Name: Um Modelo de Aprendizagem lateralizados Odor em ratos recém-nascidos para Dissecando Formação Neural dos circuitos Consolidação da Memória (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda aprendizado lateralizado de preferência por odor em ratos recém-nascidos usando oclusão unilateral de narina. Este método reduz variabilidade interanimal e permite investigar mecanismos neurais da formação de memória olfativa.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de funcionamento do CIHR (MOP-102624) para Q. Y. Agradecemos à Dra. Carolyn Harley pelas discussões úteis ao longo do estudo, ao Dr. Qinlong Hou, Amin Shakhawat e Andrea Darby-King pelo suporte técnico.

Sprague Dawley (Charles River) filhotes de ambos os sexos são usados. As ninhadas são abatidos para 12 no PD1 (nascimento sendo PD0). Os reservatórios são mantidos num ciclo claro / escuro de 12 horas de luz, com acesso ad libitum a comida e água. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional da Universidade Memorial. 1. Nose plug Construção NOTA:. Este procedimento foi adaptado e modificado a partir de Cummings et al (1997) 35. <ol><li> Aquire tubulação de polietileno de 20 e 3-0 fio de sutura de seda. </li><li> Corte um pequeno pedaço de polietileno de 20 tubos de aproximadamente 0,8 mm. </li><li> Fio de sutura de seda através do tubo preparado de tal modo que existe rosca de cada lado da secção de tubo. </li><li> Em uma extremidade do fio fora da tomada, dê um nó no fio. </li><li> Puxe a seção de tubulação para baixo sobre o nó no fio. O nó deve apresentar dentro da tubulação.</li><li> Aparar as duas extremidades do fio de tal modo que ~ 2 mm de segmento está saliente a partir de uma extremidade do tubo (ver figura 1A). </li></ol> 2. Naris Oclusão antes do treino <ol><li> Remover filhote de barragem e coloque em um prato seguro coberto por uma cama regular. </li><li> Use um aplicativo de ponta de algodão para enxugar uma geléia anestésico local, xilocaína 2%, sobre as naris a ser fechado. </li><li> Permitir que o filhote para descansar no prato para ~ 3 min. </li><li> Segure o filhote com cuidado, mas com firmeza na mão não-dominante. </li><li> Usando a mão dominante, pegar uma ficha nariz e bata na mesma geléia anestésico local em torno da ponta da qual o segmento não está saliente. Isto irá agir como um anestésico para todas as dores menores associadas com plug de inserção e irá funcionar como um lubrificante no interior do naris. NOTA: O efeito da xilocaína começa dentro de alguns minutos e dura 20-30 min. Filhotes em geral mostram boa tolerância para plugue de inserção após a aplicação de xilocaína geléia (mMÍNIMO lutando e vocalização). </li><li> Insira cuidadosamente a ficha nariz segurando firmemente o filhote e girando lentamente a ficha com empurrões muito suaves até que o plugue está totalmente inserido e só o fio 2 mm de largura que se projeta da naris (ver Figura 1B). Não deve haver sangramento de qualquer naris durante este processo. Filhotes com sangramento durante a tomada nariz de inserção são excluídos e voltou para barragens </li><li> Permitir que o animal para descansar neste prato durante 5 min, de modo a habituar-se o tampão. </li><li> Retirar o filhote do prato habituação e começar o paradigma condicionado 24. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51808/51808fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 construção de uma vela de nariz. A) Esquema mostrando os passos de fazer um encaixe do nariz. A linha é puxada através de tubos de polietileno; um nó é feito e pullevado para o centro do tubo para bloqueá-lo; duas extremidades são cortadas com um resíduo de 2 mm de uma extremidade para fora do tubo. B) frontal e lateral de um rato com um tampão no nariz uma narinas. 3. Perfumado cama Preparação <ol><li> Vestindo luvas novas e em um exaustor para evitar a contaminação odor, coloque 500 ml de cama de lascas de madeira em um saco plástico. </li><li> Use uma seringa para elaborar 0,3 ml extrato de hortelã, e pulverizar este sobre a cama no saco plástico. </li><li> Amarre o saco fechado, sacuda o saco vigorosamente, e permitir que a roupa de cama para descansar no saco por 5 min. </li><li> Coloque a roupa de cama perfumada em uma caixa clara, rasa, acrílico treinamento (20 x 20 x 5 cm 3, Figura 2A) descoberto em um exaustor por 5 minutos antes de usar. Uma vez que a roupa de cama é preparada, descarte as luvas, e não permitir que essas luvas para entrar em contato com os animais. </li><li> Coloque a cama sem cheiro em uma caixa de plástico idêntico claro, e enCertifique-se de que não entram em contato com a roupa de cama perfumada ou luvas usadas. </li></ol> 4. Odor Condicionado Paradigm (ver imagem na Figura 2A) Os filhotes passam por uma única sessão condicionado, em PD 6 ou múltiplas sessões de julgamento (uma sessão por dia, PD 3-6). <ol><li> Coloque o filhote habituado a cama perfumada. Para odor controle só (O / S -) filhotes, deixe estes filhotes de cachorro na cama por 10 min, em seguida, vá para o passo 4.5. Para experimental odor + curso (O / S +) filhotes, continue com os seguintes passos nesta seção. </li><li> Curso o filhote durante 30 segundos usando um pincel pequeno. Use rápidos movimentos circulares principalmente em torno da região posterior do