Name: Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprenda a cultivar intestinos fetais de rato ex vivo para imagens 3D ao vivo de vilosidades em desenvolvimento. Este método permite modulação farmacológica de vias de sinalização celular.

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Agradecemos à Dra. Deborah L. Gumucio como nossa conselheira e por seu inestimável apoio na definição da cultura e dos métodos de imagem. Também agradecemos ao Dr. Jim Brodie, Dr. Hong-Xiang Lu, Dra. Charlotte Mistretta e Dra. Ann Grosse por suas contribuições para o desenvolvimento do sistema de cultura de órgãos do intestino inteiro. Discussões úteis sobre imagens forneceram excelentes conselhos do Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski e Sasha Meshinchi. Todas as imagens foram realizadas no Laboratório de Microscopia e Análise de Imagens da Universidade de Michigan. O apoio financeiro foi fornecido pelo NIH R01 DK065850.

NOTA: Todos os camundongos foram tratados com humanidade usando protocolos aprovados pela Universidade de Michigan Medical School Unidade de Medicina Laboratorial Animal e de acordo com as orientações do Comitê da Universidade de uso e cuidados dos animais. 1. Whole sistemas de órgãos Cultura <ol><li> Preparação de meios de comunicação e placas de cultura <ol><li> Em uma cultura capuz tecido, remover 5 ml de meio BGJb da garrafa estoque e adicionar 5 ml de Pen / Strep. Prepare um estoque de trabalho de mídia em um tubo de 50 ml, adicionando 1 ml de 5 mg / ml de ácido ascórbico a 49 ml de meio BGJb (com Pen / Strep). </li><li> Preparar uma placa de cultura de 6 poços por adição de 1 ml por baixo de cada um dos transwells. NOTA: Se todos os 6 transwells não são utilizados, mova transwells extras em uma nova estéril placa de 6 poços para uso posterior. Adicione 3 mL de meios de trabalho BGJb para cada uma de três placas de Petri de 10 centímetros estéreis. </li></ol></li><li> Preparação para dissecção <ol><li> Mergulhe ferramentas de dissecação em 70% ethanol e não se esqueça de manter as ferramentas limpas, enquanto trabalhava. </li><li> Configure a área de dissecação com um grande balde de gelo e coloque a placa de cultura de 6 poços e 10 centímetros de Petri com meio BGJb no gelo. Trabalhar no gelo, tanto quanto possível, enquanto dissecar e preparar o intestino para a cultura. </li><li> Anestesiar ratos fêmea adulta em uma câmara com isofluorano (100 l) antes de eutanásia por deslocamento cervical para a exploração dos intestinos fetais. </li><li> Após a colheita os fetos de sua mãe, encenar cada feto cuidadosamente de acordo com o gráfico 13 Theiler encenação. Não confie nos dias pós-coito para determinar a idade de cada feto como variações de até 24 horas, em fase de desenvolvimento são rotineiramente observado em uma única ninhada. </li></ol></li><li> Dissecção da intestinos fetais <ol><li> Eutanásia fetos por decapitação antes da remoção do intestino. </li><li> Dissecar cada intestino em 1x de Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e place-lo em uma placa de petri 10 centímetros com o trabalho de mídia BGJb. </li><li> Cuidadosamente remover o baço do estômago e do pâncreas do estômago e duodeno superior. </li><li> Suavemente separar o omento tendo o cuidado de deixar o omento ligado, tanto quanto possível, e que separa as ligações apenas o suficiente para permitir que o intestino para ser esticado. NOTA: Para o intestino mais velhos do que os que são ou E14.5 cultivadas mais do que 24 horas, cuidadosamente separar o intestino em três segmentos iguais para permitir conteúdo luminal para