Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar a dinâmica de poços individuais revestidos de clatrina em células vivas. Isso é feito primeiro seccionando proteínas endocíticas e de carga marcadas com fluorescência em uma linha celular de aderência. O próximo passo é obter imagens das células com reflexão interna total, fluorescência ou microscopia de grama.

A vida útil de pequenos conjuntos de poços revestidos de clatrina é então quantificada manualmente usando um programa de processamento e análise de imagem. A etapa final é quantificar a vida útil dos poços revestidos de clatrina por detecção e análise automatizadas objetivas. Em última análise, a microscopia de turfa é usada para quantificar a dinâmica de poços individuais revestidos de clatrina na resolução de um único evento para investigar a endocitose mediada por clatrina de receptores acoplados à proteína G.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do tráfego de membranas, como a forma como a montagem e a dinâmica da endocitose podem mudar com base nas diferentes proteínas endocíticas e proteínas de carga presentes. Para começar, transfecte células HEC 2 93 com plasmídeos que codificam receptores acoplados à proteína G tag ou GPCRs e / ou componentes da maquinaria Claro. Em uma placa de 12 poços, conforme detalhado no protocolo de texto, no dia seguinte à transfecção, adicione 0,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS com um EDTA milimolar a cada um.

Bem, então coloque três rodadas estéreis de 25 milímetros em poços separados de seis. Placa de poço Encha cada poço com dois mililitros de mídia. Empurre suavemente a lamínula para o fundo do poço para evitar que as células cresçam na parte inferior da lamínula.

Em seguida, agite manualmente um poço da placa de 12 poços para retirar as células do fundo do poço. Adicione um mililitro de DM EM com 10% FBS para reenviar. Em seguida, distribua as células levantadas de um poço uniformemente entre as três lamínulas.

Deixe as células crescerem nas lamínulas por pelo menos 48 horas antes de fazer a imagem. Certifique-se também de que as células estejam espalhadas e planas para obter imagens da dinâmica do poço revestido de clatrina e da carga. Primeiro, pré-incube as células com anticorpos conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, prepare-se para transferir a lamínula para uma câmara de imagem de células vivas usando um par de pinças e uma agulha de calibre 25 dobrada na ponta em um gancho. Segure o par de pinças na mão dominante. Segure a agulha dobrada na outra.

Gire a agulha até que o gancho se curve para baixo em direção ao vidro. Arraste suavemente o lado do gancho da agulha para baixo na parte inferior de uma placa de seis poços até que ele se prenda à lamínula. Tome cuidado para não arranhar a superfície da lamínula, pois ela se soltará das células.

Levante suavemente a lama de cobertura do fundo do poço. Equilibre a lamínula contra a parede do poço para suporte. Use a pinça para agarrar perto da borda da lamínula e mova o lado da célula da lamínula para a câmara de imagem.

Monte a câmara e adicione 700 microlitros de meio de imagem pré-aquecido. Depois de transferir a câmara para o microscópio, coloque as células em foco usando uma imagem objetiva de imersão em óleo de grama nas células nos modos convencionais de iluminação epi, fluorescência ou confocal para identificar as células que expressam as construções apropriadas como uma importante precaução de segurança. Esteja sempre atento ao ângulo do feixe de laser e sempre direcione-o para longe do observador.

Em seguida, concentre-se na superfície inferior de uma célula de expressão até que o contorno da membrana plasmática ao redor da célula desapareça e a superfície inferior da célula apareça. Isso é mais aparente com uma proteína de carga localizada na membrana plasmática, como o receptor opióide mu. Se estiver usando os mesmos lasers para imagens em epifluorescência convencional, aumente o ângulo de incidência do laser até ficar fora de foco.

A fluorescência no interior da célula desaparece e nenhum contorno da membrana plasmática ao redor da célula é visto. Uma vez no gramado m, certifique-se de que o laser de excitação reflita de volta através da objetiva e não seja visível acima da objetiva. Ao verificar se o ponto do laser está visível, refine o foco para obter uma imagem nítida.

Uma vez identificadas as células, adquira imagens pelo menos a cada três segundos por 10 minutos. Repita todas as etapas para criar imagens de células adicionais. Para iniciar a análise da dinâmica endocítica, abra o arquivo na imagem J.As imagens são armazenadas como uma única pilha de arquivos TIFF.

Com canais interfolhas. Converta as imagens em hiperpilhas selecionando hiperpilhas de imagem e pilha para hiperpilha na janela pop-up. Insira o número de canais adquiridos.

Digite um para Zack e insira o número de quadros de filme. O formato de hiperpilha produz uma janela com duas barras de rolagem. Use a barra superior para percorrer os canais e a barra inferior para percorrer o tempo.

Role até o canal da proteína cujo tempo de vida será analisado. Vá além do primeiro quadro do filme para reduzir a inclusão de poços revestidos de clatrina pré-existentes ou PCCs cujas durações inteiras não são visíveis. Desenhe uma região de interesse ou ROI em torno de um local escolhido aleatoriamente.