filhote. </li><li> Permitir que o filhote para descansar por 30 seg. </li><li> Repita os passos 4.2 e 4.3 para um total de 10 min (ou seja, 10 pares de afago + odor). </li><li> Remover filhote da caixa de condicionamento, retire a ficha nariz e devolver o cachorro para a represa. </li></ol> &lt;p class = "jove_title"&gt; 5. Lateralizado Odor Preferências Testing (ver imagem na Figura 2B) O teste ocorre em vários pontos temporais (por exemplo, 24 ou 48 h) a seguir à sessão de treino final. O teste é realizado numa câmara de teste de aço inoxidável (30 x 20 x 18 cm 3), que é colocada em cima de duas caixas de formação (caixa de formação é descrita no ponto 3.4), separadas por uma zona neutra 2 cm. Uma caixa de treinamento contém cama com aroma de hortelã-pimenta, enquanto a outra caixa contém limpo, roupa de cama sem cheiro. O chão da câmara de teste é uma grade de metal, que é então coberto por uma folha removível de malha de plástico (Figura 2B). <ol><li> Prepare uma hortelã-pimenta e uma cama sem cheiro como por secção 3, e colocar cada caixa em lados opostos da câmara de teste de 2 cm de distância. Coloque a malha de plástico sobre o chão de metal da grade da câmara de teste. </li><li> Retirar o filhote da barragem e coloque um dab empresa de graxa de silicone inodoro nas narisque está ocluído durante o treinamento. Voltar a aplicar o lubrificante ao longo do procedimento de teste como primeiro necessário. NOTA: oclusão naris aleatória durante o treinamento e teste podem ser considerados para evitar viés. </li><li> Coloque cachorro na zona neutra da câmara de teste. </li><li> Permitir que o filhote para explorar a câmara por 1 min, registrando quanto tempo o cachorro passou ao longo dos dois lados da câmara (ou seja, mais de hortelã-pimenta ou roupa de cama neutra-perfumada). </li><li> Permitir que o filhote para descansar por 1 min em uma câmara de retenção de plástico coberto. </li><li> Repita os passos 5.2 e 5.3 para um total de 10 min (ou seja, 5 ensaios de teste, separados por 5 ensaios de descanso) mudar a orientação inicial de que o filhote na câmara, a fim de controlar as preferências de direção. </li><li> Imediatamente após o teste, limpe a graxa do naris. </li><li> Insira um noseplug polietileno no naris oposto conforme a secção 2 e permitir que o animal em repouso por 10 min. </li><li> Teste o filhote, mais uma vez, como em 5.3 -5.6, retire a ficha, e devolver o cachorro para a represa. Remover e limpar a rede de plástico da câmara de ensaio com 95% de etanol e permitir que o líquido se evapore. Coloque a malha para trás antes de testar o próximo filhote. NOTA: A aplicação de graxa de silicone na primeira oclusão naris durante o teste impede a chance de sangramento e estresse associado com plug nariz de inserção. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51808/51808fig2highres.jpg" width="500"> Figura formação preferência 2 odor precoce e testes. A) formação odor precoce preferência usando o odor + acariciando paradigma. B) Dois escolha odor testes de preferência com roupa de cama de hortelã-pimenta, de um lado, o controle da cama sem cheiro no lado oposto. A zona neutra dois centímetros é colocado no meio. 6. testar a eficácia de uma única Naris Oclusão nt "&gt; Este experimento é realizado para determinar se a oclusão naris único leva à ativação lateralizado do sistema olfativo. <ol><li> Realize oclusões NARIs unilaterais em PD 6 ou 7 filhotes, conforme descrito na seção 2. </li><li> Após cerca de 5 minutos de habituação, coloque o filhote em um recipiente de plástico coberta e expô-la a 30 mL de óleo de hortelã-pimenta pura embebido em um pedaço de tecido para 10 min. </li><li> Imediatamente após a exposição ao odor de hortelã-pimenta, o cachorro injectar por via intraperitoneal (ip) com hidrato de cloral (400 mg / kg), como um anestésico geral, ou pentobarbitol, (150 mg / kg). </li><li> Uma vez completamente anestesiado (não apresentando resposta a cauda ou pé de aperto), transcardialmente perfundir o cachorro com soluções geladas de solução salina (0,9%) durante ~ 1 min, seguido por paraformaldeído (4%, dissolvido em solução tampão de fosfato 0,1 M, PBS ). </li><li> Depois de 10 min de perfusão paraformaldeído, recolher o cérebro e colocá-lo em paraformaldeído a noite a 4 ° C, em seguida transfer o cérebro para uma solução de sacarose (20% em PBS) durante uma 24 horas adicionais. </li><li> Cortar fatias cerebrais coronais de 30 um, com uma espessura de criostato. Recolha de OB e PC fatias e montagem em lâminas revestidas com gelatina, seguida por coloração imuno-histoquímica para o padrão pCREB anticorpo 21,25,30. </li></ol> 7 Teste da Reversibilidade da Única Naris Oclusão Esta experiência testa se o efeito de bloqueio é reversível às 24 horas após a remoção da tomada de nariz. <ol><li> Realize oclusões NARIs unilaterais em PD 6 ou 7 filhotes, conforme descrito na seção 2. </li><li> Depois de 15 min (equivalente à duração da oclusão naris durante o treino - 5 min habituação + 10 min de treinamento), retire a ficha nariz, e devolver o cachorro para a represa. </li><li> 24 horas depois, expor o filhote para o odor de hortelã em um recipiente de plástico coberta por 10 minutos, conforme descrito em 6.2. </li><li> Siga mesmos passos em seitaíons de 6,3-6,6. </li></ol>