fluir através do intestino e ser expelido das extremidades cortadas. No entanto, para as culturas iniciadas antes E13.5, esperar até que após 24 horas de cultura antes de se separar os três segmentos do intestino para permitir que a serosa para crescer adequadamente ao longo do comprimento do intestino. </li><li> Usar uma pipeta de boca para transferir as peças intestinais para os transwells da placa de cultura (1.1.2). </li><li> Gentilmente reposicionar os intestinos como necessário para que eles fiquem em frente a Transwell. NOTA: Uma vez que os intestinos começam a se mover conteúdo luminal através do tubo, todas as torções no intestino fará uma cópia de segurança e danos ao intestino. </li></ol></li><li> Cultura e tratamento <ol><li> Remova a mídia sob o transwell, adicionar 700 mL de mídia (media de tratamento que trabalham com proteínas recombinantes adicionados ou inibidores farmacológicos), sob o transwell. </li><li> Adicionar 300 mL de meio de tratamento gota a gota, em cima dos intestinos e deixe de molho por meio da transwell. Reposicionar os intestinos, se necessário. </li><li> Mudar meio de tratamento, pelo menos, uma vez por dia ou mais frequentemente, dependendo da meia-vida do reagente de tratamento. </li></ol></li><li> Preparação de esferas de agarose de proteína embebido por uma fonte localizada de tratamento reagente <ol><li> Ressuspender as esferas de agarose em seu recipiente de armazenagem e transferência de 100 ul de esferas de agarose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Encher o volume restante do tubo estéril com 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) e misturar as contas para lavá-los. Colocar o tubo de microcentrífuga num bastidor durante alguns minutos para permitir que os grânulos se depositem no fundo e, em seguida, para fora da pipeta a partir de PBS no topo dos grânulos. Tornar a encher o tubo de microcentrífuga estéril com 1x PBS e repetir o processo de lavagem mais duas vezes. </li><li> Prepare a proteína de interesse em duas vezes a concentração desejada para o tratamento. </li><li> Misturar 5 mL de pérolas de agarose lavados com 5 l de estoque a proteína 2x e agitar suavemente as pérolas em proteína. Colocar o tubo em gelo durante 1 hora, misturando suavemente cada 10-15 min. </li><li> Lavar as contas brevemente em estéril 1x PBS, antes de colocar as contas no intestino. </li></ol></li><li> Colocação de pérolas de agarose <ol><li> Coloque suavemente as esferas de agarose no topo do intestino utilizando uma pipeta de boca com agulhas capilares puxados. Coloque as contas com extrema cautela, como manuseio descuidado pode danificar o intestino e prevenir o desenvolvimento de vilosidades no local da lesão. </li><li> Inserir o dobro de grânulos como são necessários para a análise uma vez que os intestinos irá sofrer movimentos peristálticos e cerca de metade das pérolas colocadas sairão dos intestinos mais o tempo de cultura. </li></ol></li><li> Fixação de intestinos cultivadas <ol><li> Retire cuidadosamente a mídia de tratamento abaixo do transwell e permitir que os intestinos para o ar seco por 3 min. </li><li> Adicionar 1 ml de fixador sob a transwell durante 2 min, em seguida cobrir a parte superior do intestino com 2 ml de fixador para o restante do tempo de fixação. Fixar com paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C ou durante 2 horas à temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 2 Imagem de intestinos fixas <ol><li> Imaging Wholemount <ol><li> Coloque os intestinos inteiros (com fluorescência endógena) em um slide com 100 ml de 1x DPBS. Use