Name: Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprenda a visualizar a endocitose mediada por clatrina em células vivas usando microscopia TIRF. Este método permite quantificar a dinâmica de invaginações individuais para estudar receptores acoplados à proteína G.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. C. Szalinski, H. Teng e M. Bruchez pela ajuda com Imaris, R. Vistein e D. Shiwarski pela ajuda e aconselhamento técnico, e ao Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin e Dr. W Almers pelos reagentes e discussão útil. O financiamento fornecido pela concessão T32 NS007433 para SLB e NIH DA024698 e DA036086 para MAP.

1 Expressão de fluorescência Tagged CME Componentes em células cultivadas HEK293 são células modelo útil que têm sido usados ​​extensivamente para estudar biologia GPCR e endocitose, e, portanto, são utilizados como modelos neste protocolo. Usar qualquer protocolo de transfecção proporcionando expressão uniforme sem superexpressão e baixa citotoxicidade. <ol><li> Pega de toda a cultura de células numa câmara de fluxo laminar estéril. Encha 4 cavidades de uma placa de 12 poços com 1 ml de Dulbecco Modificado meio essencial (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). A partir de um frasco de T25 confluente de células HEK293 diluir 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, respectivamente, em cada um dos quatro poços. <ol><li> Alternativamente, as células semente de uma placa multi-poços de tamanho desejado, de acordo com as instruções do fabricante. Semente 0,4-2 x 10 4 células para uma placa de 12 poços. Crescer as células durante a noite em um estéril 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade. NOTA: Considerando-se que o crescimento rates variam de acordo com as condições e linhas de células, pode ser preferível para semear vários poços para garantir confluência ideal para transfecção no dia seguinte ou a possibilidade de realizar transfections em duplicado. </li></ol></li><li> Na manhã seguinte, selecione um bem que é de aproximadamente 70% confluentes para transfecção (ver Figura 1B). Se nenhum bem chegou a este estado, esperar mais um dia. NOTA: 70% de confluência é ideal para células HEK293. Transfecção de células de que são resultados mais escasso em morte celular e toxicidade. Transfecção de células confluentes sobre-expressão resulta em fraca. </li><li> Adicionar 60 ul de tampão CE (kit de transfecção), 400 ng dos plasmídeos que codificam para os GPCRs etiquetado e / ou de componentes da maquinaria de clatrina e 2,4 ul de potenciadora no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como descrito no protocolo do fabricante. Vórtice durante 2 segundos para assegurar uma mistura suficiente, e girar numa microcentrífuga a 2000 xg durante 2 segundos para recolher o líquido, na parte inferior. </li><li> Adicionar6 ul Effectene como descritos no protocolo do fabricante. Vortex durante 2 segundos, e rotação a 2.000 x g durante 2 segundos numa microcentrifuga para recolher o líquido, na parte inferior. Esperar durante 20 min para permitir a formação de micelas de complexos de transfecção. </li><li> Aspirar mídia do bem a ser transfectada. Adicionar cuidadosamente 0,8 ml de DMEM com FBS a 10% para a mistura de reagente de transfecção e misturar por pipetagem para cima e para baixo, lentamente, para reduzir a quebra das micelas. Adicionar a mídia e mistura de transfecção para o bem muito lentamente de lado. Adicionar qualquer mistura de transfecção restante do tubo de microcentrífuga para o poço utilizando uma micropipeta. NOTA: Se necessário, adicionar um extra de 0,5 ml de DMEM com FBS a 10% para o bem transfectado para dar as células de alimento extra resultando em transfecção suave e menor expressão transitória. </li><li> Retorne as células para o 37 ° C incubadora por 5 horas. </li><li> Aspirar mídia contendo a mistura de transfecção. Substituir com 1 ml de DMEM com 10% de FBS. Permitiras células a crescer durante a noite. </li><li> No dia seguinte, as células passam a lamelas não revestidos, previamente esterilizado em autoclave. <ol><li> Adicionar 0,5 ml de Tampão Fosfato Salino (PBS) com EDTA a 1 mM a cada poço. Alternativamente, usar 0,5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Deixar na incubadora durante 1 min. </li><li> Coloque 3 round, estéreis 25 milímetros lamelas nas cavidades de uma placa de 6 poços. Encher cada poço com 2 ml de meio. Empurre a lamela para baixo para o fundo do poço, para evitar que as células que crescem na parte inferior da lamela. </li><li> Agitar manualmente o bem para retirar as células a partir do fundo do poço. Adicionar 1 ml de DMEM com 10% de FBS para ressuspender. Distribua as células levantadas a partir de um poço de uma placa de 12 poços uniformemente entre os três