células estromais dos linfonodos. Isso é feito primeiro interrompendo a cápsula do linfonodo. Na segunda etapa, os fragmentos de linfonodos são digeridos com colagenase quatro e D nase um.

As enzimas são então substituídas por colagenase D e D nase, e os fragmentos são mecanicamente desagregados com uma pipeta multicanal automatizada. Em última análise, a expressão da molécula de superfície celular das células linfonodais isoladas pode ser caracterizada por citometria de fluxo. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que, com este método, as células SHR do linfonodo são digeridas usando um procedimento enzimático padronizado complementado por desagregação mecânica que preserva a viabilidade e a expressão da molécula de superfície das células.

Comece colocando os gânglios linfáticos dissecados em uma placa de Petri estéril contendo dois mililitros de meio gelado. Em seguida, use duas seringas de um mililitro equipadas com agulhas de calibre 25 para interromper as cápsulas dos linfonodos. Em seguida, transfira o tecido interrompido para um tubo cônico de cinco mililitros contendo 750 microlitros de meio, suplementado com colagenase quatro e DNA um e uma agitação magnética.

Em seguida, coloque o tubo em um béquer contendo água pré-aquecida a 37 graus Celsius em um agitador magnético e agite as pastas das células uma rodada por segundo por 30 minutos. Depois de mexer, deixe o fragmento do linfonodo assentar e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Agora enriquecido para células não estromais, transfira para os fragmentos de linfonodos 750 microlitros de meio fresco, suplementado com colagenase D e D nase, e depois agite o tecido por mais cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, use uma pipeta multicanal automatizada para desagregar os fragmentos de tecido do linfonodo em um volume de 700 microlitros por 10 ciclos na velocidade máxima e, em seguida, agite os fragmentos de tecido novamente após 10 minutos. Além disso, desagregue os aglomerados de tecido com a pipeta multicanal automatizada por 99 ciclos na velocidade máxima. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de EDTA 0,5 molar ao tubo e misture a suspensão de tecido por mais 99 ciclos com a pipeta automatizada.

Após o último ciclo de desagregação, adicione 750 microlitros de meio à solução celular e filtre as células através de uma malha de nylon de 70 micrômetros. Em seguida, pulverize as células por cinco minutos a 1500 Gs e quatro graus Celsius. Para visualizar as populações de células estromais de linfonodos por citometria de fluxo, core as amostras de células apropriadas com rastreador de mortos vivos e os anticorpos de interesse em 100 microlitros de HBSS contendo 2%FCS por pelo menos 20 minutos a quatro graus Celsius no escuro.

Em seguida, lave as células em 500 microlitros de HBSS com FCS e ressuspenda. Os pellets em 100 microlitros de HBSS e FCS executam as células em um citômetro de fluxo que bloqueia as células positivas do CD 45 para excluir as células hematopoiéticas e, em seguida, marcham na população singlete viva. Finalmente, plote GP 38 versus CD 31 para visualizar as células reticulares da zona T, células endoteliais linfáticas, células endoteliais do sangue e células duplamente negativas.

Populações de células. O número total de células recuperadas após a digestão dos subconjuntos de células estromais linfonodais foi ligeiramente maior no protocolo recém-demonstrado em comparação com os protocolos link e Fletcher, demonstrando que a viabilidade das células estromais linfonodal após o isolamento por este protocolo é semelhante àquela recuperada usando protocolos publicados. As células reticulares da zona T e as células endoteliais linfáticas isoladas por meio deste e dos protocolos de ligação e Fletcher foram comparadas para a expressão de IAB CD one 40 a CD 80, PD L one e CD 40.

A expressão de todas as cinco moléculas de superfície foi maior após a digestão com o protocolo recém-demonstrado e o protocolo de ligação para ambos os subconjuntos de células estromais, sugerindo que a degradação de algumas moléculas de superfície pela colagenase quatro e D é menos robusta do que com a colagenase p e o espaço DYS. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar com sucesso as quatro principais subpopulações de células do estroma dos linfonodos, preservando a expressão de várias moléculas de superfície úteis para sua caracterização e análise posteriores.