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<li>Kucharski, D., Johanson, I. B., Hall, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+olfactory+conditioning+in+6-day-old+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neural+Biol%22%5BJournal%5D)">Unilateral olfactory conditioning in 6-day-old rat pups.</a> Behav Neural Biol. 46, 472-490 (1986).</li>
<li>Cummings, D. M., Henning, H. E., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+bulb+recovery+after+early+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory bulb recovery after early sensory deprivation.</a> J Neurosci. 17, 7433-7440 (1997).</li>
<li>Kucharski, D., Hall, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+change+in+the+access+to+olfactory+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental change in the access to olfactory memories.</a> Behav Neurosci. 102, 340-348 (1988).</li>
<li>Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+odor+deprivation%3A+time+course+of+changes+in+laminar+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Unilateral odor deprivation: time course of changes in laminar volume.</a> Brain Res Bull. 14, 233-237 (1985).</li>
<li>Kass, M. D., Pottackal, J., Turkel, D. J., McGann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+neural+representation+of+odorants+after+olfactory+deprivation+in+the+adult+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Changes in the neural representation of odorants after olfactory deprivation in the adult mouse olfactory bulb.</a> Chem Senses. 38, 77-89 (2013).</li>
<li>Kim, H. H., Puche, A. C., Margolis, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+deprivation+reversibly+modulates+transsynaptic+changes+in+the+NR2B-mediated+CREB+pathway+in+mouse+piriform+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant deprivation reversibly modulates transsynaptic changes in the NR2B-mediated CREB pathway in mouse piriform cortex.</a> J Neurosci. 26, 9548-9559 (2006).</li>
<li>Korol, D. L., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+2-deoxyglucose+uptake+and+amino+acid+incorporation+following+unilateral+odor+deprivation%3A+a+laminar+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in 2-deoxyglucose uptake and amino acid incorporation following unilateral odor deprivation: a laminar analysis.</a> Brain Res Dev Brain Res. 52, 75-84 (1990).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O modelo de aprendizagem e memória odor lateralizado em filhotes de rato dentro de uma janela de tempo crítico foi estabelecido pela primeira vez por Hall e colegas. Em uma série de estudos 33,34,36, eles mostraram que uma memória preferência odor poderia ser lateralizado por odores + leite pares para um naris em PD 6 em filhotes de ratos. Memória preferência era robusto quando o mesmo naris estava aberta durante o treinamento e teste, mas não observada quando o naris oclusa foi desbloqueado e testado. No ent...