lamelas. Alternativamente, placa células em 3 pratos com fundo de vidro. </li></ol></li><li> Permitir que as células crescem sobre as lamelas durante pelo menos 48 horas antes da imagiologia. Certifique-se de que as células estão espalhados e plana. </li></ol> 2.Imagem CCP e carga Dynamics Usando TIRFM <ol><li> Anticorpos anti-FLAG M1, conjugado com Alexa utilizando corantes Alexa Fluor kit de marcação de proteínas de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, os anticorpos pré-conjugados podem ser comprados. </li><li> Pré-incubar células com os anticorpos a uma diluição de 1: 1.000 em 1 ml de meio pré-aquecido Leibovitz com FBS a 10%, ou de Opti-MEM com 50 mM de HEPES pH 7,4 e 10% de FBS durante 10 min a 37 ° C (imagiologia meio), para etiquetar GPCRs marcaram-FLAG na superfície da célula. Ir estes passos se proteínas fluorescentes geneticamente codificados, como GFP, são usados ​​como marcas (veja a discussão para mais detalhes). </li><li> Transfira a lamela para uma câmara de imagem ao vivo de células. Alternativamente, para pratos com fundo de vidro, aspirado media de rotulagem anticorpo e adicionar 700 mL de meio de imagens pré-aquecido. <ol><li> Utilizar um par de pinças e dobrar a ponta de uma agulha de calibre 25 num gancho. </li><li> Segure um par de fórceps na mão dominante. Segure a agulha torta na other. Vire a agulha até que as curvas de gancho baixo em direção ao vidro. Suavemente arraste agulha, o lado do gancho para baixo, através da parte inferior de uma placa de 6 poços até que engancha na lamela. Tome cuidado para não arranhar a superfície da lamela, uma vez que irá retirar células. Suavemente elevar a lamela acima do fundo do poço. Equilibre a lamela contra a parede do poço para o apoio. </li><li> Utilizar as pinças para agarrar perto da extremidade da lamela e mover o lado das células lamela até a câmara de imagem, e montar a câmara. Adicionar 700 mL (ou quantidade adequada) de meio de imagem pré-aquecido. Lidar com as lamelas com cuidado, sem pressão para evitar rachar ou quebrar. </li></ol></li><li> Transferir a câmara para o microscópio e manter a temperatura das células a 37 ° C utilizando um aquecedor de fase ou numa incubadora fechada. </li><li> Traga células em foco usando um objetivo de imersão em óleo 100X ou 60X TIRF (1,45 NA ou acima). Imagem das células em epifluorescência convencional ou conmodos focais de iluminação (ou seja, não TIRFM) para identificar as células que expressam as construções adequadas. Fora de foco células são quase invisíveis na profundidade fina de iluminação TIRF tornando difícil encontrar o plano focal e células. NOTA: Alguns sistemas utilizam os mesmos lasers para TIRFM a imagem em epifluorescência convencional, movendo o ângulo de incidência do laser acima do ângulo crítico. Como uma importante medida de segurança, sempre estar ciente do ângulo do feixe de laser, e sempre dirigi-la longe do observador. </li><li> Concentre-se para baixo para a superfície de fundo de uma célula que expressa até o contorno da membrana plasmática em torno da célula desaparece e o centro da célula aparece. Isto é mais aparente com uma proteína da membrana plasmática de carga localizada, tal como o receptor μ-opióide (ver Figura 2A). </li><li> Mudar para TIRF imagem. <ol><li> Se utilizar os mesmos lasers para formação de imagens de epifluorescência convencional, aumentar o ângulo de incidência dalaser de fluorescência até que fora de foco no interior da célula desaparece, e sem contorno da membrana plasmática em torno da célula é visto. (Compare Figura 2C às Figuras 2A e 2B) NOTA: Em TIRFM, movendo-se no plano focal faz com que a imagem para ir completamente fora de foco e / ou fraca, e os níveis globais de fluorescência diminui devido à menor profundidade de iluminação. Por isso, um método alternativo para a alternar a iluminação TIRFM é primeiro foco no centro da célula de epifluorescência confocal / convencional, então, aumentar o ângulo de incidência até perder a maior parte da fluorescência, e depois concentrar-se para baixo para a membrana plasmática. </li><li> Uma vez em TIRFM, garantir a laser de excitação reflete de volta através do objectivo e não é visível acima do objetivo. Confirme isso verificando se o ponto de laser é visível. NOTA: Nos modos de epifluorescência ou confocal convencional, a iluminação laser é visível acima do objetivo,tal como no teto. </li><li> Limitar o foco para obter uma imagem nítida. Os principais componentes da maquinaria endocítica, como clathrin, será visível nos pontos lacrimais. Ajuste o foco no bem, por isso os pontos lacrimais são tão redonda quanto possível. NOTA: Para carga localizada à membrana, ajustar o foco bem até que o filopodia aparecer distintos. </li><li> Use um programa de aquisição de salvar todos os parâmetros de imagem, como espelhos