Name: Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a técnica de Northern Blot aprimorada para detectar pequenos RNAs em Drosophila melanogaster. Este método permite visualizar padrões de expressão de RNA com alta sensibilidade em amostras biológicas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, o Centre National de la Recherche Scientifique, da Université de Strasbourg, o Hôpital de Estrasburgo, a Associação pour la Recherche sur le Câncer, o Instituto Nacional do Câncer du, a Agence Nationale de la Recherche ea região da Alsácia. Pietro Laneve tem sido apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale. Atualmente, ele é um receptor de um companheirismo Istituto Italiano Tecnologia (IIT). Os custos de publicação são suportados pela rede Neurex (TriNeuron - Programa Interreg IV Alto Reno)

Coleção 1 Amostra <ol><li> Separe duas células semi-aderente de Schneider, (1-5 x 10 6 células, em média), por pipetagem e colhê-las por centrifugação (100 xg por 1 min). Em caso de in vitro células aderentes cultivadas, trypsinize-los em condições normais ou diretamente coletá-los de placas em uma quantidade conveniente de reagente de extração de RNA, com a ajuda de um raspador de células. </li><li> Para a coleta de embriões, crescer estirpes de Drosophila em gaiolas mosca e deixar acumular embriões em placas de ovos de postura. Wipe embriões fora por um pincel em água destilada (dH2O), descartar detritos por crivo de filtragem, lavagem e recuperação de embriões num frasco 48. </li><li> Como uma técnica alternativa, dissecar manualmente os tecidos / órgãos. Isolar testículos (um sistema preferencial para análise piRNA) de Drosophila abdômen em tampão fosfato (PBS) sob microscópio estereoscópico (aumento de 20X), usando agulhas de dissecação ou fórceps como visualized em Sullivan et al 49. </li><li> Pilão homogeneizar amostras sobre vício de 0,5 volumes de reagente de extração de RNA. </li></ol> 2 Extração de RNA / Análise <ol><li> As instruções do fabricante efectuar o isolamento do RNA através de reagentes comerciais. CUIDADO! Agentes de extração de RNA são geralmente tóxico e corrosivo. Alternativamente, aplicam um protocolo baseado em Proteinase K para o isolamento de ARN de 50, como se segue: <ol><li> Diluir as amostras em 400 ul de paragem Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Recuperar os componentes hidrossolúveis de fenol padrão: clorofórmio: álcool isoamílico e extracções de clorofórmio e de etanol (EtOH) a precipitação / lavagem. Air secar as amostras e ressuspender em dietilpirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com dupla destilada (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Avaliar a concentração de ARN por espectrofotometria de UV. Também garantir a pureza RNA é alta, perto de 2.0, based em A 260 / A leitura 280. </li><li> Verificar preparação de ARN em gel de agarose desnaturante, como se segue: <ol><li> Num copo limpo, dissolve-se 1,2 g de agarose em 82 ml de DEPC-ddH2O, sob agitação contínua. Ferva até dissolver completamente. </li><li> Permitir que a solução gel para esfriar; quando a temperatura chega a 60 ° C adicionar 10 ml de ácido 4-10X morpholinepropanesulfonic (MOPS) buffer para 1X concentração final (FC), e 8 ml de formaldeído a 37% para 3% FC. CUIDADO! formaldeído é uma substância cancerígena. </li><li> Verter o gel numa célula de electroforese horizontal. Permitir que o gel solidifique sob uma capa, durante pelo menos 1 hr. Após solidificação, submergir o gel em MOPS 1X. </li><li> Alíquota de 2 mg de amostra de RNA e 1 mg de Escada (use um marcador de RNA quando avaliação precisa é desejada). Adicionar 3 volumes de corante de carga de agarose (ALD) de ARN e a escada. Aquece-se a 70 ° C durante 5 minutos e imediatamente em gelo fresco. CABuição! Índice de ALD (brometo de etídio e formamida, veja Materiais) são mutagênico e corrosivo, respectivamente. </li><li> Coloque as amostras e correr o gel a 50 V durante cerca de 1 hora com tampão de reciclagem ocasional. Verifique o padrão de RNA fracionamento através da visualização de imagens UV ou gel. Reconhecer bandas discretas correspondentes a 28S e 18S ARNr e ARNt (ver Figura 1). </li></ol></li><li> Siga para norte