O olfato é a modalidade sensorial primário em roedores, sem o que não seria capaz de navegar ou sobreviver em seu ambiente com sucesso. É especialmente importante para os filhotes recém-nascidos, que nem podem ver, nem ouvir, durante a primeira semana pós-natal, para usar o olfato para localizar a sua mãe para alimentar 1. Como resultado, os filhotes de ratos recém-nascidos pode ser condicionado a preferir odores com manipulações experimentais simples. Uma variedade de estímulos têm sido usados ​​como estímulo incondicionado (UCS) para induzir respostas condicionadas a novos odores (estímulo condicionado, CS) em recém-nascidos, incluindo o ambiente de nidificação 2,3, sugando leite 4-6, acariciando ou estimulação tátil 7 12, 13 de aperto da cauda, ​​saliva materna 13, 14-18 leve choque nas patas, intracraniana e a estimulação do cérebro 19. O presente estudo emprega um odor precoce preferência paradigma bem estabelecido, em que o odor, neste caso, de hortelã-pimenta, is combinados com a estimulação táctil de modo a produzir uma preferência para hortelã-pimenta 24 horas mais tarde 10,11,20. Estas memórias odores são dependentes de circuitos olfativa intacta, incluindo principalmente o bulbo olfatório (OB) 21-23 eo córtex piriforme anterior (APC) 24,25. Investigações experimentais do início do aprendizado preferência odor aprofundaram e ampliaram nossa compreensão das bases moleculares e fisiológicos de uma memória dos mamíferos. Este modelo de mamíferos tem várias vantagens em estudar mecanismos de memória. Em primeiro lugar, as fontes neurais do sinal UCS foram identificados. Vários estímulos, como mencionado acima estimular lócus coeruleus liberação de noradrenalina 26, que por sua vez ativa vários receptores adrenérgicos na OB e APC, causando efeitos celulares e fisiológicos que sustentam o aprendizado 22,27,28. Em segundo lugar, os mecanismos de memória de apoio ter lugar em estruturas neurais laminares bem definidas. Asimplicidade do circuito olfativo em ratos recém-nascidos fornece aos pesquisadores do quadro ideal com o qual a desvendar os intrincados processos relacionados com a plasticidade sináptica. Neurônios olfativos sensoriais (OSN) no projeto epitélio olfativo Onto mitral / células tufados no OB e estes mitral / células tufados, por sua vez projeto ipsi para córtex piriforme (PC) via lateral trato olfatório (LOT), entre outras estruturas 29. Ambas as sinapses OSN no OB 30,31 ea LOT sinapses 24,25 na APC foram identificados como loci crítico para mudanças sinápticas que apoiar a aprendizagem ea memória. Em terceiro lugar, em uma idade precoce em ratos, insumos olfativos podem ser facilmente lateralizada. Cada A APC tem acesso à informação odor bilateral através da comissura anterior uma vez que esta substância branca está completamente formado no pós-natal dia 12 (PD12) 32. Antes PD 12, entrada de odor pode ser isolado para ipisilateral OB e APC através único oclusão naris 24,25,31,33,34 &lt;/ Sup&gt;. Oclusão naris Único permite a formação de memória odor do naris aberto, e impede a mesma memória das narinas ocluídas anteriores para PD 12 33. Memória Odor é isolado para o hemisfério ipsilateral incluindo tanto OB e APC. Portanto, cada filhote de rato pode ser seu próprio controle para o aprendizado e subjacente a fisiologia. No presente estudo, o odor cedo protocolo aprendizagem preferência lateralizada é introduzido. Este método serve como uma ferramenta poderosa para o estudo dos mecanismos neurais subjacentes aprendizagem odor, proporcionando um controlo intra-animais 24,25,31, reduzindo assim tanto o número de animais necessários e a variação geral. Oclusão naris é reversível em que o bujão de gordura ou nariz pode ser aplicado e removido com o stress ou dano para o animal mínimo. Aqui, em primeiro lugar, os procedimentos detalhados de treinamento preferência odor cedo e testes são descritos, com foco no protocolo lateralizado usando oclusão naris único com um nsae tampão. Em seguida, os resultados são apresentados para demonstrar a eficácia de oclusão naris único no isolamento de entrada odor e produzindo odor lateralizado memória. Por fim, são discutidas as potencialidades da utilização deste modelo de aprendizagem lateralizado para estudar mudanças fisiológicas no sistema olfativo que ambos geram aprendizado e memória apoio expressão.