e ângulo TIRF. Faça isso para todos os comprimentos de onda necessários. </li></ol></li><li> Digitalizar torno da lamela para encontrar as células que expressam todos os marcadores de endocitose desejadas: o receptor μ-opióide e o adaptador β-arrestina, no exemplo mostrado na Figura 3A. Selecione as células que estão expressando, mas não sobre-expressão. Veja a discussão para mais detalhes. </li><li> Uma vez que as células são identificadas, adquirir imagens a cada 3 s por 10 min. Isso é suficiente para captar a vida de uma CCP, uma vez que o tempo médio de vida de um CCP em células HEK293 fotografada nessas condições é around 40 seg 10-11. Isso permite que cerca de 12-14 quadros para observar o PCC. Por exemplo, ver filme 1. Repita todas as etapas de imagem células adicionais. </li></ol> 3 Análise de endocítica Dynamics por verificação manual Embora a verificação manual do PCC vidas é muito limitado pelo número de câmaras de compensação que podem ser detectados, ainda continua a ser um meio preciso de detecção implacável pelas mudanças globais na imagem e detecção de artefatos. Veja a discussão para mais detalhes. <ol><li> Abra o arquivo no ImageJ. As imagens são armazenadas como uma única pilha de arquivos TIFF com canais intercalados. Converta imagens para hyperstacks. Vá em Image&gt; Hyperstacks&gt; pilha para hyperstack. Digite o número de canais adquiridos (ou seja, se as imagens β-arrestin eo receptor μ-opióide, digite 2), Digite 1 para a pilha Z (TIRFM é um único plano), eo número de quadros do filme (ou seja, a 10 min filme em um quadro a cada 3 s is 200) na janela pop-up. </li><li> O formato hyperstack produz uma janela com duas barras de rolagem. Use a barra superior para percorrer os canais e parte inferior para mover através do tempo. Vá até o canal da proteína cuja vida útil será analisada. </li><li> Mover para enquadrar 10 ou 15 do filme para reduzir a inclusão de CCPs pré-existente cujo tempo inteiro não são visíveis. Desenhe uma caixa de ROI em torno de um ponto escolhido ao acaso. </li><li> Conte o número de quadros de um local é visível. NOTA: Ver Figura 3B e 3C para exemplos de três categorias morfológicas de eventos endocíticas 10,11,16-19. </li></ol> 4 Análise de endocítica Dynamics pelo reconhecimento objectivo Objectivo reconhecimento permite a detecção de praticamente todos os CCPs fotografada em uma célula, mas pode ser sujeita a erros, devido à detecção de estruturas espúria erróneos. Veja a discussão para mais detalhes, pesando as vantagens e desvantagens do emétodo ach. Vários programas, incluindo algoritmos de custom-built, pode ser usado para detectar objetivamente CCPs. Este protocolo descreve o reconhecimento objetivo de CCPs usando Imaris, um software de análise de imagens (ver Materiais). <ol><li> Para começar, abra o arquivo de imagem RAW no software de análise de imagens. Por padrão, aparece uma imagem de cor mesclada. Use a janela &quot;Ajuste de Display&quot; para ajustar o brilho de um canal. Clique sobre o nome de um canal para alterar a cor exibida. Desmarque a caixa ao lado do canal para evitar a sua exposição (veja a Figura 4A). </li><li> Criar &quot;spots&quot;, clicando no ícone com manchas laranja. Veja a figura 4B. Selecione uma região de interesse (ROI) em torno da célula. Ver Figura 4C. Use um ROI para excluir áreas que irão detectar incorretamente bordos de ataque brilhantes e placas. Analisar várias células com diferentes níveis de expressão separadamente. </li><li> Meça o diâmetro de um local para proviestimativas iniciais para o algoritmo de. Alternar para o modo &quot;Slice&quot;, e clique em extremidades polares de um ponto para medir seu diâmetro. Ver Figura 4E. Faça isso por 4 ou 5 pontos redondos que parecem indicativo de uma CCP, no auge de sua estabilidade, após a formação e antes de cisão. Use essas medidas para calcular o diâmetro médio até o décimo mais próximo de um mícron. </li><li> Detectar pontos. Voltar ao modo &quot;Superar&quot;. Selecione o canal apropriado para a detecção. Digite o diâmetro médio medido, geralmente 0,3 ou 0,4 m. Clique na seta azul para a frente para quantificar as manchas. Ver Figura 4E. Se o diâmetro dos pontos é subestimada, pontos espúrios de fluorescência será identificado como Spots. Se o diâmetro for demasiado grande, os verdadeiros Spots serão ignorados. Quando em dúvida, estimar um pouco menor, e filtrar as detecções incorretas depois. </li><li> Filtre Spots de Qualidade. Ajuste o filtro para capturar o maior número de pontos possível sem voltachão. O filtro de qualidade é selecionado por padrão 20. Ver Figura 4F. <ol><li> Use a curva de &quot;qualidade&quot; como um guia para definir um limiar adequado. Mova o limite inferior do filtro com o botão esquerdo do mouse para este primeiro mergulho na curva. Este é um bom ponto