Ensaio ou loja de RNA a -80 ° C. </li></ol> 3. desnaturação Acrylamide Gel Preparação <ol><li> Use um pequeno aparelho verticais eletroforética para esta etapa de fracionamento (tamanho da placa de cerca de 8 cm x 9 cm, espessura pente 0,75 milímetros). </li><li> Montar copos limpos juntos em um quadro de qualidade. </li><li> Preparar 10 ml de 10% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) solução de MOPS 1X, 7 M de ureia. Imediatamente antes de servir, adicione 100 ml de 10% de persulfato de amónio e 10 ml de Temed e misture rapidamente a solução. CUIDADOA acrilamida! É neurotóxica e cancerígena. </li><li> Despeje o gel entre as placas de vidro e inserir o pente bem cuidado para evitar bolhas. Deixar o gel de polimerizar à temperatura ambiente durante pelo menos 45 min antes da utilização. Em alternativa, guarde o O gel / N, embrulhado em papel de filtro umedecidos com água e selado em saran wrap. </li></ol> Preparação 4 Amostra <ol><li> Aliquota 0,5-20 ug de ARN total para cada amostra. Se o volume for superior a 3-4 mL, a amostra seca sob vácuo. </li><li> Para a determinação do tamanho, executar-se uma alíquota (20-30 cps) radiomarcado de escada de baixa gama de amostras em paralelo, tal como um marcador (ver secções 4.3 e 4.4 para a preparação). Tratá-lo em paralelo com as amostras, como descrito no passo 4.5. </li><li> Ladder: criar uma reação direta de fosfato utilizando 0,1 g de uma escada de 10 bp-passo. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos e parar a reacção pela adição de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 20 mM de FC. </li><li> Purifica-se por precipitação de EtOH / lavagem, ar seco eressuspender em ddH 2 O (cerca de 100 mL). CUIDADO 32 P é uma fonte radioactiva. </li><li> Para cada amostra, adicionar um volume igual de corante azul de acrilamida (ABD). Desnaturação por aquecimento a 80 ° C durante 5 minutos e deixar arrefecer sobre gelo até à carga. ATENÇÃO! Formamida (conteúdo em ABD) é corrosivo. </li></ol> 5. Electrophoretic Fracionamento <ol><li> Retirar as placas de vidro a partir do suporte de fundição e montá-los adequadamente na célula de electroforese. Preencha ambos câmara interna e externa com suficiente tampão de corrida (RB). </li><li> Remova cuidadosamente o pente e pré-executar o gel a 200 V durante 10 min. Antes de colocar as amostras, lavar depósitos de uréia dos poços por esguichar alguns RB através de uma seringa. </li><li> Utilizar pontas planas para estratificar cuidadosamente amostras de 4,5 passo no fundo de cada poço. Verifique as conexões de ânodo e do cátodo para evitar a execução invertida. Após as amostras de entrar no gel a 100 V durante 5 minutos, increase a tensão de 200 V. </li><li> Para um comprimento de fraccionamento de cerca de 7 cm, a 45 min-longo prazo é suficiente. Evite Azul de bromofenol (um pigmento de rastreamento em ABD) a transbordar o gel. </li><li> Visualizar no gel os RNAs longos fraccionados por brometo de etídio (EtBr) a coloração, como um passo opcional: <ol><li> Cortar a 2 cm da superfície do gel e lavar rapidamente a fatia em ddH 2 O. </li><li> Incubar a fatia de gel, à temperatura ambiente, durante 15 min com Shacking suave em RB, EtBr a 0,5 ug / ml de FC. </li><li> Destain o gel durante 15 minutos em RB, visualizar longos rRNAs por irradiação de UV ou de imagem em gel. Verifique se há carga RNA e qualidade (veja a Figura 1, Painel 7). CUIDADO! Brometo de etídio é um agente mutagênico. </li></ol></li><li> Enquanto isso proceder blotting a parte inferior do gel contendo as espécies de ARN pequenas. </li></ol> 6. Gel Blotting <ol><li> Corte 6 pedaços de papel mata-borrão para caber na área da mancha e uma peça equivalente de uncharged membrana de nylon. Umedeça as folhas de papel, membrana e duas almofadas de mancha em RB. Certifique-se de mergulhar completamente as almofadas por várias vezes apertando-as em RB. </li><li> Remover o gel a partir do aparelho e abrir os vidros por meio de uma espátula. Usar um cortador limpa para remover os poços. Coloque uma folha de papel filtro molhado no gel e cuidado, retire-se. </li><li> Colocar a membrana de nylon sobre a face livre do gel. Marcar um canto para orientar o filtro de acordo