Músculo liso da bexiga Faixa Contractility como um método para avaliar do trato urinário inferior Farmacologia

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as propriedades fisiológicas e farmacológicas do tecido muscular liso da bexiga. Isso é feito dissecando a bexiga do rato, abrindo-a em uma folha plana e cortando tiras contendo o músculo liso do urotélio e os nervos. Na segunda etapa, o tecido é ligado a um transdutor de força conectado a amplificadores e estimuladores para medir a contratilidade muscular.

Na próxima etapa, o tônus basal e a viabilidade tecidual são estabelecidos e, em seguida, as tiras são expostas à estimulação farmacológica e/ou elétrica. Em última análise, os efeitos dos estímulos na contratilidade do tecido muscular liso da bexiga podem ser medidos. Este método é usado para caracterizar os efeitos de compostos patológicos e farmacológicos em toda a bexiga, bem como componentes específicos do tecido da bexiga, como os nervos musculares lisos no urotélio, em humanos e em animais.

Essa técnica tem sido amplamente utilizada durante o desenvolvimento de terapias para várias disfunções da bexiga, pois representa um método de triagem rápido, fácil e reprodutível para agentes farmacológicos em um ambiente bem definido e controlado. Após confirmar a anestesia por perda do membro traseiro, retire o reflexo, raspe o abdômen do animal e, em seguida, exponha os órgãos pélvicos por meio de uma incisão abdominal na linha média. Em seguida, identifique a bexiga e a uretra e, em seguida, corte o colo da bexiga próximo à uretra proximal.

Para remover a bexiga, coloque o lenço imediatamente em um prato revestido com proteção de peitoril cheio de solução de Creb aerada. Então, depois de sacrificar o animal, insira pinos de dissecação de tecido através da cúpula da bexiga, colo e ureteres para estabilizar o tecido para posterior dissecção sem esticar o tecido. Apare a bexiga de tecido estranho e, em seguida, abra o tecido da base até a cúpula para criar uma folha plana com o lado da cirrose voltado para baixo e o lado luminal para cima.

Coloque pinos de dissecação em cada canto do tecido e, em seguida, remova o tecido da bexiga, pescoço e cúpula. Em seguida, corte o tecido longitudinalmente da base até a cúpula em tiras de cerca de dois por oito milímetros, prendendo um clipe de tecido em ambas as extremidades de cada tira. Transferir as tiras para as câmaras experimentais, fixando uma extremidade de cada tira a um transdutor de força e a outra a uma haste fixa.

Agora, estique suavemente os tecidos até que a tensão basal atinja um grama. Inicialmente, o tecido tende a relaxar, o que é registrado como uma diminuição na tensão basal. Lave as tiras aproximadamente a cada 15 minutos com crebs aerados quentes e ajuste a tensão basal para um grama.

Após cada lavagem, deixe os tecidos se equilibrarem por cerca de uma a duas horas até que não relaxem mais. Quando a tensão basal estiver estável, adicione cloreto de potássio diretamente ao banho por cinco minutos ou até que uma resposta de platô seja alcançada para testar a viabilidade do tecido. Em seguida, lave os lenços de papel de três a cinco vezes com crebs aerados quentes para permitir que o tecido retorne às condições anteriores ao tratamento.

Para estimulação farmacológica do músculo liso, adicione medicamentos de soluções concentradas diretamente ao banho. Por exemplo, para estimulação do carbahol, adicione 10 microlitros de cada uma das concentrações do estímulo a cada banho de tecido de 10 mililitros. Assim que a resposta da concentração anterior atingir um platô.

Em tiras paralelas, adicione quantidades iguais do veículo para estimulação neural do músculo liso ou estimulação do campo elétrico. Defina a duração do trem para três a 10 segundos e o intervalo entre trens para pelo menos um minuto de intervalo. Depois de estabelecer a frequência dos estímulos do trem, execute uma curva de resposta de frequência variando de 0,5 a 50 hertz para estabelecer a intensidade do estímulo.

