Name: A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda uma técnica inovadora de transferência gênica in vivo e ensaios celulares in vitro para estudar diferenciação de osteoclastos e efeitos de citocinas na osteoclastogênese em modelos murinos e humanos.

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A pesquisa foi parcialmente apoiada pelas bolsas de pesquisa do NIH R01 AR062173 e SHC 250862 para a IEA. ES é o destinatário da bolsa de pré-doutorado NIH T32 CTSC.

1. Entrega hidrodinâmica de sRANKL DNA MC <ol><li> Entrega hidrodinâmica via mouse cauda Veia <ol><li> Pesar o mouse antes da injeção veia da cauda. Diluir sRANKL ou proteína fluorescente verde (GFP) de MC em solução de Ringer (pré-aquecer a 37 ° C) em um volume total de ~ 10% do peso do corpo do rato. </li><li> Aqueça o rato em uma gaiola por 10 min antes da injeção, a fim de dilatar os vasos sanguíneos e fazer nervuras laterais (VEs) visíveis. Monitorar o mouse com cuidado para evitar a desidratação e hipertermia. </li><li> Assim que os VEs estão dilatados e visíveis, transferir o mouse para o limitador e insira a ficha longe o suficiente para o barril para conter o movimento. Monitorar o mouse para a atividade normal, como respirar. Ajuste a ficha do limitador, se necessário. </li><li> Desinfectar a zona da injecção de 3/4 a partir da ponta da cauda com um algodão embebido em álcool. Use uma agulha G 27-30 para mouse injeção veia da cauda. Segure a cauda firmemente com uma mão e inserir a agulha emna veia da cauda. Aplique pressão na seringa e completar a injeção dentro de 5-7 seg. </li><li> Retire a agulha da veia da cauda e aplicar pressão com uma bola de algodão no local da injeção para parar o sangramento. Monitorar o mouse por 15-30 min, em seguida, transferir o mouse de volta ao viveiro uma vez que a taxa de respiração é reduzida para a taxa normal. </li></ol></li><li> A confirmação da sistêmica Rato sRANKL Expressão e Quantificação de Rato Serum TRACP5b Mensagem Gene Transferência <ol><li> Aqueça o rato em uma gaiola por 5-10 min, a fim de dilatar os vasos sanguíneos e fazer LVs visível. Monitorar o mouse com cuidado para evitar a desidratação e hipertermia. </li><li> Fazer uma pequena incisão com uma lâmina de cauda do rato num sítio uma frente a partir da ponta da cauda. </li><li> Colete aproximadamente 100 mL de sangue em tubos de separação de soro. </li><li> Incubar os tubos de separação de soro à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 5 minutos e recolher soro. Store soro de -80 ° C para posterior análise. </li><li> Realizar sRANKL ELISA e ensaio do rato TRACP5b soro em amostras de soro usando um kit comercial disponível. </li></ol></li></ol> 2. Geração in vitro de osteoclastos de rato BMMs <ol><li> O isolamento e cultura de BMMs <ol><li> Isolamento da tíbia e os ossos do fêmur: Eutanásia o mouse doador com CO2, e desinfectar as pernas com etanol 70%. Dissecar a partir do osso púbico até o osso calcâneo, para remover o fêmur ea tíbia ossos intactos. </li><li> Retirar a pele e músculo cuidadosamente sem danificar o osso. Coloque fémur e tíbia processada em uma placa de Petri contendo tampão de fosfato salina (PBS). </li><li> Remoção de medula óssea: Corte a ponta de um lado do fêmur e da tíbia ossos e expulsar da medula óssea em um tubo de 50 ml utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 25 G, carregado com α-MEM contendo 1% de penicilina / estreptomicina (Osteoclasto Meio de Cultura / OCM). </li><li&gt; Processo de medula óssea: Misturar e transferir a suspensão de medula óssea para um novo tubo de 50 ml por passagem através de um filtro de células de 70 mM de nylon. Centrifugar as células a 300 x g e re-suspensão em α-MEM contendo 1% de penicilina / estreptomicina e 10% de SBF (meio de cultura de osteoclastos / OCM (+)). </li></ol></li><li> Culturas de macrófagos <ol><li> Contar as células usando um