<table><tbody><tr><td>Tubulação de polietileno 20</td><td>427406 intramédica</td><td></td><td>Não radiopaca, não tóxica</td></tr><tr><td>3-0 Fio de sutura de seda</td><td>Syneture</td><td>Sofsilk</td><td>Graxa de silicone não absorvente</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instrument</td><td>64-0378</td><td>Gel de</td></tr><tr><td>xilocaína 2%</td> inodoro <td>AstraZeneca</td><td>Prod. No 061</td><td>Geléia de cloridrato de lidocaína, comprada em farmácia local</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Dynasty</td><td>206R</td><td>Tamanho semelhante/outras marcas também funcionam</td></tr><tr><td>Extrato de hortelã-pimenta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W284807</td><td>Outras marcas também devem estar bem Caixa</td></tr><tr><td>de treinamento</td><td>N/A feita sob medida</td><td></td><td>Caixa de acrílico (20 x 20 x 5 cm3), consulte Figura 2A. Os parâmetros e o material da caixa não são críticos e podem ser modificados. O material utilizado deve ser inodoro e não absorver odores</td></tr><tr><td>Câmara de teste</td><td>N/A feito sob medida</td><td></td><td>Aço inoxidável (30 x 20 x 18 cm3), consulte Figura 2B. Os parâmetros e o material para a câmara não são críticos e podem ser modificados. Por exemplo, uma câmara de acrílico em vez de uma de aço inoxidável pode ser usada</td></tr><tr><td>anticorpo pCREB</td><td>Sinalização Celular</td><td>9198</td><td>Ser 133 (87G3) Coelho mAb</td></tr><tr><td>Hidrato de cloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8383</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Paraformaldehype</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

um modelo de aprendizagem lateralizados odor em ratos recém-nascidos para dissecando formação neural dos circuitos consolidação da memória

A Lateralized Odor Learning Model in Neonatal Rats for Dissecting Neural Circuitry Underpinning Memory Formation

Filhotes de rato durante um período pós-natal crítico (≤ 10 dias) prontamente formam uma preferência por um odor associado a estímulos que imitam o cuidado materno. Essa memória de preferência pode durar de horas a dias, até mesmo ao longo da vida, dependendo dos parâmetros de treinamento. O aprendizado precoce da preferência por odores nos fornece um modelo no qual as mudanças críticas para uma forma natural de aprendizado ocorrem no circuito olfativo. Uma característica adicional que o torna uma ferramenta poderosa para a análise dos processos de memória é que o aprendizado precoce da preferência de odor pode ser lateralizado por meio da oclusão de naris único dentro do período crítico. Isso se deve à falta de conexões comissurais anteriores maduras dos hemisférios olfatórios nessa idade precoce. Este trabalho descreve protocolos comportamentais para aprendizado de odor lateralizado usando tampões nasais. A oclusão aguda e reversível da narina minimiza os danos teciduais e neuronais associados à oclusão de longo prazo e métodos mais agressivos, como a cauterização. O modelo de aprendizado de odor lateralizado permite a comparação dentro do animal, reduzindo muito a variação em comparação com os projetos entre animais. Este método tem sido usado com sucesso para sondar as mudanças de circuito no sistema olfativo produzidas pelo treinamento. As direções futuras incluem a exploração dos fundamentos moleculares da memória de odor usando este modelo de aprendizado lateralizado; e correlacionar a mudança fisiológica com a força e a duração da memória.

Aqui vamos rever alguns dos resultados previamente estabelecidos 24 para demonstrar a eficácia da oclusão naris em isolar entrada odor e aprender a um hemisfério, ea reversibilidade do método. Oclusão Único naris durante o treinamento preferência odor precoce leva a uma memória odor lateralizado 24. A memória é confinado ao naris poupados (Figura 3). Quando os filhotes são testados quanto à preferência de odor com a mesma naris ocluído durante a formaçã...

Este protocolo introduz o aprendizado precoce da preferência de odor lateralizado em ratos usando oclusão aguda de naris única. A aprendizagem lateralizada permite o exame de resultados comportamentais e mecanismos biológicos subjacentes dentro dos mesmos animais, reduzindo a variância induzida por designs entre animais. Este protocolo pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares que sustentam o aprendizado precoce de odores.