Aumente sistematicamente a voltagem até que a amplitude das contrações atinja um platô, mantendo a frequência constante. Uma vez estabelecidos os parâmetros de estimulação, aguarde cerca de 20 a 30 minutos para que a estimulação do campo elétrico, as contrações evocadas se estabilizem antes do teste de drogas. Em seguida, para testar os efeitos do alfa beta metileno a TP e da atropina na estimulação do campo elétrico, por exemplo, execute duas curvas de resposta de frequência de controle e, em seguida, adicione 10 microlitros de alfa beta metileno a TP à tira de teste e 10 microlitros de veículo às tiras de controle.

O alfa beta metileno A TP estimula diretamente os receptores púricos no músculo liso e dessensibiliza esses receptores, causando uma contração inicial da linha de base. Depois que a resposta retornar à linha de base, repita as curvas de resposta de frequência em todas as faixas. Adicione 10 microlitros de atropina à tira de teste e 10 microlitros de veículo às tiras de controle e repita as curvas de resposta de frequência no final da estimulação do campo elétrico.

Verifique a seletividade da estimulação do campo elétrico bloqueando a transmissão neural com o bloqueador dos canais de sódio tetra à toxina. Por fim, solte as tiras. Bloqueie-os suavemente em um pedaço de papel de seda para eliminar qualquer fluido extra e meça o peso de cada tira em uma balança para determinar os efeitos no tônus do músculo liso.

Use o software de análise de dados apropriado para selecionar uma janela de pelo menos 10 a 30 segundos antes e no pico da resposta induzida pelo medicamento e meça a amplitude da contração para determinar os efeitos dos tratamentos experimentais nas contrações evocadas neuralmente. Meça a amplitude, duração e área sob a curva de pelo menos três contrações antes e no pico da resposta induzida pela droga. Finalmente, normalize os dados para comparar os resultados entre as tiras e os tratamentos farmacológicos.

A atividade miogênica espontânea é uma característica do músculo liso que muda durante o desenvolvimento pós-natal e a patologia. Neste experimento representativo, tiras de ratos neonatais exibem contrações rítmicas de grande amplitude e baixa frequência, enquanto tiras de ratos adultos exibem atividade de baixa frequência e pequena amplitude após lesão medular. O padrão neonatal ressurge a otina, o abridor de canal A-K-C-N-Q diminui a amplitude da atividade espontânea em tiras de tônus muscular liso de rato adulto e propriedades de contratilidade, que podem ser influenciadas pelo urotélio e mucosa são fatores importantes para o funcionamento adequado da bexiga durante o armazenamento e micção da urina.

Por exemplo, neste gráfico, o aumento dependente da concentração no tônus do músculo liso. Por chamada cárica, a ativação de receptores muscarínicos em tiras de bexiga de porco é ilustrada. Uma redução na contratilidade muscular em resposta ao tratamento com carbahol é observada na presença da mucosa.

Como mostrado neste gráfico, cinco receptores HT quatro são expressos previamente nos nervos parassimpáticos, e sua ativação aumenta os níveis de acetilcolina. Esses gráficos ilustram a eficácia e potência diferentes do efeito excitatório dos cinco agonistas do receptor HT quatro cisaprida na bexiga humana versus tiras de íleo. As diferenças de espécies que existem em vários receptores podem ser avaliadas usando este método de tira da bexiga.

Por exemplo, esses dados mostram que os antagonistas do receptor de bombesina têm efeitos excitatórios na bexiga de rato, enquanto não têm efeitos nas tiras de bexiga de camundongo ou porco. Para estimulação farmacológica, é importante prestar atenção à concentração, momento e duração da aplicação do medicamento. Para evitar efeitos inespecíficos em outros receptores ou dessensibilização dos receptores-alvo para estimulação neural, é importante escolher os parâmetros corretos para estimulação do campo elétrico de acordo com o objetivo do experimento e garantir que o estímulo não ative diretamente o músculo liso.