hemocitômetro ou contador automático de células. </li><li> Placa 1 x 10 6 culas por po para uma placa de 6 poços ou 3 x 10 5 células de lamelas de vidro (5 mm) ou fatias de dentina colocadas em placa de 96 poços e incuba-se a 37 ° C. </li><li> Aspirar todo o meio contendo células não aderentes e as células incubar a 37 ° C com nova OCM (+) contendo 25 ng / ml de rato M-CSF durante 48 horas. </li><li> Aspirar todos os meios e incubar as células a 37 ° C, com fresco OCM (+) mídia contendo 25 ng / ml rato M-CSF, e 30 ng / ml sRANKL mouse para iniciar a osteoclastogênese. Reabastecer media a cada 3 dias, conforme necessário. </li><li> Cultivar célulasdurante aproximadamente 6-8 dias, para formar células gigantes multi-nucleares capazes de reabsorção óssea. Assim que as células multinucleadas aparecer, execute TRAP (fosfatase ácida tartarato resistente) coloração utilizando um kit comercial disponível, e quando totalmente amadurecido, realizar ensaios funcionais. Visualize anéis F-actina em lamelas usando mancha phalloidin e imagem das células aderidas à dentina fatias por microscopia eletrônica de varredura (SEM), como descrito anteriormente 19. </li></ol></li></ol> 3. Geração in vitro de osteoclastos a partir de PBMC humanas <ol><li> Isolamento de PBMC Humano <ol><li> Adicionar 10 ml de pré-aquecido de Histopaque-1077 para um tubo de 50 ml. </li><li> Filtro de leucócitos vazio obtido a partir do banco de sangue com PBS estéril para um tubo de 50 mL (proporção de 1:1 de sangue com PBS). Camada do sangue diluído sobre a solução histopaque muito lentamente, certificando-se de que o sangue não se mistura com o histopaque. </li><li> Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 20 min a 18 ° C. Seguiring centrifugação, cuidadosamente isolar a camada buffy coat branco que contém as células brancas do sangue e transferir para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Dilui-se as células com PBS e centrifugar novamente a 650 xg durante 5 min para recolher as células. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células em OCM (-) media e contagem de células utilizando contador de células. </li></ol></li><li> Chapeamento e cultivando PBMCs <ol><li> Ressuspender as células em OCM (+) e meios de placa de 8 x 10 6 células / ml por poço numa placa de 6 poços ou de 1 x 10 6 células / ml por poço em placas de 96 poços. Células da placa em lamelas de vidro (5 mm), tal como exigido para imagiologia por imunofluorescência, bem como em fatias de osso adequadas para ensaios de reabsorção óssea, como previamente descrito 20. </li><li> Alterar meios de cultura, repondo as células com M-CSF humano a cada 2-3 dias ou quando necessário. Em seguida, avance para o passo de diferenciação no dia 5 pela adição de 30 ng / ml de sRANKL humano junto com 25 ng ml M-CSF humano / no OCM (+) de mídia para iniciar osteoclastogenesé. </li><li> Cultivar células em, aproximadamente, 14 a 21 dias para formar células gigantes multi-nucleares. Assim que as células multinucleadas aparecer, estas células podem então ser marcados de TRAP, e quando totalmente amadurecido, ensaios funcionais podem ser realizadas. Anéis de F-actina pode ser visualizado em lamelas utilizando faloidina mancha. A morfologia das células pode ser examinado em células ligadas à dentina fatias por SEM. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Condições músculo-esqueléticas são as principais causas de morbidade e incapacidade e são compostas de mais de 150 doenças e síndromes; afetando cerca de 90 milhões de americanos hoje. Inflamação das articulações e destruição óssea são características predominantes de doenças músculo-esqueléticas, incluindo artrite e osteoporose. A osteoporose é uma condição que enfraquece a integridade óssea, muitas vezes levando a fraturas do osso. A artrite é uma doença crônica, debilitante doença caracterizada pela inflamação das ar...

