Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é permitir a detecção de pequenas expressões de RNA de embriões, tecidos ou células de Deano gaster. Isso é feito extraindo primeiro o RNA das fontes biológicas selecionadas. O segundo passo é fracionar o RNA por eletroforese ao longo de um gel de acrilamida para resolver padrões de migração de baixo peso molecular.

Em seguida, as espécies de RNA são transferidas e quimicamente reticuladas para um suporte sólido neutro. A etapa final é rotular moléculas candidatas recozendo-as com sondas antisense específicas. Em última análise, a autorradiografia é usada para revelar sinais que refletem a expressão das moléculas em análise.

Este método de bloco norte sem resposta não pode responder a questões-chave no campo da biologia do RNA, como os níveis de estado estacionário de moléculas de RNA totalmente expressas. Para começar, cresça as duas células da drosófila Schneider a uma densidade de uma a cinco vezes 10 elevado ao sexto por mililitro. Em seguida, separar as células semiaderentes pipetando e centrifugar as células a 100 GS por minuto.

Alternativamente, acumule embriões em placas de postura de ovos. Limpe os embriões com um pincel e água destilada, filtre-os com uma peneira dupla, depois enxágue e recupere os embriões em um tubo, adicione 100 microlitros de extração de RNA, reagente e pilão. Homogeneizar a amostra.

Realize o isolamento de RNA seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, avalie a concentração de RNA por um espectrofotômetro UV e certifique-se de que a pureza do RNA esteja próxima de 2,0 com base em um A dois 60. Mais de duas leituras de 80.

Em seguida, prepare um gel aros desnaturante e deixe a solução de gel esfriar. Quando a temperatura atingir 60 graus Celsius, adicione 10 mililitros de 10 x esfregões e oito mililitros de 37% de formaldeído. Despeje o gel em uma célula de eletroforese horizontal.

Deixe o gel solidificar sob um capuz por uma hora após a solidificação, mergulhe o gel em 500 mililitros de um tampão de esfregão. Em seguida, Eloqua, dois microgramas de amostra de RNA e um micrograma de escada. Adicione três volumes de corante de carregamento aros ao RNA e à escada.

Aqueça as amostras a 80 graus Celsius por cinco minutos e resfrie-as imediatamente no gelo. Carregue as amostras e execute o gel a 50 volts por uma hora com reciclagem ocasional de tampão. Prepare 10 mililitros de solução de acrilamida bis acrilamida a 10% em um tampão X, sete molares de uréia a 100 microlitros de 10% de amônio por sulfato e 10 microlitros de tetraetil etilenodiamina e misture rapidamente a solução imediatamente.

Despeje o gel entre placas de vidro limpas e insira o wellcome com cuidado, evitando a formação de bolhas. Deixe o gel polimerizar em temperatura ambiente por 45 minutos antes de usar. Próximo Eloqua, 0,5 a 20 microgramas de RNA total Para cada amostra, adicione um volume igual de corante azul de acrilamida a cada amostra.

Em seguida, desnature as amostras aquecendo a 80 graus Celsius por cinco minutos e resfrie-as no gelo até o carregamento. Remova as placas de vidro do suporte de fundição e monte-as na célula de eletroforese. Encha a câmara interna e externa com 500 mililitros de tampão de corrida ou rb.

Em seguida, remova suavemente o pente e pré-execute o gel a 200 volts por 10 minutos. Em seguida, passe o RB por uma seringa para lavar os depósitos de uréia dos poços. Em seguida, use pontas planas para estratificar cuidadosamente as amostras do fundo de cada poço.

Após as amostras, insira o gel a 100 volts por cinco minutos. Aumente a tensão para 200 volts. Corte seis pedaços de papel mata-borrão para caber na área de mata-borrão e um pedaço equivalente de membrana de náilon não carregada.

Umedeça as folhas de papel e a membrana em RB e molhe completamente as almofadas apertando-as repetidamente em rb. Em seguida, retire o gel do aparelho e abra os óculos com a espátula. Use um cortador limpo para remover os poços.

Coloque uma folha de papel watman úmido sobre o gel e levante-a com cuidado. Coloque a membrana de nylon na face livre do gel e marque um canto para orientar o filtro de acordo com o carregamento da amostra. Complete o sanduíche colocando três pedaços de papel de cada lado.

Em seguida, role uma haste de plástico na superfície da mancha para remover possíveis bolhas de ar. Coloque o borrão entre dois absorventes e coloque os absorventes no. Monte o no módulo de borrão.

Construa a câmara com rb e verifique se a membrana de náilon está entre o gel e o terminal positivo. Em seguida, transfira o RNA a 20 volts por 20 minutos. Sintetizar a sonda estabelecendo uma reação direta de fosfato em 10 picaMoles de oligonucleotídeo antisense específico, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Prepare seis mililitros de solução de reticulação fresca ou XLS. Em seguida, sature um pedaço de papel mata-borrão de 10 por 10 centímetros no XLS. Em seguida, desmonte o borrão e coloque a membrana na teia.

Três mm. Tome cuidado para que o RNA não esteja em contato direto com o papel saturado e coloque o filtro e o papel entre as duas placas de vidro e embrulhe-os em filme plástico. Em seguida, mantenha a membrana a 60 graus Celsius por duas horas.

Em seguida, lave a membrana com água bidestilada duplamente. Pré-aqueça 10 mililitros de solução de hibridização ou HS a 37 graus Celsius. Desnature um miligrama de esperma de salmão a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Deixe esfriar no gelo e adicione ao hs. Em seguida, incube o filtro em HS a 37 graus Celsius por uma hora com rotação em um forno de hibridização. Substitua o hs esgotado por uma alíquota nova de 10 mililitros.

Aqueça a sonda a 95 graus Celsius por 10 minutos. Resfrie no gelo e adicione a sonda a um novo hs. Incube o filtro a 37 graus Celsius durante a noite.

Após incubação durante a noite. Enxágue o filtro no tampão de lavagem e lave-o bem por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, use um detector Geiger Mueller para verificar se há radioatividade residual nos cantos do filtro.

Quando a emissão de fundo for de cerca de cinco CPS, prossiga para a exposição da membrana. Exponha o filtro em uma tela de gerador de imagens moleculares. Use a conversão digital para revelar sinais.

O Northern blot aprimorado ou ENB garante maior sensibilidade em relação ao Northern blot padrão ou SNB, conforme ilustrado por esta figura da detecção auto-radiográfica do P-I-R-N-A Rasi four. Ao longo de uma titulação de RNA total extraído de testículos de moscas adultas. O sinal aumenta proporcionalmente com a quantidade de RNA fracionado, indicando que a relação dose-resposta está em uma faixa linear de detecção.

O método aplica-se com sucesso a RNAs longos, bem como a RNA ribossômico de cinco s, desde que obtenham cinco primos livres e um comprimento adequado para fracionamento de acrilamida. Esta técnica de bloqueio sem resposta torna possível o perfil da expressão de RNA de pequenas amostras com menos de um micrograma, com uma melhoria média de 10 a 30 vezes no RNA, detecção de alvos, em relação às versões padrão que obtivemos em nossas condições.