de partida para o filtro, pois esta posição normalmente refina detecção de Spots apenas visíveis. Ver Figura 4F. </li><li> Spots detectados aparecem no filme como esferas ou centro de pixels. Usando a aba &quot;Cores&quot;, ajustar a cor das manchas de uma cor contrastante para torná-lo mais fácil de vê-los. Percorra o filme para rever os pontos em cada quadro. O objetivo é detectar o maior número de pontos possível para a totalidade de suas vidas. </li><li> Elimina Pontos dimmer ou manualmente conectá-los em faixas contínuas, mais tarde, como eles não são detectados bem com o curso de suas vidas. </li><li> Remover placas brilhantes com um fil &quot;Intensidade&quot;ter, se necessário. Clique no sinal de mais verde para adicionar um novo filtro. Ver Figura 4F. Criar um filtro de Intensidade para filtrar ou reduzir Spots de uma dada sinais de fluorescência. Use a curva gerada Intensidade, (análoga à curva de qualidade discutido em 4.5) para definir o limite. Use o botão esquerdo do mouse para remover o extremo esquerdo da curva que representa os pontos mais brilhantes. NOTA: As grandes estruturas de placas são geralmente entre os elementos mais brilhantes do celular, e eles são facilmente excluídos com este filtro. </li><li> Percorrer o filme para assegurar que as CPCs são detectadas como pontos mais brilhantes e as placas não são mais detectadas. Figura 3D mostra uma célula em que a detecção de PCC (denotado por esferas brancas) foi optimizado com o filtro de qualidade, e as placas foram excluídos com a qualidade filtro. </li><li> Reduzir as arestas de células vivas com o filtro de qualidade. Objectos brilhantes ainda pode necessitar de ser removidas manualmente, na etapa seguinte. Continue com o azularrow. </li><li> Remover manchas anormais na tela Spots Editar. Mudar para &quot;Selecionar&quot; mode. Clique no local. Ele vai se transformar amarelo. Clique em &quot;Excluir&quot;. Clique na seta azul para continuar a construir o algoritmo. Ver Figura 4G. </li></ol></li><li> Faixas medida. Jogo de pistas &quot;movimento Browniano.&quot; O CCP não devem exibir qualquer movimento dirigido, só deriva mínima, através da membrana plasmática. Este algoritmo é o mais adequado para esse movimento. Ver Figura 4H. <ol><li> Defina a Distância Máxima para um pequeno valor como 0,7 m. Ver Figura 4H. NOTA: A definição de uma distância pequena minimiza ligação de pontos adjacentes e ainda permite monitoramento contínuo de um ponto célula através CCP ou movimento celular. </li><li> Defina Max Gap Tamanho para 1 Isso permite uma faixa para continuar se houver falta na sucessão apenas um quadro. Clique na seta azul para calcular as faixas. Ver Figura 4H. NOTA: Gtamanhos ap de mais de 3 faixas diferentes causas para ser incorretamente ligados entre si. </li><li> Mudar de faixa de visualização para &quot;Dragon Tail.&quot; Percorra o filme observando a qualidade de detecção. Se manchas adjacentes estão ligados, diminuir a distância máxima inferior a 0,7 ^ m. Se Spots estão sendo divididos muito rapidamente, aumentar a Max Gap Size. Clique na seta azul para criar faixas. Isto leva à tela de faixas de filtro. Ver Figura 4H. </li></ol></li><li> Filtro faixas e dados de exportação. Use um &quot;Intensidade&quot; filtro para remover placas brilhantes adicionais. Use um &quot;deslocamento&quot; filtro para remover endosomes que entram no campo TIRF. Tenha cuidado, como manchas mais longos terão deslocamentos mais longos também. Clique na seta dupla verde para completar o protocolo. Ver Figura 4I. <ol><li> Use a guia editar faixas, com o ícone de lápis, para remover detecções de falsos positivos de faixas que não puderam ser removidos através de filtros. Verifique se há discontinuities ou ligações falsas. Para conectar duas faixas, selecione-os usando Ctrl-botão esquerdo do mouse, em seguida, clique em &quot;Connect&quot; na caixa de edição Tracks. Para desligar faixas em pontos separados, selecionar uma faixa e clique em &quot;Disconnect&quot;. Selecionar vários pontos com Ctrl + botão esquerdo do mouse e clique em &quot;Connect&quot; para criar uma nova faixa. O método é o mesmo para os pontos de edição, descritas em 4.5.7. Ver Figura 4J. </li><li> Para exportar os dados, vá para a guia Estatísticas. Clique no ícone de um disquete para exportar a estatística selecionada. Clique no ícone que se parece com uma série de disquetes para exportar todas as estatísticas. A estatística &quot;Track Duração&quot; contém o comprimento das faixas de endocitose. Ver Figura 4K. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui descreve-se a utilização de TIRFM visualizar clatrina mediada por endocitose (CME) ao nível das CCP indivíduo em células vivas em tempo real. CME é um evento rápido e altamente dinâmica mediada pelo efeito cumulativo de muitas espacial e temporalmente distintos eventos individuais. A maioria dos ensaios que são usadas atualmente, como dosagens bioquímicas de internalização usando biotinilaï¿½ï¿½o superfície ou de ligação do ligando, citometria de fluxo ou células ensaios de medição fixa quantidade de proteínas inte...