Conte o número de quadros que um ponto está visível. Para iniciar a análise com o reconhecimento de objetos, abra o arquivo de imagem bruta no software de análise de imagem por padrão surgiu. A imagem colorida é exibida.

Use a janela de ajuste de exibição para ajustar o brilho de um canal. Clique no nome de um canal para alterar a cor exibida. Desmarque a caixa ao lado do canal para impedir sua exibição.

Crie manchas clicando no ícone com manchas laranja. Selecione uma ROI ao redor da célula usando-a para excluir áreas que detectarão incorretamente bordas e placas brilhantes Meça o diâmetro de um ponto para fornecer estimativas iniciais para o algoritmo.

Mude para o modo slice e clique nas extremidades polares de um ponto para medir seu diâmetro. Faça isso para quatro ou cinco pontos redondos que parecem indicativos de um CCP no auge de sua estabilidade após a formação antes da cessão, use essas medições para calcular o diâmetro médio até o décimo de mícron mais próximo. Para detectar pontos que retornam ao modo ultrapassar, selecione o canal apropriado para detecção.

Insira o diâmetro médio medido, geralmente 0,3 ou 0,4 mícrons. Clique na seta azul para frente para quantificar as manchas. Filtre os pontos por qualidade ajustando o filtro para capturar o maior número possível de pontos sem fundo.

O filtro de qualidade é selecionado por padrão. Use a curva de qualidade como um guia para definir um limite apropriado. Mova o limite inferior do filtro com o botão esquerdo do mouse para este primeiro mergulho na curva.

Este é um bom ponto de partida para o filtro. Como essa posição geralmente refina a detecção apenas para pontos visíveis. Remova os pontos arant no local de edição A tela muda para selecionar o modo e clica no local Depois de ficar amarelo, clica em eliminar.

Em seguida, clique na seta azul para continuar criando o algoritmo. Meça as trilhas definindo as trilhas para brownie em movimento. O PCC não deve exibir nenhum movimento direcionado, apenas um desvio mínimo através da membrana plasmática.

Este algoritmo é mais apropriado para esse movimento. Em seguida, defina a distância máxima para um valor pequeno, como 0,7 mícrons. Definir uma pequena distância minimiza a conexão de pontos adjacentes e ainda permite o rastreamento contínuo de um ponto de célula por meio de CCP ou movimento de célula.

Em seguida, defina o tamanho máximo da lacuna como um. Isso permite que a trilha continue se faltar apenas um quadro. Em sucessão, tamanhos de folga de mais de três fazem com que diferentes trilhas sejam vinculadas incorretamente.

O próximo passo é mudar a visualização da trilha para a cauda do dragão. Percorra o filme observando a qualidade da detecção. Se pontos adjacentes estiverem sendo conectados, diminua a distância máxima abaixo de 0,7 mícrons.

Se as manchas estiverem sendo quebradas com muita facilidade, aumente o tamanho máximo da lacuna. Clique na seta azul para criar faixas. Isso leva à tela de filtro de faixa para filtrar faixas.

Use um filtro de intensidade para remover placas brilhantes adicionais. Em seguida, use um filtro de deslocamento para remover os endossomos que entram no campo de grama. Tenha cuidado, pois pontos mais longos também terão deslocamento mais longo.

Clique na seta dupla verde para concluir o protocolo. Para exportar dados, vá para a guia de estatísticas. Clique no ícone de disquete único para exportar a estatística selecionada.

Clique no ícone que se parece com uma série de disquetes para exportar todas as estatísticas. O foco na membrana plasmática aderente A e no modo confocal revela uma célula preenchida com fluorescência fraca. Em contraste, o foco no centro da célula revela a membrana plasmática como um anel de fluorescência ao redor da célula.

A fluorescência fora de foco torna-se aparente ao mudar para epi convencional, fluorescência ou relva com um ângulo incorreto. Quando o ângulo da grama está correto, a membrana plasmática é muito nítida, clara e brilhante, e fora de foco. A fluorescência não interrompe mais a imagem.

Quando a beta-arrestina está em uma piscina citosólica, muito pouco está no campo de grama e parece nebuloso e com foco externo. Uma vez que o MOR é ativado pelo agonista, beta, a arrestina é recrutada para a membrana plasmática e tanto a beta-arrestina quanto o receptor se redistribuem para os CCPs. O tempo de vida desses clusters é quantificado manualmente.

Usando os três parâmetros para endocitose completa, os pontos que denotam CCPs podem desaparecer completamente, piscar e apagar ou beliscar uma estrutura maior. Mostrado aqui um CCPs detectado usando um MAs Após a filtragem para remover estruturas de placas não dinâmicas, esferas brancas sobrepostas, denotam pontos detectados, pontos mais escuros que não puderam ser detectados por toda a sua vida útil também foram excluídos com o filtro de qualidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar poços codificados por cateter individuais usando microscopia de grama.