com a carga da amostra. Complete o &quot;sanduíche&quot; (3 peças de papel de cada lado). Rolar uma vareta de plástico na superfície da mancha, para remover eventuais bolhas de ar. </li><li> Coloque a mancha entre duas almofadas de mata-borrão e, em seguida, na cassete borrar. Monte o cassete no módulo de mata-borrão, encher a câmara com RB e procure a orientação correta (membrana de nylon deve ficar entre o gel eo terminal positivo). </li><li> Transferir a 20 V durante 20 min. Nota: para garantir condições homogêneas, depois de 10 min abrir o módulo de mata-borrão e rotate o sanduíche em 180 ° antes de completar a transferência. </li></ol> 7 Membrana reticulação <ol><li> Prepare a 6 ml de solução de reticulação fresco (XLS). Saturar com 10 cm x 10 cm (maiores do que uma membrana de nylon) pedaço de papel mata-borrão com XLS. ATENÇÃO! HCl (um componente de XLS) é altamente corrosivo. </li><li> Desmantelar o blot e colocar a membrana sobre o papel de filtro 3MM molhado. Nota: RNA não deve estar em contato direto com o papel saturada. Colocar o filtro eo papel entre duas placas de vidro e enrole em Saran-wrap. </li><li> Aquece-se a membrana a 60 ° C durante 2 horas, seguido por uma lavagem ddH2O. Armazenar a -20 ° C ou prosseguir para a hibridação. </li></ol> 8 Membrana prï¿½hibridaï¿½o <ol><li> Se RNA carregamento tenha sido verificado (etapa opcional 5.5), vá diretamente para a hibridização. Ou então, cortado distância de 1 cm para a parte superior do filtro de nylon, a fim de evitar sonda cruzada hybridizations a RNAs longos fraccionados. </li><li> Pré-aqueça 10 ml de solução de hibridação (HS) a 37 ° C. Desnaturar um mg de esperma de salmão a 95 ° C durante 5 min, em gelo frio e adicionar a SH. </li><li> Incubar o filtro em HS a 37 durante pelo menos 1 hora, sob rotação, em um forno de hibridação. Verifique se o RNA-side do filtro enfrenta HS. </li></ol> 9 Probe Synthesis <ol><li> Configurar uma reação direta de fosfato em 10 pmol de oligonucleotídeo antisense específico, conforme descrito no item 4.3. </li><li> Adicionam-se 5 volumes de Tris-EDTA-NaCl (RT) para o tampão de reacção e purifica-se o iniciador marcado de nucleótidos não incorporados por cromatografia de exclusão em gel numa coluna de Sephadex G-25 (ou também por precipitação de EtOH). Sonda actividade pode ser avaliada por cintilação líquida contador. </li></ol> 10 Membrana Hibridização <ol><li> Substitua o HS exausto com um novo 10 ml alíquota (preparado e complementado conforme descrito acima). Aqueça a sonda em95 ° C durante 10 min, em gelo fresco e adiciona-se a novos HS. Incubar o filtro a 37 ° C NA. </li></ol> 11 Membrana de lavar <ol><li> Recuperar a solução de hibridização e armazená-lo a -20 ° C numa caixa de blindagem de radioactividade. </li><li> Lave o filtro em tampão de lavagem (WB) e lave-o bem por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Use um Geiger Mueller Detector para verificação radioatividade residual nos cantos de filtro. Quando a emissão de fundo é de cerca de 5 cps, proceder à membrana exposição. </li></ol> Detecção de Sinal 12 <ol><li> Exponha o filtro em filmes de autorradiografia ou na tela de um gerador de imagens molecular ON. Revelar sinais por processamento fotográfico ou conversão digital. </li><li> Analisar a intensidade da banda por software quantificação dedicado (ImageJ ou Optiquant). </li></ol> 13 Membrana Stripping <ol><li> Para remover sinais primários, submergir a membrana em 500 mL de solução de decapagem de ebulição, Em seguida incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Proceder-se a novos (pré) hibridação ou armazenar o filtro a -20 ° C. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Embora a nossa apreciação do sofisticado entrelaçamento por meio do qual o RNA regula a neurogênese é cada vez maior, as implicações mecanicistas de circuitos baseados no RNA que afetam a biologia neural de células-tronco, a diferenciação neuronal / integração funcional, desenvolvimento de patologias neurais e cânceres permanecem inexplorados. A manutenção dessas redes através de reinos faz com que o potencial dos sistemas genéticos como Drosophila melanogaster instrumental para desvendar caminhos celulares ine...