uma pinça para organizar cuidadosamente os intestinos. </li><li> Use um lenço de laboratório para remover cuidadosamente os DPBS e imediatamente adicione 100 ml de glicerol a 70% para fazer a mo tecidore transparente e possível aumentar a profundidade da imagem. NOTA: Se a penetração do intestino é desejado, em vez de montagem no intestino em 70% de glicerol, embeber o intestino em algumas gotas de solução de focagem claro para 10-30 min. Pipeta off a solução foco claro e montar o intestino com o Monte Clear. </li><li> Mergulhe cada um dos quatro cantos de uma lamela em massa de modelar e pegar uma pequena quantidade de argila para usar como espaçadores entre lâmina e lamela para manter a lamela de achatamento do intestino. </li><li> Selar a lamela sobre a lâmina com valap derretida aplicado com um cotonete. </li><li> Imagem do intestino de cada um microscópio confocal vertical ou invertida. Consulte a discussão para mais detalhes. </li></ol></li><li> Vibratome corte de intestino fixos (para corte transversal das estruturas intestinais) <ol><li> Intestinos inserir em 7% agarose em pequenos moldes de plástico (10 x 10 x 15 mm) e permitir que os blocos de agarose paraesfriar e solidificar. </li><li> Remova os blocos de agarose a partir dos moldes de plástico e cola blocos de agarose para a etapa de coleta vibratome com cola instantânea. </li><li> Preencha a etapa de coleta com o frio do gelo 1x DPBS. </li><li> Cortar secções com uma espessura entre 100-150 m. Para seções mais grossas usar soluções de compensação (descritos no ponto 2.1.2) para visualizar mais profundamente na seção transversal. </li><li> Despeje vibratome secções a partir da fase de recolha para um poço de uma placa de 6 cavidades, para armazenamento a 4 ° C. </li></ol></li><li> Coloração de imunofluorescência, tecidos seccionados vibratome fixos <ol><li> Colocar 5-12 secções vibratome por cavidade em uma placa de 24 poços com 1 x DPBS. </li><li> Remover 1x DPBS e adicione 500 ml de solução de permeabilização por poço. Agite delicadamente as amostras por 25 min em temperatura ambiente. </li><li> Depois de permeabilização, lavar as amostras 3 vezes com PBS 1x. </li><li> Bloquear as amostras de, pelo menos, 30 minutos em 500 ul de solução de bloqueio. </li><li> Após o bloqueio, exchange a solução de bloqueio com 500 ul de anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio e a manter as amostras a 4 ° CO / N. NOTA: As diluições de anticorpos primários que funcionam bem em cortes congelados e parafina geralmente funcionam bem em vibratome seções também, no entanto os anticorpos que exige recuperação do antígeno nuclear geralmente não funcionam bem com este protocolo (por exemplo, BrdU). </li><li> No dia seguinte, as amostras de lavar três vezes durante 15 min de cada vez com solução de bloqueio. </li><li> Após a lavagem, aplicam-se 500 ul do anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio. Envolva a placa de 24 poços com folha de alumínio para proteger os fluoróforos de luz e balançar as amostras durante 45 minutos a 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lave as amostras 3 vezes com PBS 1x por 15 minutos cada e montar as seções vibratome em slides como descrito na Seção 2.4. </li></ol></li><li> Montagem vibratome seções <ol><li> Preparar lâminas para vibratome montagem cortando fatias finas de double-stick fita e colocá-los ao longo dos lados longos dos slides. </li><li> Com cuidado, coloque 5-10 seções vibratome entre a fita dupla-stick nos slides em uma gota de 100 l de PBS 1x. </li><li> Desdobrar todas as seções e espalhá-los em uma única