Um Modelo de Aprendizagem lateralizados Odor em ratos recém-nascidos para Dissecando Formação Neural dos circuitos Consolidação da Memória

Rat pups during a critical postnatal period (&#8804; 10 days) readily form a preference for an odor that is associated with stimuli mimicking maternal ...

Este protocolo introduz o aprendizado precoce da preferência de odor lateralizado em ratos usando oclusões agudas de uma única nária. Isso é feito primeiro construindo tampões nasais de polietileno removíveis. O segundo passo é ocluir o Áries desejado antes do treinamento comportamental.Em seguida, prepare a cama perfumada e, em seguida, treine o animal na cama perfumada enquanto a acaricia com um pincel. A etapa final é testar a preferência de odor lateralizado usando um aparelho de teste de duas opções. Em última análise, a imuno-histoquímica da proteína de ligação ao elemento de resposta C amp fosforilada ou P crib é usada para demonstrar o silenciamento unilateral da atividade neuronal devido à reclusão única e à reversibilidade do método.A principal vantagem desta técnica de nossa existência entre métodos de controle animal é que somos capazes de reduzir a variabilidade e o número de animais através da natureza de nosso projeto experimental de controle intra-animal antes da camada pós-natal 11, devido à falta de projeções de vírgulas anteriores maduras de MA, que dois hemisférios olfativos não estão conectados. Isso nos permite manipular um hemisfério independentemente do outro por meio da oclusão de nutrição única. Os hemisférios ocluídos servem como um controle intra-animal.Embora essa técnica se concentre no aprendizado olfativo em ratos neonatais, as implicações nos permitirão responder a questões fundamentais sobre processos neurais durante o aprendizado e a memória, como plasticidade sináptica, metaplásica e seus mecanismos moleculares subjacentes. As conclusões tiradas de estudos usando esse método podem ser generalizadas para princípios básicos de aprendizagem e memória e mamíferos, especialmente durante períodos críticos pós-natais. Isso nos ajudará a construir um cenário promissor para possíveis terapias para perda de memória associada a condições fisiopatológicas.Este método também é altamente adequado para outros processos relacionados ao olfato, como percepção de odor e revestimento de odor. O tampão nasal é construído a partir de tubos de polietileno 20 e três fios de sutura de seda zero. Primeiro, corte um pequeno pedaço de polietileno 22 a aproximadamente 0,8 centímetros.Em seguida, passe a sutura de seda pelo tubo preparado de forma que haja rosca em ambos os lados da seção do tubo. Em uma extremidade da linha fora do plugue, dê um nó. Puxe a seção do tubo para baixo sobre o nó na rosca.O nó deve se alojar dentro da tubulação. Apare as duas extremidades da rosca, de modo que cerca de dois milímetros de rosca fiquem salientes de uma extremidade do tubo. Para iniciar este procedimento, retire o filhote da represa e coloque-o em um prato seguro coberto com roupa de cama comum.Usando um aplicador de ponta de algodão, aplique uma geléia de anestésico local, 2% de xilocaína no Áries a ser ocluído. Deixe o filhote descansar no prato por cerca de três minutos. Lucin no filhote é a etapa mais crítica neste procedimento.A cura deve ser tomada durante a inserção do tampão nasal para evitar sangramento e danos aos tecidos. Em seguida, pegue o filhote e segure-o suavemente, mas com segurança, na mão não dominante com a mão dominante, pegue um nariz, tampe e passe a mesma geléia anestésica local ao redor da ponta da qual o fio não está saliente. Isso atuará como um anestésico para qualquer dor menor associada à inserção do plugue e um lubrificante dentro do nes.Insira suavemente o tampão nasal segurando firmemente o filhote e girando lentamente o plugue com empurrões muito suaves até que o plugue esteja totalmente inserido e apenas a rosca de dois milímetros esteja saindo do Áries. Não deve haver sangramento de nenhum dos Áries durante este processo. Filhotes com sangramento durante a inserção do tampão nasal não podem ser usados para o experimento.Deixe o animal descansar no prato por cinco minutos para se habituar ao plugue Antes de iniciar o treinamento para evitar contaminação por odores, prepare a cama perfumada em uma capela e, usando luvas novas, coloque 500 mililitros de cama de lascas de madeira em um saco plástico. Use uma seringa para retirar 0,3 mililitros de extrato de hortelã-pimenta e borrife sobre a roupa de cama no saco plástico. Feche o saco, agite o saco vigorosamente e deixe a roupa de cama descansar no saco por cinco minutos, coloque a roupa de cama perfumada em uma caixa de treinamento de acrílico rasa e transparente de 20 por 20 por cinco centímetros descoberta na hotte por cinco minutos antes de usar.Assim que a roupa de cama estiver preparada, descarte as luvas usadas. Não permita que as luvas entrem em contato com os animais. Coloque 500 mililitros de roupa de cama sem perfume em outra caixa de treinamento de acrílico limpa e certifique-se de que não entre em contato com roupas de cama perfumadas ou luvas usadas.Comece o paradigma de condicionamento de odor colocando o filhote habituado na cama