Doenças músculo-esqueléticas afectam milhões de pessoas nos Estados Unidos e apresentar conseqüências graves para os sistemas nacionais e locais de saúde 1. Estes distúrbios são caracterizados por perda de massa óssea e da função articular que requerem tratamento extensivo e longos períodos de recuperação. Vulgarmente, um aumento relativo no número e / ou actividade dos osteoclastos, as células especializadas para reabsorver osso, na osteoporose e artrite observadas é 2. Sob condições fisiológicas, o número e a actividade dos osteoclastos é regulada pelo activador do receptor do factor nuclear κ-B ligando (RANKL), o qual é produzido por osteoblastos. A osteoprotegerina (OPG), um receptor de engodo para RANKL também é produzido por osteoblastos três modelos animais in vivo que envolvem a sobre-expressão sistémica de sRANKL, ou deleção de OPG são muito valiosas na pesquisa de osteoporose.; No entanto, estes métodos requerem a geração de ratinhos transgénicos 4,5. Aqui, uma nova alternativaMétodo de overexpressing sRANKL para o estudo de desordens relacionadas com musculoesqueléticas é descrito. Especificamente, minicírculo (MC) a tecnologia de DNA e métodos de entrega hidrodinâmicas foram utilizadas para conseguir a transferência do gene de sRANKL in vivo e sobre-expressar rato sRANKL sistemicamente 6. Este método também é complementar a outros modelos in vivo de osteoporose, tais como a modulação hormonal de osteoclastos seguintes ovariectomia 7 e a intervenção dietética com uma dieta pobre em cálcio 8. Estes modelos são muito úteis para estudar os diferentes aspectos de distúrbios osteomusculares relacionados ao porém eles necessitam de procedimentos cirúrgicos e pode demorar até vários meses, a um custo significativo 9. Ovariectomizadas (OVX) modelo de roedor é um modelo animal experimental em que a remoção dos ovários leva à deficiência de estrogênio imitando assim osteoporose pós-menopausa humana 10. Human osteoporose pós-menopausa, uma condição em que o estrogênio Deficiparência leva ao aumento do risco de fraturas ósseas e osteoporose afeta cerca de oito milhões de mulheres nos Estados Unidos. Embora o modelo de OVX é útil para a osteoporose pós-menopausa que oferece vantagens limitadas em estudar a osteoporose em geral. Estrogen suprime a perda óssea, induzindo a inibição de osteoclastos e osteoblastos apoptose, portanto, na sua ausência de um aumento da actividade dos osteoclastos é observada 10-12. A relação de desequilíbrio RANKL-OPG que favorece a reabsorção óssea também é observada 13. No entanto, a deficiência de estrogénio, in vivo, também é acompanhada por uma diminuição dos níveis de factor de crescimento transformante β (TGF β), o aumento da interleucina-7 (IL-7) e de TNF, IL-1 e IL-6, 14,15. Como estas citocinas conhecidas funções moduladores de remodelação óssea independente da via de RANKL, é impossível atribuir qualquer activação dos osteoclastos unicamente ao eixo RANKL-RANK. O modelo descrito neste trabalho permite aos pesquisadores estudar em vivo eixo RANKL-RANK na osteoclastogênese e perda óssea sem citocinas pró-inflamatórias em comparação com modelos de roedores OVX. Além disso, técnicas in vitro osteoclastogênese são ferramentas essenciais para estudar a ativação dos osteoclastos para potenciais tratamentos terapêuticos de doenças músculo-esqueléticas. Estudos anteriores também mostraram que a cultura de medula óssea do rato macrófagos derivados (BMMs) com o mouse macrófagos fator estimulador de colônias (M-CSF) e mouse sRANKL pode levar a diferenciação de osteoclastos 3,16,17. Aqui, os protocolos de produção de células semelhantes a osteoclastos multinucleadas da medula óssea de rato, bem como a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro, 18 encontram-se descritos. Os ensaios baseados em células necessárias para definir um osteoclasto terminalmente diferenciadas e totalmente funcional madura também são descritas resumidamente. Estas técnicas in vitro complementar o romance em abordagem vivo e servem como pinstrumentos de investigação owerful para estudar a diferenciação dos osteoclastos e ativação. Utilizando estes sistemas, os cientistas são capazes de gerar os osteoclastos in vivo e in vitro e definir os estímulos e sinais necessários para a sua proliferação e activação, assim como testar a eficácia dos inibidores farmacológicos e biológicos.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Humano RANK-Ligand - solúvel</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - solúvel</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer para camundongos</td><td>Braintree</td><td>TV-150 </td> Kit ELISA Quantikine para Mouse STD <td></td></tr><tr><td>TRANCE/RANK L/TNFSF11&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Fosfatase Ácida, Leucócitos (TRAP)</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio MouseTRAP&nbsp;</td><td>sistemas de imunodiagnóstico</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo técnica gene transferência e in vitro ensaios baseados em células para o estudo da perda óssea em distúrbios osteomusculares