camada em todo o slide. </li><li> Remova qualquer excesso de agarose ou pedaços irregulares que impediria uma lamela de sentar-se plana. </li><li> Com cuidado, use um tecido de laboratório para absorver o excesso de PBS 1x de todo as seções vibratome. </li><li> Adicionar uma gota de meio de montagem aquoso no topo das secções de vibratome e depois lamela. </li><li> Sele as lamelas para as lâminas com derreteu valap aplicado com um cotonete. </li><li> Imagem seções vibratome em ambos um microscópio confocal vertical ou invertida. Consulte a discussão para mais detalhes sobre a seleção de um sistema de imagem. </li></ol></li></ol> 3 Imagens ao vivo de intestinos inteiros Intestinos colhidas a partir de fetoss depois de E12.5, com o omento ligado deixado intacto, desenvolver com sucesso vilosidades em cultura usando o sistema acima. Portanto, este sistema ex vivo permite a captura de imagens de secção z vivo do intestino em desenvolvimento, que podem ser reconstituídas para uma vista tridimensional da morfogénese ao longo do tempo. <ol><li> Configurando imagens ao vivo <ol><li> Use cola instantânea para aderir uma membrana de policarbonato indivíduo a uma tela de malha fina. Isto proporciona uma estrutura de suporte de apoio para segurar o intestino em lugar abaixo da lente de imersão do microscópio confocal vertical. Por favor, consulte a seção de discussão para mais detalhes sobre a seleção de microscópios de imagem ao vivo. </li><li> Coloque a tela de malha no centro do poço de uma placa de cultura. </li><li> Inserir o intestino dissecados sobre a membrana de policarbonato e adicionar uma gota de cola instantânea em cada extremidade. Use apenas cola suficiente para apor o intestino, mas não revesti-la! </li><li> Adicionar cultura de mídia livre de fenol vermelho abaixo do policarbonatomembrana no centro de uma das cavidades da placa de cultura. </li><li> Adicionar água para a borda exterior da placa de cultura para fornecer humidade. </li><li> Uma vez que o intestino fetal sofre ondas peristálticas semelhantes de contracção da cultura, adicionar 100 ml de uma solução a 1: 5 de xilazina em 1x PBS a 3 ml de meio para controlar o movimento do intestino, enquanto imagiologia. Esta dosagem vai controlar os movimentos intestinais por cerca de 8-10 horas, sem comprometer o desenvolvimento das vilosidades. </li><li> Para um corte transversal do intestino delgado, o intestino incorporar vivos em uma solução de 3-4% de agarose e cortou secções espessas (150-500 um) sobre um vibratome. Combinar a rigidez da agarose com a rigidez do intestino que está sendo cortada e empiricamente determinada fase de desenvolvimento. Geralmente, uma solução de agarose a 3% funciona bem para os intestinos menores de E14.5 e uma solução a 4% funciona bem para os intestinos E15-E16. </li><li> Cole as seções vibratome a uma membrana de policarbonato aposta em uma tela de malha (como na Seção 3.1.1) ecultura como descrito na Seção 3.1.2-3.1.6. </li><li> Conduzir a imagens ao vivo usando um de dois fótons microscópio confocal de fluorescência (excitação laser entre 690-1,040 nm) em uma posição vertical com uma mesa ajustável. </li><li> Dois fótons de laser sintonizado 900 nm proporciona uma penetração profunda com a melhor resolução para sinais de GFP. Reduz danos aos tecidos, enquanto Imaging. Além disso, a configuração da potência do laser de emissão mais baixa possível reduzir o dano tecidual. Tipicamente, para obter uma boa excitação de GFP, usar 12% de energia em que o laser de dois fotões. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos financeiros a divulgar.