perfumada para odor experimental. Além disso, filhotes positivos para OS de acidente vascular cerebral. Acaricie o filhote por 30 segundos.Usando um pincel pequeno, use movimentos circulares rápidos principalmente ao redor da região traseira do filhote. O acariciar induz a liberação de norepinefrina para o bulbo olfatório e o córtex olfatório. Isso serve como um estímulo incondicional.Deixe o filhote descansar por 30 segundos. Repita os 30 segundos de carícia, seguidos de 30 segundos de descanso por um total de 10 minutos. Quando os 10 pares de carícias e odor estiverem completos, remova o filhote da caixa de condicionamento.Remova o tampão nasal e devolva o filhote à barragem para controle. Odor apenas para filhotes negativos do sistema operacional. Coloque o filhote habituado na cama perfumada por 10 minutos sem acariciar.Após 10 minutos, remova o filhote da caixa de condicionamento. Remova o tampão nasal e devolva o filhote à barragem. O teste de preferência de odor lateralizado é realizado em vários momentos após a sessão final de treinamento.O teste é realizado em uma câmara de teste de aço inoxidável de 30 por 20 por 18 centímetros que é colocada em cima de duas caixas de treinamento de acrílico separadas por uma zona neutra de dois centímetros. Uma caixa de treinamento contém roupa de cama perfumada, enquanto a outra caixa contém roupa de cama limpa e sem perfume. Prepare uma cama com aroma de hortelã-pimenta e uma cama sem perfume, conforme mostrado anteriormente, e coloque cada caixa sob lados opostos da câmara de teste.Dois centímetros de distância. Coloque a malha plástica no piso da grade de metal da câmara de teste. Remova o P da barragem e coloque um pouco firme de graxa de silicone inodora no Aries que está ocluído.Durante o treinamento, a graxa pode ser reaplicada durante todo o primeiro procedimento de teste, conforme necessário. Coloque o filhote na zona neutra da câmara de teste. Permita que o filhote explore a câmara por um minuto, registrando quanto tempo o filhote passou nos dois lados da câmara, ou seja, sobre hortelã-pimenta ou cama com aroma neutro.Transfira o filhote para uma câmara de plástico coberta e deixe-o descansar por um minuto. Repita as tentativas de teste por um total de 10 minutos, mudando a orientação inicial do filhote na câmara para controlar as preferências de direção. Imediatamente após o teste, limpe a graxa do Áries.Insira um tampão nasal de polietileno no Áries oposto, seguindo o mesmo procedimento de reclusão RY demonstrado anteriormente, e deixe o animal descansar por 10 minutos. Posteriormente, o teste de preferência de odor lateralizado é realizado no filhote. Outra vez. Quando o teste estiver concluído, remova o plugue e devolva o filhote à barragem.A reclusão estreita única durante o treinamento de odor mais carícias leva a uma memória de odor lateralizada que é confinada aos NRIs poupados. Quando os filhotes são testados quanto a uma preferência de odor com o mesmo nary isolado que durante o treinamento, eles mostram uma preferência pelo odor condicionado. Isso não foi observado quando o teste foi feito com o oposto isolado.Em contraste, os grupos de controle apenas de odor não mostram preferência de odor, independentemente de qual doença esteja ocluída. Durante o teste, o treinamento de odor lateralizado resulta na ativação lateralizada do sistema olfatório durante a exposição ao odor, imuno-histoquímica do bulbo olfatório ou OB e córtex piriforme anterior ou um PC mostrou significativamente menos Creb fosforilado no hemisfério ocluído após a exposição ao odor em comparação com o hemisfério poupado contralateral. A coloração de Nissel demonstra corpos celulares comparáveis na camada de células mitrais do OB e na camada de células piramidais do PC de ambos os hemisférios.24 horas após a remoção do tampão nasal expressão do caranguejo ervilha Após a exposição ao odor nas células mitrais do OB e as células piramidais no PC são comparáveis entre os hemisférios ocluído e poupado. Isso indica que o efeito de uma única reclusão experimental é transitório e reversível e não resulta em danos neuronais visíveis a longo prazo que possam afetar a percepção do odor e a ativação neuronal aos odores durante o teste. Uma vez dominada, a oclusão de NA pode ser feita em menos de cinco minutos se for realizada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante ter muito cuidado ao obstruir a narina. Qualquer força excessiva ou técnica inadequada pode causar sangramento e, portanto, danos à narina Após este procedimento. Outros métodos, como eletrofisiologia ex vivo e técnicas moleculares, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre a plasticidade sináptica.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar oclusões estreitas unilaterais temporárias para lateralizar o aprendizado de odores e dissecar os circuitos neurais que sustentam a formação da memória.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Larvas de Drosophila são capazes de associar estímulos odor com recompensa gustativa. Aqui nós descrevemos um paradigma comportamental simples que permite a análise da aprendizagem associativa apetitiva olfativo.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