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A diferenciação e ativação dos osteoclastos desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de doenças musculoesqueléticas, pois essas células estão envolvidas principalmente na reabsorção óssea. Os osteoclastos podem ser gerados in vitro a partir de células precursoras de monócitos/macrófagos na presença de certas citocinas, que promovem a sobrevivência e a diferenciação. Aqui, são demonstradas técnicas in vivo e in vitro, que permitem aos cientistas estudar diferentes contribuições de citocinas para a diferenciação, sinalização e ativação dos osteoclastos. O sistema de transferência de genes de entrega de DNA em minicírculo fornece um método alternativo para estabelecer um modelo relacionado à osteoporose é particularmente útil para estudar a eficácia de vários inibidores farmacológicos in vivo. Da mesma forma, protocolos de cultura in vitro para a produção de osteoclastos a partir de células precursoras humanas na presença de citocinas específicas permitem que os cientistas estudem a osteoclastogênese em células humanas para aplicações translacionais. Combinadas, essas técnicas têm o potencial de acelerar os esforços de descoberta de medicamentos para terapias direcionadas específicas para osteoclastos, o que pode beneficiar milhões de pacientes com osteoporose e artrite em todo o mundo.

Aqui, uma técnica de transferência de gene novo para a diferenciação de osteoclastos in vivo e os protocolos de cultura de células para a diferenciação de células precursoras em osteoclastos in vitro, como um método para estudar os efeitos das citocinas em osteoclastogénese são descritos. Na Figura 1, os resultados representativos de transferência de gene bem sucedida da GFP e rato sRANKL MC em ratinhos são mostrados. Na Figura 2, as imagens representativas de medula ó...

A diferenciação de células precursoras em osteoclastos é regulada por citocinas e fatores de crescimento. Aqui, uma nova técnica de transferência de genes para diferenciação de osteoclastos in vivo e protocolos de cultura de células para diferenciar células precursoras em osteoclastos in vitro como um método para estudar os efeitos das citocinas na osteoclastogênese são descritos.

A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

O objetivo geral é relatar uma nova técnica de transferência de genes para diferenciação de osteoclastos in vivo. Também descrevemos protocolos de cultura de células para diferenciar macrófagos da medula óssea de camundongos de pbmc humano em osteoclastos. Este vídeo será dividido em três partes.Um, entrega hidrodinâmica de minicírculo de líquen, DNA, duas gerações de osteoclastos in vitro de camundongos, macrófagos da medula óssea e três gerações de osteoclastos in vitro de pbmc humano. Parte um, entrega hidrodinâmica do minicírculo de líquen rank, DNA. A animação a seguir mostra uma breve visão geral da entrega hidrodinâmica por meio da injeção de veias da cauda do camundongo.Primeiro coloque o mouse sob um mapa de calor por 10 minutos antes da injeção. Isso dilata os vasos sanguíneos e torna as veias laterais mais visíveis. Em seguida, localize o local da injeção e prossiga com a injeção, certificando-se de concluir a injeção dentro de cinco a sete segundos.A próxima parte deste vídeo mostrará um relato mais detalhado dos procedimentos envolvidos na entrega hidrodinâmica via veia da cauda do rato. Reúna os materiais para uma injeção. Aqueça o mouse em uma gaiola por 10 minutos a

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Um exame longitudinal de perda óssea nos fêmures e tíbias de ratos adultos foi realizada após uma lesão da medula espinhal usando seqüencial de baixa dose de raios-X scans. Tibia perda óssea foi detectada ao longo do estudo, enquanto a perda óssea no fêmur não foi detectado até 40 dias após a lesão.