O processo de endocitose mediada por clatrina (CME) é dependente da chegada oportuna dos diversos componentes da maquinaria de endocitose mediada por clatrina para recolher a carga e manipular a membrana plasmática para as vesículas 1-3. CME é iniciada por proteínas deformantes membrana e do adaptador de carga que se juntam em locais de nascentes de endocitose 1. Estas proteínas recrutar o clathrin capa protéica, que reúne em uma estrutura de gaiola que forma o poço revestido de clatrina (CCP) 4. Uma vez que o PCC está totalmente montados em uma forma esférica, cisão membrana, principalmente através da ação do grande GTPase, dynamin, gera vesículas revestidas por clatrina livres (ccvs) 5,6. Esta internalização desencadeia rápida desmontagem do revestimento de clatrina, permitindo que os componentes a serem re-utilizados para múltiplos ciclos de CME. A descoberta e caracterização das proteínas envolvidas no CME foi enraizada na Bioch tradicionalemical, genéticos e técnicas de microscopia 4-6,8. Estes ensaios têm elucidado as funções e pontos de interação destes componentes endocíticas. Embora muito útil para a definição de componentes essenciais de máquinas tráfico, estes ensaios são muito limitados em capturar o comportamento dinâmico de componentes CME ou concentração de carga. Esta é uma limitação fundamental, uma vez CME é impulsionada pela montagem coreografada por conjuntos de módulos de proteína em etapas definidas, e uma vez que pequenas alterações na dinâmica dos eventos endocíticas individuais podem ter grandes conseqüências cumulativas sobre endocitose. Além disso, dados recentes indicam que as CPCs individuais podem diferir tanto na composição como no comportamento, o que sugere que a regulação fisiológica do presente processo é altamente espacialmente e temporalmente restrita 9-14. Visualizando eventos endocíticas individuais, portanto, é essencial para entender por que há várias proteínas redundantes envolvidas na CME e como essas proteínas podem ser controlados bsinais fisiológicos y para regular a internalização de carga. Aqui descreve-se a utilização de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRFM) para observar o CME ao nível da dinâmica de CPCs individuais em células vivas. TIRFM baseia-se na diferença de índice de refracção entre a lamela de vidro e para o ambiente fluido de células 15,16. Quando a luz de excitação é dirigida para as células em mais do que o ângulo crítico, é reflectida internamente, gerando uma onda evanescente, que mantém uma área de iluminação fina que se estende, aproximadamente, de 100 nm acima da lamela. Isso garante que apenas as moléculas fluorescentes dentro desse estreito campo está animado. Na prática, isto permite a excitação de moléculas fluorescentes em ou perto da membrana do plasma, e minimiza a fluorescência a partir das partes interiores da célula. Isto proporciona uma resolução significativamente mais elevada relação sinal-ruído e do eixo z para visualizar os eventos na membrana plasmática, compared para modos mais habitualmente utilizados tais como epifluorescência convencional ou microscopia de fluorescência confocal. Descrevemos também, a um nível de introdução e prático, a utilização de uma plataforma de análise de imagem utilizada para analisar e quantificar características morfológicas simples e dinâmica dos fenómenos endocíticos cargas individuais.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Alta Glicose com L-glutamina e piruvato de sódio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3024301</tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), sem cálcio, sem magnésio</td><td>Gibco, por Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Livre EDTA</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco, por Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, sem Gibco vermelho de fenol</td><td>, por Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, da Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE da Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção</td><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td></tr><tr><td>25 mm Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Frascos tratados com cultura de células Corning, 25 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Greiner Bio-One, por VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG</td><td></td></tr><tr><td>[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sal de acetato de encefalina (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Kit</td> <td>de Rotulagem de ProteínasLife Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Imaris Software de análise de imagem</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, para análise automatizada</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Nikon Eclipse Ti e acessórios necessários, incluindo cubos de filtro e filtros</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braço TIRF Nikon com adaptadores necessários para Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Para ajustar o ângulo de incidência</td></tr><tr><td>iXon+ EMCCD câmera e adaptadores</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia tirf