RNA bioquímica tem experimentado avanços espetaculares nos últimos anos 1. A nossa compreensão de ARN potencial no controlo da expressão de genes tem sido perfurados por a identificação de poderosos noncoding ribo-reguladores 2, com a descoberta de novos mecanismos de regulação baseados no RNA 3,4 e por uma caracterização mais profunda de eventos pós-transcrição já conhecidos 5. Todos biologia RNA juntos estes estudos têm permissão para fazer drasticamente a cena, tornando-se um importante tema de pesquisa na paisagem científica atual. Em particular, nos últimos anos estamos recebendo uma noção do impacto generalizado do &quot;mundo de RNA&quot; em neurobiologia molecular 6, um dos campos de pesquisa mais dinâmicos da ciência da vida moderna. Na última década do século passado, o cenário científico global foi revolucionado pela descoberta da interferência de RNA 7,8 e dos pequenos RNAs regulatórios 9,10nomeadamente em matéria de microRNAs 11, endogenamente expressa pequenos RNAs não-codificantes envolvidos no controle de quase todas as funções celulares como reguladores pleiotrópicos e combinatórias de expressão gênica. Quase 10 anos depois de miRNA descoberta inicial em Caenorhabditis elegans por Ambros e laboratórios da Ruvkun, renovada atenção voltou-se para o campo quando um elevado número de miRNAs foram identificados em Drosophila e em células humanas, bem 12-15. Desde então, graças às abordagens transgênicas versáteis, Drosophila melanogaster tem se destacado como um contexto biológico valioso para aprofundar em miRNA biossíntese e atividade. Drosophila miRNAs têm revelado funções distintas em processos de insetos específicos ou conservados evolutivamente, que vão desde o envelhecimento ao metabolismo, vias de sinalização , comportamento e, é claro, neurogenesis. Ao longo desta direção, que recentemente lançou um novo link de 16 em co intriganterrelation ocorrendo entre o gene mestre GCM / glide ea via RNA. O fator de transcrição fly Gcm / Glide 17-19 constitui um exemplo único de determinante do destino da célula, o que determina a escolha destino neuronal glial vs. em multipotentes voar precursores neurais 20. Vinte anos longa investigação sobre este tema sublinhou claramente a ocorrência de múltiplas e sobrepostas entradas de regulação da expressão gênica convergindo sobre GCM / deslizar 21-28 para estabelecer os limiares necessários para equilibrar a relação delicada entre as partes neuronais e gliais durante o desenvolvimento neural. Descobrimos que a regulação via DMEL-miR279 segmentação representa um novo nível de controle que contribui para a pós-transcricional ajuste fino da GCM / deslizar expressão 16. Melhorias metodológicas específicas Globalmente, estas linhas de pesquisa têm exigido: ao longo dos anos, várias tecnologias originalmente desenvolvidas para analisar tradRNAs itional foram convertidos para quantificar pequenos RNAs não codificantes, como como ensaios de proteção RNase cDNA matrizes 29-31, em tempo real, métodos de PCR e sequenciamento 32-35 36,37. Por outro lado, a recalibração de abordagens técnicas promoveu avanços contínuos no campo. Northern blot (NB, ou ensaio de mancha de gel de ARN) constitui um exemplo representativo: é largamente utilizado para o perfil de acumulação de ARN, uma vez que garante a expressão de nível de quantificação, bem como determinação do tamanho. No entanto, a fraca sensibilidade intrínseca do método é limitante quando é para ser aplicada à expressão do gene finas sintonizadores baixa abundantes, como RNAs curtos. Uma consequência prejudicial é o requisito de grandes quantidades de RNA total, o que torna difícil a sua aplicação para amostras biológicas específicas. Por tais razões, variantes NB específicos para detecção de RNAs pequenos foram desenvolvidos 38-40: aproveitamos uma melhor proc NBedure 41 (ENB, Avançado Northern Blot), enquanto elucidar a interação entre DMEL-miR279 e GCM / glide acima referido. Este método baseia-se num passo de reticulação química com base na actividade de um derivado de carbodiimida [1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fixar o ácido nucleico em suportes sólidos. Carbodiimida é um agente de reticulação versátil conhecida para catalisar a formação de ligações amida entre os grupos carboxilo activados ou fosfato e os grupos de amina 42. Esta propriedade pode ser explorada para acoplar covalentemente pequenos RNAs através do seu grupo 5 &#39;-hidroxilo de mono-fosforilada em grupos amino na superfície de membranas de nylon. A configuração do acessório resultante aumenta a acessibilidade do ácido nucleico imobilizado e, por sua vez, a eficiência da hibridação sonda-alvo, o que resulta em aumento notável de detecção 43. A técnica assume particular relevance em estudos moleculares de Drosophila, pelo que a ocorrência de aulas novas e distintivas de pequenos RNAs não-codificantes está emergindo 44. Entre estes, rasiRNAs 45,46 constituem um subtipo específico de RNAs-interagindo Piwi (piRNAs 47), envolvidos no silenciamento de genes de seqüência específica. Detalhes da operação deste método estão completamente descritos e visualizadas a seguir, em relação com a análise da microRNAs DMEL-miR279 e DMEL-miR286 e, pela primeira vez, de uma rasiRNA, rasi4. Nós levado ao extremo este método, o que nos permitiu revelar alvos mal expressas de quantidades mínimas de RNA (menos de 1 mg).