A natureza dinâmica e interações complexas de tecido do intestino desenvolvimento requer visualização 3D para ter uma apreciação plena desses eventos morfogenéticos. Com a evolução da tecnologia de imagem, a capacidade de examinar vilosidades morfogênese em detalhe está a desenvolver / melhorar e, com isso, a compreensão da comunicação espacial e interação durante a organogênese é bastante reforçada. Os métodos alternativos para a cultura de intestinos inteiros foram também testados, mas o s...

Cada vilosidade intestinal é composta por dois compartimentos principais de tecido: uma camada superficial epitelial e um núcleo mesenquimal. O intestino delgado do camundongo é formado no dia embrionário 10, quando uma folha de endoderme se fecha e sela para formar um tubo de epitélio cercado por células mesenquimais3. Este tubo plano de epitélio sofre rápida proliferação, crescendo tanto em comprimento quanto em circunferência e sofre rearranjos dramáticos envolvendo mudanças dinâmicas na forma da célula1. Ao mesmo tempo, o mesênquima circundante também passa por muitos processos de desenvolvimento, incluindo a formação do plexo vascular, a diferenciação do músculo liso e o recrutamento de neurônios entéricos4. No intestino delgado proximal no dia embrionário 14,5, condensações (aglomerados) de células responsivas a Hedgehog e PDGF começam a se formar adjacentes ao epitélio2,5. A formação de aglomerados mesenquimais continua a se espalhar ao longo do comprimento do intestino, de modo que cobrem todo o intestino delgado no dia embrionário 16.52. À medida que os aglomerados mesenquimais se formam, as células epiteliais mais próximas dos aglomerados começam a se retirar do ciclo celular, enquanto as outras células epiteliais continuam a proliferar. As células diretamente acima do aglomerado mesenquimal que se retiraram do ciclo celular começam a mudar de forma à medida que as vilosidades emergentes se curvam no lúmen. O crescimento adicional das vilosidades é impulsionado em parte pela proliferação contínua do epitélio entre as vilosidades emergentes. Os aglomerados mesenquimais permanecem firmemente aderidos ao epitélio das vilosidades em crescimento e continuam a expressar uma variedade de moléculas de sinalização. A onda de emergência das vilosidades se propaga ao longo do comprimento do intestino delgado após a formação de aglomerados mesenquimais. À medida que o intestino continua a crescer e a região intervilosidade se estende entre as vilosidades emergentes, novos aglomerados mesenquimais se formam adjacentes ao epitélio interviloso e outras rodadas de emergência e crescimento das vilosidades ocorrem6.
O desenvolvimento sincronizado do epitélio e do mesênquima é essencial para a morfogênese das vilosidades. As moléculas de sinalização são secretadas de uma camada para a outra, onde os receptores recebem e transduzem a mensagem de sinal para coordenar o desenvolvimento entre o epitélio e o mesênquima. Os aglomerados mesenquimais atuam como centros de sinalização e expressam uma variedade de morfogênios de desenvolvimento7-10. A interrupção da formação ou padrão de agrupamento resulta na perda da emergência e do padrão das vilosidades. A inibição da sinalização do PDGF resulta em menos clusters e menos vilosidades e as vilosidades que se formam são deformadas após os clusters anormais11. A perda da sinalização Hedgehog resulta em perda completa da formação de aglomerados e falha na emergência das vilosidades2,12. Juntos, esses dados demonstram que os clusters coordenam o desenvolvimento do epitélio das vilosidades com seu núcleo mesenquimal.
Usando todo esse sistema de cultura de órgãos, somos capazes de alterar a sinalização envolvida na diafonia do cluster epitelial-mesenquimal para determinar o papel desses sinais na morfogênese das vilosidades. O seccionamento óptico confocal de dois fótons e a reconstrução permitem visualizar a formação de aglomerados e o surgimento de vilosidades em três dimensões e entender melhor as relações espaciais entre os aglomerados mesenquimais e seu epitélio sobrejacente. Estendendo o sistema de cultura para quatro dimensões, podemos capturar pilhas z de clusters e vilosidades em desenvolvimento ao longo do tempo e observar essas interações. Em última análise, a capacidade de acompanhar o desenvolvimento das vilosidades dessa maneira e observar as mudanças que ocorrem com a sinalização alterada revolucionará a compreensão das interações epiteliais mesenquimais na morfogênese das vilosidades.