Avaliação longitudinal do rato Perda Hind Limb óssea após lesão medular usando Novel, In vivo Metodologia,

Os modelos animais são freqüentemente utilizada para estudar metástase de câncer de osso. Neste protocolo, iremos descrever dois métodos comuns de inoculação do tumor para estudos de metástase óssea e descrever brevemente algumas das análises utilizadas para monitorar e quantificar esses modelos.

Modelos de metástase óssea

A medida quantitativa da função progenitor óssea na consolidação da fratura requer alta resolução tecnologia de imagens em série. Aqui, os protocolos são fornecidos para o uso de microscopia intravital e rastreamento osteo-linhagem sequencialmente imagem e quantificar a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco / progenitoras osteogênicas endógenos no processo de reparação de fratura óssea.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Combinado imagiologia óptica e μCT num modelo de rato com infecção de implante ortopédico, utilizando uma estirpe bioluminescente engenharia de Staphylococcus aureus, desde a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente controlar a dinâmica da infecção bacteriana, assim como a resposta inflamatória correspondente e alterações anatómicas na osso.

Combinado<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT imagem para monitorar infecções, inflamações, and Bone Anatomy em uma infecção Orthopaedic Implant em Ratos

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

Descrevemos um protocolo in vivo para medir a dorsiflexão do pé após estimulação do nervo fibular e contração do compartimento crural anterior do membro posterior do rato. Essas medições são uma ferramenta translacional indispensável para avaliar a patologia do músculo esquelético e as abordagens de engenharia de tecidos para reparo e regeneração muscular.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Pequenos peixes de laboratório tornaram-se modelos populares para pesquisa óssea sobre os mecanismos subjacentes aos distúrbios ósseos humanos e para a triagem de drogas moduladoras ósseas. Neste relato, descrevemos um protocolo para avaliar o efeito do alendronato em células ósseas em larvas de medaka com lesões osteoporóticas.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

O objetivo do presente protocolo é gerar um modelo de fratura de compressão vertebral osteoporose-relacionados do rato nude que pode ser avaliada no sentido longitudinal na vivo usando uma microcomputed semiautomated baseado em tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural.

Semiautomated Longitudinal baseados em Microcomputed tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural de um modelo de fratura Vertebral relacionadas com osteoporose rato Nude

O protocolo proposto envolve uma abordagem global para avaliar a formação óssea no contexto da regeneração óssea usando análises multimodais. Tem como objetivo fornecer informações qualitativas e quantitativas sobre a nova formação óssea, aumentando o rigor e a validade das investigações básicas e pré-clínicas.

Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

O modelo de lesão da medula óssea murina é uma ferramenta útil para estudar a osteogênese pós-natal por ossificação intramembranosa. Este protocolo cirúrgico simplificado descreve o procedimento de ablação da medula óssea para avaliação a jusante da nova formação óssea e respostas celulares após a lesão.

Metodologia aprimorada para estudar a osteogênese pós-natal via ossificação intramembranosa em um modelo de lesão da medula óssea murina

Aqui, apresentamos uma abordagem de terapia gênica que fornece quitosana revestida com ABE diretamente na medula óssea por injeção intraóssea.

Entrega e expressão gênica aprimoradas usando injeção intraóssea de nanopartículas de quitosana encapsuladas em plasmídeos editores de base de adenina

Aprenda uma técnica inovadora de transferência gênica in vivo e ensaios celulares in vitro para estudar diferenciação de osteoclastos e efeitos de citocinas na osteoclastogênese em modelos murinos e humanos.

A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares (Vídeo) | JoVE Journal

A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

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