<table><tbody><tr><td>COMPOSIÇÃO FINAL/NOME</td> CATÁLOGO <td>DA EMPRESA</td><td>(Estoque)</td><td>COMENTÁRIOS</td></tr><tr><td colspan="4">REQUISITO GERAL</td></tr><tr><td>Centrífuga, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Descontaminante, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>Aplicar em vidro/plástico, limpar e enxaguar Inibidor</td>de</tr><tr><td>RNase, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Perigoso //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">PREPARAÇÃO DE AMOSTRA</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo, M60</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&nbsp;</td></tr><tr><td>1,8 mM KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA EXTRAÇÃO/ANÁLISE</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imager, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>Eletroforesys Horizontal, Mini-Subcélula GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de extração de RNA, Reagente TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>Perigoso</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 1:1 para extração</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Clorofoma, 1:1 para extração</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2.5 vol. para precipitação, 70% para lavagem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Régua de Genes 1Kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Stop Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x Solução</td><td></td><td></td><td></td>RSB</tr><tr><td>2% dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Nunca resfrie SDS para evitar precipitação //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinase K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Tampão Padrão de Reticulócitos (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr>Gel <td></td><td></td><td></td><td>de agarose desnaturante</td></tr><tr><td>1,2% Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Deixe o gel solidificar por pelo menos 1 hora //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M MOPS sal de sódio, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>Não confunda sal de sódio MOPS com MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>Corante</td><td></td><td></td><td></td>de Carregamento de Agarose</tr><tr><td>1x MOPS Tampão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Perigoso //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Perigoso //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Brometo de etídio (EtBr) 30 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Perigoso //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">PEQUENAS FRACIONAÇÕES DE RNA</td></tr><tr><td>Pontas de carregamento de gel plano</td><td>Concentrador SpeedVac Savant da Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>Eletroforese Vertical, Mini-PROTEAN Tetra Cell&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr>Gel <td></td><td></td><td></td><td>de Acrilamida Desnaturante</td></tr><tr><td>10% acrilamida/bis-acrilamida (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>Perigoso. Deixe o gel polimerizar por 45 min antes de usar</td></tr><tr><td>1x Tampão TBE (ou 1x Tampão MOPS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M ureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0.1% persulfato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&nbsp;</td></tr><tr><td>0,1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Régua Genética Ultra Baixa Escala Escada de DNA (10 bp-step)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Label 0.1 &mu; g, conforme descrito na reação de "marcação da sonda"</td></tr><tr><td>Corante Azul de Acrilamida&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Perigoso //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer de Execução (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Buffer MOPS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RB alternativo: 1x Buffer</td><td></td><td></td><td></td>TBE</tr><tr><td>1x Buffer</td><td></td><td></td><td></td>TBE</tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td></td><td>de coloração em gel</td></tr><tr><td>Brometo de etídio 0,5 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Perigoso //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>Mancha por 15 min com EtBr, destain por 15 min sem EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM Papel Whatman</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de Nylon Neutro, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td colspan="4">CROSSLINKING</td></tr><tr><td>Solução de reticulação (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-metilimidazol (v/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>Sempre prepare uma alíquota fresca de XLS //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12,5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Perigoso //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3,1% EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HIBRIDIZAÇÃO</td></tr><tr><td>Contador de Cintilação Líquida&nbsp;</td><td>Esperma de</td> Salmão Tosquiado <td>Beckmann LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>, 0.1 mg/ml&nbsp;</td><td>Sonda</td><td></td> anti-sentido Life Technologies AM9680 <td></td></tr><tr><td>rasi4 5</td><td>' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -</td>3'5s-rRNA sonda anti-sentido 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279 sonda anti-sentido 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286 sonda anti-sentido 5'-<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Kit de</td></tr> <tr><td>Purificação, Colunas Illustra MicroSpin G-25</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Pre)-Hybridization Solution (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&nbsp;</td></tr><tr>5x Solução <td></td><td></td><td></td><td>Denhardt's</td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M de fosfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA de 20 mM (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&nbsp; 60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>50x Solução</td><td></td><td></td><td></td>Denhardt's</tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1X Tampão</td><td></td><td></td><td></td>TEN</tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>Rotulagem <td></td><td></td><td></td><td>da sonda</td></tr><tr><td>0,4 &mu; Oligonucleotídeo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M 1,5 &mu; l Ci/&mu; l [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>Perigoso //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 Polinucleotídeo Quinase Tampão</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase 0,5 unidades/&mu; l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">LAVAGEM</td></tr><tr><td>Detectores Geiger Mueller</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &ndash; </td><td></td>EM77021</tr><tr><td>Buffer de Lavagem (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td>de Lavagem Rigorosos</tr>, <tr><td>0.2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 0.2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DETECÇÃO DE SINAL</td></tr><tr><td>Sistema PharosFX Plus Biorad</td><td></td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Imagem J</td><td>Disponível gratuitamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantidade Um</td><td></td> Filmes de raios X Biorad <td></td><td></td></tr><tr><td>, BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td> Revelador <td>fotossensível</td></tr><tr><td>para filmes de raios X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>Fixador para filmes de raios X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">STRIPPING</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td><td></td>de Decapagem</tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4 de 5 mM &nbsp;</td></tr><tr><td>0,1% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Adicione SDS após a fervura para evitar a formação de espuma //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