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Muitos receptores de sinalização importantes são internalizados através do processo bem estudado de endocitose mediada por clatrina (CME). Os ensaios biológicos celulares tradicionais, medindo as mudanças globais na endocitose, identificaram mais de 30 componentes conhecidos que participam da EMC, e estudos bioquímicos geraram um mapa de interação de muitos desses componentes. Está ficando cada vez mais claro, no entanto, que a CME é um processo altamente dinâmico, cuja regulamentação é complexa e delicada. Neste manuscrito, descrevemos o uso da microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (TIRF) para visualizar diretamente a dinâmica dos componentes da maquinaria endocítica mediada por clatrina, em tempo real em células vivas, no nível de eventos individuais que medeiam esse processo. Essa abordagem é essencial para elucidar as alterações sutis que podem alterar a endocitose sem bloqueá-la globalmente, como é visto com a regulação fisiológica. Vamos nos concentrar no uso dessa técnica para analisar uma área de interesse emergente, o papel da composição da carga na modulação da dinâmica de poços revestidos de clatrina (CCPs) distintos. Este protocolo é compatível com uma variedade de sondas de fluorescência amplamente disponíveis e pode ser aplicado para visualizar a dinâmica de muitas moléculas de carga que são internalizadas da superfície celular.

Utilizando-de células vivas microscopia TIRF temos registada a dinâmica de endocitose do receptor μ--opióide (MOR), um receptor acoplado a proteína G (GPCR), e a sua endocitose proteína adaptadora β-arrestina. O constructo β-arrestina foi transitoriamente transfectado para uma linha celular que expressa estavelmente MOR utilizando o protocolo delineado na Figura 1, e fotografada 96 horas mais tarde. A MOR na linha celular estável é a N-terminal etiquetado com uma GFP sensível ao pH. Esta proteína fluore...

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar a dinâmica de poços individuais revestidos de clatrina em células vivas. Isso é feito primeiro seccionando proteínas endocíticas e de carga marcadas com fluorescência em uma linha celular de aderência. O próximo passo é obter imagens das células com reflexão interna total, fluorescência ou microscopia de grama.A vida útil de pequenos conjuntos de poços revestidos de clatrina é então quantificada manualmente usando um programa de processamento e análise de imagem. A etapa final é quantificar a vida útil dos poços revestidos de clatrina por detecção e análise automatizadas objetivas. Em última análise, a microscopia de turfa é usada para quantificar a dinâmica de poços individuais revestidos de clatrina na resolução de um único evento para investigar a endocitose mediada por clatrina de receptores acoplados à proteína G.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do tráfego de membranas, como a forma como a montagem e a dinâmica da endocitose podem mudar com base nas diferentes proteínas endocíticas e proteínas de carga presentes. Para começar, transfecte células HEC 2 93 com plasmídeos que codificam receptores acoplados à proteína G tag ou GPCRs e / ou componentes da maquinaria Claro. Em uma placa de 12 poços, conforme detalhado no protocolo de texto, no dia seguinte à transfecção, adicione 0,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS com um EDTA milimolar a cada um.Bem, então coloque três rodadas estéreis de 25 milímetros em poços separados de seis. Placa de poço Encha cada poço com dois mililitros de mídia. Empurre suavemente a lamínula para o fundo do poço para evitar que as células cresçam na parte inferior da lamínula.Em seguida, agite manualmente um poço da placa de 12 poços para retirar as células do fundo do poço. Adicione um mililitro de DM EM com 10% FBS para reenviar. Em seguida, distribua as células levantadas de um poço uniformemente entre as três lamínulas.Deixe as células crescerem nas lamínulas por pelo menos 48 horas antes de fazer a imagem. Certifique-se também de que as células estejam espalhadas e planas para obter imagens da dinâmica do poço revestido de clatrina e da