O objetivo deste protocolo é investigar a cognição espacial em roedores. O labirinto aquático duplo-H é um teste novo, que é particularmente útil para elucidar os diferentes componentes de aprendizagem, consolidação e memória, bem como a interação dos sistemas de memória.

O Double-H labirinto: um teste comportamental robusto para Aprendizado e Memória em roedores

Este protocolo descreve como silenciar temporária e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os ratos estão envolvidos em tarefas de aprendizado e memória. A abordagem combina farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusivamente-Ativados-por-Designer-Drugs) com um paradigma comportamental (pré-condicionamento sensorial) que é projetado para distinguir entre diferentes componentes de aprendizagem.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

Aqui, treinamos os ratos em uma tarefa de aprendizagem associativa para testar a discriminação do odor. Este protocolo permite também para estudos sobre aprendizagem-induzido mudanças estruturais no cérebro.

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Anteriormente, desenvolvemos protocolos para Caenorhabditis elegans para formar memórias associativas de curto e longo prazo por treinamento em massa e espaçado, respectivamente. Aqui, protocolos detalhados são descritos para o condicionamento de C. elegans pelo emparelhamento de 1-propanol e ácido clorídrico como estímulos condicionados e incondicionados, respectivamente, para formar memória associativa aversiva.

Aprendizagem associativa aversiva e formação de memória emparelhando dois produtos químicos em Caenorhabditis elegans

Descrevemos aqui métodos para induzir e analisar a remodelação olfativa dependente da experiência dos glomérulos sinápticos do lobo antenal no cérebro juvenil de Drosophila .

Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

Este protocolo descreve a construção de um olfatômetro para experimentos de comportamento olfativo go/no-go. Instruções passo a passo, juntamente com imagens, são fornecidas para garantir a construção bem-sucedida do olfatômetro. Informações para solucionar problemas encontrados durante o processo também estão incluídas.

Construindo um olfatômetro para estudos de comportamento olfativo de roedores

Uma barreira significativa para o estudo da atividade celular durante processos cognitivos como aprendizado e memória é o uso de anestésicos para preparação de imagens in vivo . A anestesia prejudica a memória de curto prazo e a cognição em vários modelos, incluindo Drosophila. Este estudo apresenta um método único para preparar Drosophila adulta para imagens in vivo sem anestesia.

In vivo Imagem da atividade neural em moscas adultas Drosophila não anestesiadas

Aqui nós descrevemos métodos para testar C. elegans aprendizagem associativa e de curto e longo prazo memória associativa. Estes ensaios população empregar as habilidades worms para chemotax direção odores voláteis, e formar associações positivas sobre o emparelhamento de alimentos com a butanona chemoattractant. Aumentar o número de períodos de condicionamento induz memória de longo prazo.

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

Aprenda aprendizado lateralizado de preferência por odor em ratos recém-nascidos usando oclusão unilateral de narina. Este método reduz variabilidade interanimal e permite investigar mecanismos neurais da formação de memória olfativa.

Um Modelo de Aprendizagem lateralizados Odor em ratos recém-nascidos para Dissecando Formação Neural dos circuitos Consolidação da Memória (Vídeo) | JoVE Journal

Um Modelo de Aprendizagem lateralizados Odor em ratos recém-nascidos para Dissecando Formação Neural dos circuitos Consolidação da Memória

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