As últimas décadas têm testemunhado a explosão do interesse científico em torno de mecanismos de controle de expressão gênica em nível de RNA. Este ramo da biologia molecular tem sido grandemente impulsionado pela descoberta de RNAs não-codificantes como principais intervenientes na regulação pós-transcricional. Tal perspectiva revolucionária tem sido acompanhado e desencadeada pelo desenvolvimento de tecnologias poderosas para criação de perfil curto expressão RNAs, tanto no nível de alto rendimento (número de identificação do genoma) ou como análise-candidato único (acúmulo de estado estacionário de espécies específicas). Embora várias estratégias estado-da-arte estão atualmente disponíveis para a dosagem ou visualizar tais moléculas que fogem, ensaio Northern Blot continua a ser a abordagem elegíveis em biologia molecular para a avaliação precisa e imediata de expressão do RNA. Ela representa um primeiro passo para a aplicação de tecnologias caras mais sofisticados e, em muitos casos, continua a ser um método preferencial para ganhar facilmente descobertasem biologia ARN. Aqui nós overview um protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs fracamente expressos (ou outras espécies de pequenos RNA reguladores) de Drosophila melanogaster embriões inteiros, dissecados manualmente tecidos / adultos ou larvas em células cultivadas in vitro. Uma quantidade muito limitada de RNA é necessária e do uso de material de fluxo de células isoladas de citometria pode ser também prevista.