carga. Primeiro, pré-incube as células com anticorpos conforme descrito no protocolo de texto.Em seguida, prepare-se para transferir a lamínula para uma câmara de imagem de células vivas usando um par de pinças e uma agulha de calibre 25 dobrada na ponta em um gancho. Segure o par de pinças na mão dominante. Segure a agulha dobrada na outra.Gire a agulha até que o gancho se curve para baixo em direção ao vidro. Arraste suavemente o lado do gancho da agulha para baixo na parte inferior de uma placa de seis poços até que ele se prenda à lamínula. Tome cuidado para não arranhar a superfície da lamínula, pois ela se soltará das células.Levante suavemente a lama de cobertura do fundo do poço. Equilibre a lamínula contra a parede do poço para suporte. Use a pinça para agarrar perto da borda da lamínula e mova o lado da célula da lamínula para a câmara de imagem.Monte a câmara e adicione 700 microlitros de meio de imagem pré-aquecido. Depois de transferir a câmara para o microscópio, coloque as células em foco usando uma imagem objetiva de imersão em óleo de grama nas células nos modos convencionais de iluminação epi, fluorescência ou confocal para identificar as células que expressam as construções apropriadas como uma importante precaução de segurança. Esteja sempre atento ao ângulo do feixe de laser e sempre direcione-o para longe do observador.Em seguida, concentre-se na superfície inferior de uma célula de expressão até que o contorno da membrana plasmática ao redor da célula desapareça e a superfície inferior da célula apareça. Isso é mais aparente com uma proteína de carga localizada na membrana plasmática, como o receptor opióide mu. Se estiver usando os mesmos lasers para imagens em epifluorescência convencional, aumente o ângulo de incidência do laser até ficar fora de foco.A fluorescência no interior da célula desaparece e nenhum contorno da membrana plasmática ao redor da célula é visto. Uma vez no gramado m, certifique-se de que o laser de excitação reflita de volta através da objetiva e não seja visível acima da objetiva. Ao verificar se o ponto do laser está visível, refine o foco para obter uma imagem nítida.Uma vez identificadas as células, adquira imagens pelo menos a cada três segundos por 10 minutos. Repita todas as etapas para criar imagens de células adicionais. Para iniciar a análise da dinâmica endocítica, abra o arquivo na imagem J.As imagens são armazenadas como uma única pilha de arquivos TIFF.Com canais interfolhas. Converta as imagens em hiperpilhas selecionando hiperpilhas de imagem e pilha para hiperpilha na janela pop-up. Insira o número de canais adquiridos.Digite um para Zack e insira o número de quadros de filme. O formato de hiperpilha produz uma janela com duas barras de rolagem. Use a barra superior para percorrer os canais e a barra inferior para percorrer o tempo.Role até o canal da proteína cujo tempo de vida será analisado. Vá além do primeiro quadro do filme para reduzir a inclusão de poços revestidos de clatrina pré-existentes ou PCCs cujas durações inteiras não são visíveis. Desenhe uma região de interesse ou ROI em torno de um local escolhido aleatoriamente.Conte o número de quadros que um ponto está visível. Para iniciar a análise com o reconhecimento de objetos, abra o arquivo de imagem bruta no software de análise de imagem por padrão surgiu. A imagem colorida é exibida.Use a janela de ajuste de exibição para ajustar o brilho de um canal. Clique no nome de um canal para alterar a cor exibida. Desmarque a caixa ao lado do canal para impedir sua exibição.Crie manchas clicando no ícone com manchas laranja. Selecione uma ROI ao redor da célula usando-a para excluir áreas que detectarão incorretamente bordas e placas brilhantes Meça o diâmetro de um ponto para fornecer estimativas iniciais para o algoritmo.Mude para o modo slice e clique nas extremidades polares de um ponto para medir seu diâmetro. Faça isso para quatro ou cinco pontos redondos que parecem indicativos de um CCP no auge de sua estabilidade após a formação antes da cessão, use essas medições para calcular o diâmetro médio até o décimo de mícron mais próximo. Para detectar pontos que retornam ao modo ultrapassar, selecione o canal apropriado para detecção.Insira o diâmetro médio medido, geralmente 0,3 ou 0,4 mícrons. Clique na seta azul para frente para quantificar as manchas. Filtre os pontos por qualidade ajustando o filtro para capturar o maior número possível de pontos sem fundo.O filtro de qualidade é selecionado por padrão. Use a curva de qualidade como um guia para definir um limite apropriado. Mova o limite inferior do filtro com o botão esquerdo do mouse para este primeiro mergulho na curva.Este é um bom ponto de partida para o filtro. Como essa posição geralmente refina a detecção apenas para pontos visíveis. Remova os pontos