<table><tbody><tr><td>Pinça de dissecação fina&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>&nbsp; 11254-20</td><td>2 pares</td></tr><tr><td>de etanol</td><td></td><td></td><td></td>70%</tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco estéril (DPBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040-133 Placas de</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>de 6 poços</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 60 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>&nbsp; </td><td></td>451007</tr><tr><td>Placas Transwell, insertos de 24 mm, membranas de policarbonato de 8,0 mm</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>6 inserções por placa</td></tr><tr><td>BGJb media</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000U/ml Penicilina; 10.000 mg/ml Estreptomicina)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 15140</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A0278</td><td>fazer 5 mg/ml de estoque, filtro, alíquota e armazenar a -20 & Pipeta</td></tr><tr><td>de boca C (montagem de tubo de aspirador Drummond 1-15 polegadas)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 21-180-10</td><td>remova o conjunto do aspirador e substitua-o por um 1.000 &micro; l ponta da pipeta que atua como um adaptador para conectar uma pipeta Pasteur de vidro de 6 polegadas.</td></tr><tr>Pipetas <td></td><td></td><td></td><td>de pasteur de vidro de 6 polegadas</td></tr><tr><td>Tubos Capilares</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>agulhas de puxar para 4</td></tr><tr><td>% Paraformaldeído</td><td>feito em 1 x PBS, pH para 7.3</td>Placas de <td></td><td></td></tr><tr><td>cultura</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>Tela de aço inoxidável de malha fina</td><td>comprada em loja</td><td></td><td></td>de ferragens</tr><tr><td>Membranas de policarbonato</td><td>Thomas scientific&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>alternativamente, corte as membranas Corning Costar 3428 dos suportes transwell</td></tr><tr><td>Compra instantânea de cola</td><td>em loja de ferragens</td><td>à base de gel preferencialmente</td><td></td></tr><tr><td>placas de 35 x 10 mm</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7% de agarose</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; A9414</td><td>prepare w/v em 1x DPBS, aquecendo para dissolver em um banho maria</td></tr><tr><td>minuciens</td><td>pinos Ferramentas de Belas Ciências&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Meio livre de vermelho de fenol (DMEM)</td> <td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>matriz de membrana basal, fator de crescimento reduzido, sem vermelho de fenol</td></tr><tr><td>3-4% agarose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414</td><td>preparar w/v em 1x DPBS, aquecimento para dissolver em banho-maria</td></tr><tr><td>Imagem de intestinos</td><td></td><td></td><td></td>fixos</tr><tr><td>Nome do Material/Equipamento Número de</td><td>Catálogo</td><td>da Empresa</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>vaselina</td><td>compra na farmácia</td><td></td><td>usada para fazer VALAP: partes iguais de vaselina, lanolina, parafina</td></tr><tr><td>lanolina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L7387</td><td>usado para fazer VALAP: partes iguais de vaselina, lanolina, parafina</td></tr><tr><td>e parafina</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>usado para fazer VALAP: partes iguais de vaselina, lanolina, parafina</td></tr><tr><td>70% glicerol em 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear e Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Compra de argila de modelagem</td><td>na loja</td><td></td><td></td>de materiais de arte</tr>, <tr><td>fita</td><td></td><td></td><td></td>dupla face</tr>, <tr><td>aplicador de algodão, cotonetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, moldes de plástico, 10mm x 10mm x 5 mm)</td><td>Tecido Tek;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de</td> slides limpeza de laboratório Kimberly Clark 34155 limpeza de tarefa delicada sem fiapos <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Theiler staging chart&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Microscópio confocal Leica SP5X&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Usado para conduzir a imagem ao vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Suporte Leica DMI 6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Usado para conduzir a imagem ao vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Meio de montagem aquoso (Prolongar Ouro)</td><td>Sondas Moleculares&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Material/Equipamento Número de</td><td>Catálogo</td><td>da Empresa</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Costar</td><td>&nbsp; 3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T-8787</td><td>usado para fazer Solução de permeabilização: 0,5% Triton X-100 em 1 x PBS</td></tr><tr><td>Soro</td><td></td><td></td> de cabra <td>usado para fazer Solução de bloqueio: 4% Soro de cabra, 0,1% Tween20 em 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; Pág. 9416</td><td></td></tr></tbody></table>