Seguindo o procedimento geral descrito no texto e esquematicamente representado na Figura 1, avaliou-se a expressão pequenos RNAs de amostras de ARN de complexos de diferentes origens. Na experiência apresentada na Figura 1, o RNA foi isolado a partir de duas células de Schneider de Drosophila por proteinase K, extracção controlados quanto à integridade (passo opcional: desnaturação de fraccionamento em gel de agarose) e carregado em duas vezes. Uma metade do gel foi transferid...

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir a detecção de pequenas expressões de RNA de embriões, tecidos ou células de Deano gaster. Isso é feito extraindo primeiro o RNA das fontes biológicas selecionadas. O segundo passo é fracionar o RNA por eletroforese ao longo de um gel de acrilamida para resolver padrões de migração de baixo peso molecular.Em seguida, as espécies de RNA são transferidas e quimicamente reticuladas para um suporte sólido neutro. A etapa final é rotular moléculas candidatas recozendo-as com sondas antisense específicas. Em última análise, a autorradiografia é usada para revelar sinais que refletem a expressão das moléculas em análise.Este método de bloco norte sem resposta não pode responder a questões-chave no campo da biologia do RNA, como os níveis de estado estacionário de moléculas de RNA totalmente expressas. Para começar, cresça as duas células da drosófila Schneider a uma densidade de uma a cinco vezes 10 elevado ao sexto por mililitro. Em seguida, separar as células semiaderentes pipetando e centrifugar as células a 100 GS por minuto.Alternativamente, acumule embriões em placas de postura de ovos. Limpe os embriões com um pincel e água destilada, f

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Interferência de RNA tem se mostrado muito eficaz para analisar a função do gene...

RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado de marcação gênica endógena para Drosophila, que utiliza uma técnica baseada em PCR para identificação livre de marcadores de modificações genéticas bem-sucedidas, facilitando o desenvolvimento de linhagens estáveis.

Estratégia baseada em CRISPR em uma etapa para marcação gênica endógena em Drosophila melanogaster

Drosophila é um modelo bem estabelecido para estudar moléculas-chave que regulam a miogênese. No entanto, os métodos atuais são insuficientes para determinar a dinâmica transcricional do RNAm e a distribuição espacial dentro dos sincícios. Para resolver essa limitação, otimizamos um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA, permitindo a detecção e quantificação de mRNAs em escala de molécula única.

Estudando a Dinâmica Transcricional Muscular em Escalas de Molécula Única em Drosophila

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

O protocolo descreve o método de hibridização in situ de fluorescência sensível a polimorfismos de nucleotídeo único (SNP-FISH) para distinguir transcritos de RNA ribossômico derivados do locus de DNA ribossômico do cromossomo X ou Y em Drosophila melanogaster.

Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

Este artigo descreve um protocolo eficiente de dissecação imaginária de discos e coloração de anticorpos, econômico com reagentes e facilita o manuseio de discos imaginários em pequenas quantidades.

Dissecação em pequena escala e coloração por anticorpos de discos imaginários antenas oculares e das asas de Drosophila melanogaster

Aprenda a técnica de Northern Blot aprimorada para detectar pequenos RNAs em Drosophila melanogaster. Este método permite visualizar padrões de expressão de RNA com alta sensibilidade em amostras biológicas.

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