arant no local de edição A tela muda para selecionar o modo e clica no local Depois de ficar amarelo, clica em eliminar.Em seguida, clique na seta azul para continuar criando o algoritmo. Meça as trilhas definindo as trilhas para brownie em movimento. O PCC não deve exibir nenhum movimento direcionado, apenas um desvio mínimo através da membrana plasmática.Este algoritmo é mais apropriado para esse movimento. Em seguida, defina a distância máxima para um valor pequeno, como 0,7 mícrons. Definir uma pequena distância minimiza a conexão de pontos adjacentes e ainda permite o rastreamento contínuo de um ponto de célula por meio de CCP ou movimento de célula.Em seguida, defina o tamanho máximo da lacuna como um. Isso permite que a trilha continue se faltar apenas um quadro. Em sucessão, tamanhos de folga de mais de três fazem com que diferentes trilhas sejam vinculadas incorretamente.O próximo passo é mudar a visualização da trilha para a cauda do dragão. Percorra o filme observando a qualidade da detecção. Se pontos adjacentes estiverem sendo conectados, diminua a distância máxima abaixo de 0,7 mícrons.Se as manchas estiverem sendo quebradas com muita facilidade, aumente o tamanho máximo da lacuna. Clique na seta azul para criar faixas. Isso leva à tela de filtro de faixa para filtrar faixas.Use um filtro de intensidade para remover placas brilhantes adicionais. Em seguida, use um filtro de deslocamento para remover os endossomos que entram no campo de grama. Tenha cuidado, pois pontos mais longos também terão deslocamento mais longo.Clique na seta dupla verde para concluir o protocolo. Para exportar dados, vá para a guia de estatísticas. Clique no ícone de disquete único para exportar a estatística selecionada.Clique no ícone que se parece com uma série de disquetes para exportar todas as estatísticas. O foco na membrana plasmática aderente A e no modo confocal revela uma célula preenchida com fluorescência fraca. Em contraste, o foco no centro da célula revela a membrana plasmática como um anel de fluorescência ao redor da célula.A fluorescência fora de foco torna-se aparente ao mudar para epi convencional, fluorescência ou relva com um ângulo incorreto. Quando o ângulo da grama está correto, a membrana plasmática é muito nítida, clara e brilhante, e fora de foco. A fluorescência não interrompe mais a imagem.Quando a beta-arrestina está em uma piscina citosólica, muito pouco está no campo de grama e parece nebuloso e com foco externo. Uma vez que o MOR é ativado pelo agonista, beta, a arrestina é recrutada para a membrana plasmática e tanto a beta-arrestina quanto o receptor se redistribuem para os CCPs. O tempo de vida desses clusters é quantificado manualmente.Usando os três parâmetros para endocitose completa, os pontos que denotam CCPs podem desaparecer completamente, piscar e apagar ou beliscar uma estrutura maior. Mostrado aqui um CCPs detectado usando um MAs Após a filtragem para remover estruturas de placas não dinâmicas, esferas brancas sobrepostas, denotam pontos detectados, pontos mais escuros que não puderam ser detectados por toda a sua vida útil também foram excluídos com o filtro de qualidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar poços codificados por cateter individuais usando microscopia de grama.

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de alta resolução para visualização em tempo real da formação e fechamento de fagossomos durante a fagocitose mediada por macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados (RBCs) opsonizados por IgG presos à superfície de um prato de fundo de vidro. Os macrófagos estendem os pseudópodes ao redor das hemácias e os engolfam dentro dos fagossomos, destacando-os da superfície do vidro.

Visualização baseada em microscopia TIRF da formação e fechamento de fagossomos

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizando metodologias combinadas para definir o papel da entrega da membrana plasmática durante a ramificação do axônio e a morfogênese neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos em neurônios corticais. Um marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensível ao pH fluoresce após a fusão da vesícula, com excitação seletiva de TIRF capturando exocitose...

Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total para Visualização de Eventos Exocíticos 

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Aprenda a visualizar a endocitose mediada por clatrina em células vivas usando microscopia TIRF. Este método permite quantificar a dinâmica de invaginações individuais para estudar receptores acoplados à proteína G.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF (Vídeo) | JoVE Journal

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

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