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Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

A maioria dos processos morfogenéticos no intestino fetal têm sido inferida a partir de lâminas finas de tecidos fixados, oferecendo instantâneos de mudanças ao longo do estágio de desenvolvimento. Informação tridimensional de cortes seriados finos podem ser difíceis de interpretar por causa da dificuldade de reconstrução de cortes seriados perfeitamente e manter a orientação adequada do tecido sobre cortes seriados. Recentes descobertas por Grosse et al., 2011 destacam a importância de três informações dimensional na compreensão morfogênese das vilosidades desenvolvimento do intestino 1. A reconstrução tridimensional de células intestinais isoladamente marcadas demonstraram que a maioria das células epiteliais intestinais em contato com ambas as superfícies apicais e basais. Por outro lado, a reconstrução tridimensional do citoesqueleto de actina para a superfície apical do epitélio demonstrado que o lúmen intestinal é contínua e que lúmens secundários são um artefacto sectioning. Estes dois pontos, juntamente com a demonstração de migração nuclear interkinetic no epitélio intestinal, definido o epitélio intestinal em desenvolvimento como um epitélio pseudo estratificado e não como se pensava anteriormente 1. A capacidade de observar o epitélio tridimensionalmente foi seminal para demonstrar este ponto e redefinindo morfogênese epitelial no intestino fetal. Com a evolução da tecnologia de imagem multi-fotão e software de reconstrução tridimensional, a capacidade de visualizar intacta, o desenvolvimento de órgãos está melhorando rapidamente. Dois fótons de excitação permite a penetração mais profunda menos prejudiciais para os tecidos com alta resolução. Dois fótons e reconstrução 3D de todo o intestino do feto de rato em Walton et al., 2012 ajudou a definir o padrão de vilo conseqüência 2. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura de órgão inteiro que permite ex vivo desenvolvimento de vilosidades e extensões desse sistema de cultura para permitiros intestinos para ser tridimensionalmente fotografada durante o seu desenvolvimento.

Culturas de explantes de intestino fetal inteiros permite a análise da localização, distribuição e duração das moléculas de sinalização que coordenam o desenvolvimento intestinal, como este sistema permite a manipulação da sinalização com reagentes farmacológicos ou proteínas recombinantes. O sistema de cultura Transwell (Figura 1A, reproduzido a partir de Walton et al., 2012) 2 fornece uma interface ar-líquido, o que faz com que seja possível colocar droga ou proteína embebido esfer...

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

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Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar culturas de órgãos inteiros de intestinos embrionários de camundongos, ex vivo, permitindo assim a modulação das vias de sinalização celular. Isso é feito pela primeira colheita de intestinos de camundongos de fetos entre o dia embrionário 12,5 e 18,5. O segundo passo é colocar os intestinos em uma cultura transwell ou placa de cultura de imagem viva.Em seguida, trate os intestinos com meios preparados com os inibidores farmacológicos das vias ou locais de sinalização celular. O aro acelera embebido em proteínas recombinantes para alterar a sinalização celular no topo dos intestinos. A etapa final é obter imagens dos intestinos cultivados em seções espessas de vioma ou montagem em orifício.Em última análise, a imagem confocal seguida de reconstrução tridimensional é usada para visualizar como a modulação das vias de sinalização celular afetou o desenvolvimento das camadas de tecido durante a formação das vilosidades. A demonstração visual deste método é crítica, pois o tecido embrionário é muito delicado e requer muito cuidado durante a dissecção e manuseio. Para se preparar para a dissecação, mergulhe as ferramentas de dissecação em e

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma...

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

Este artigo eo vídeo que acompanha apresentar o nosso protocolo para gerar o tecido de intestino no mouse, utilizando uma abordagem de unidades-em-andaime organóide.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Neste vídeo, descrevemos a metodologia para configurar um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações entre fragmentos de tecido intestinal de camundongos e bactérias intestinais específicas. O dispositivo consiste em dois pares de portas de entrada e saída, a primeira conectando o lúmen do tecido intestinal e fornecendo a suspensão bacteriana específica a ele, e a segunda fornecendo continuamente meios aos poços do dispositivo para manter a viabilidade do tecido...

Um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações hospedeiro-microbiota

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

Aprenda a cultivar intestinos fetais de rato ex vivo para imagens 3D ao vivo de vilosidades em desenvolvimento. Este método permite modulação farmacológica de vias de sinalização celular.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus (Vídeo) | JoVE Journal

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

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