Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

O objetivo geral deste procedimento é cultivar culturas de órgãos inteiros de intestinos embrionários de camundongos, ex vivo, permitindo assim a modulação das vias de sinalização celular. Isso é feito pela primeira colheita de intestinos de camundongos de fetos entre o dia embrionário 12,5 e 18,5. O segundo passo é colocar os intestinos em uma cultura transwell ou placa de cultura de imagem viva.

Em seguida, trate os intestinos com meios preparados com os inibidores farmacológicos das vias ou locais de sinalização celular. O aro acelera embebido em proteínas recombinantes para alterar a sinalização celular no topo dos intestinos. A etapa final é obter imagens dos intestinos cultivados em seções espessas de vioma ou montagem em orifício.

Em última análise, a imagem confocal seguida de reconstrução tridimensional é usada para visualizar como a modulação das vias de sinalização celular afetou o desenvolvimento das camadas de tecido durante a formação das vilosidades. A demonstração visual deste método é crítica, pois o tecido embrionário é muito delicado e requer muito cuidado durante a dissecção e manuseio. Para se preparar para a dissecação, mergulhe as ferramentas de dissecação em etanol a 70%.

Coloque a placa de cultura de seis poços e as placas de Petri de 10 centímetros com mídia BGJB no gelo. Em seguida, remova os intestinos dos fetos sacrificados. Disseque-os um por um em um X-D-P-B-S.

Remova cuidadosamente o baço do estômago, depois o pâncreas do estômago e o duodeno superior. Depois disso, separe suavemente o omento, deixando-o preso o máximo possível e separando as conexões apenas o suficiente para permitir que o intestino seja endireitado. Em seguida, coloque as amostras em uma placa de Petri de 10 centímetros com meio BGJB funcional.

Em seguida, use uma pipeta bucal para transferir os pedaços intestinais para os transpoços da placa de cultura. Remova a mídia de baixo do transpoço. Em seguida, adicione 700 microlitros de meio de tratamento sob o trans.

Bem, posteriormente, adicione 300 microlitros de meio de tratamento gota a gota nos intestinos e deixe-o penetrar no transpoço. Troque o meio de tratamento pelo menos uma vez ao dia ou com mais frequência, dependendo da meia-vida do reagente de tratamento. Como alternativa, coloque delicadamente as contas agro nos intestinos usando uma pipeta bucal com uma agulha capilar puxada.

Coloque as contas com extremo cuidado, pois o manuseio brusco danificará o intestino e evitará o desenvolvimento de vilosidades na área lesionada. Neste procedimento, incorpore os intestinos em 7%aros em pequenos moldes de plástico e deixe os blocos de aros esfriarem e solidificarem. Depois, remova os blocos de aros dos moldes de plástico.

Cole os blocos aros no estágio de coleta Vibram com cola instantânea. Em seguida, preencha o estágio de coleta com um X-D-P-B-S gelado. Corte as seções com uma espessura de 100 a 150 micrômetros.

Em seguida, transfira as seções do estágio de coleta para um poço da placa de seis poços para armazenamento a quatro graus Celsius. Para preparar os slides para montagem, coloque fita dupla-face ao longo do slide longo de cada slide. Coloque uma gota de um XPBS nele.

Em seguida, coloque cuidadosamente de cinco a 10 seções no slide. Desdobre todas as seções e espalhe-as em uma única camada. Do outro lado do slide.

Remova qualquer excesso de aros ou pedaços irregulares que impeçam que a lamínula fique plana. Use cuidadosamente um tecido de laboratório para absorver o excesso de XPBS ao redor das seções. Em seguida, em uma gota de meio de montagem aquoso no topo das seções.

Em seguida, coloque a lamínula sobre ela e sele-a na corrediça com vap derretido. Depois, imagine as seções do vioma em um microscópio confocal vertical ou invertido. Agora use cola instantânea para aderir uma membrana de policarbonato individual a uma tela de malha fina.

Coloque a tela de malha no centro de uma placa de cultura. Em seguida, coloque o intestino dissecado na membrana de policarbonato e adicione uma gota de cola instantânea em cada uma das extremidades. Em seguida, adicione meios de cultura livres de vermelho de fenol abaixo da membrana de policarbonato no poço central da placa de cultura.

Adicione água à borda externa da placa de cultura para fornecer umidade. Como o intestino fetal sofre ondas peristálticas de contração em cultura, adicione 100 microlitros de solução de xilazina a três mililitros de meio no centro da placa para controlar o movimento do intestino durante a imagem. Realize a imagem ao vivo usando um microscópio de fluorescência confocal de dois fótons em um suporte vertical.

Aqui são mostradas as seções transversais do tecido duodenal E 14, E 15 e E 16 recém-colhido corado com ecat aqui e dpi. Este segmento intestinal foi colhido em E 14 e cultivado por dois dias. Em E 14, o epitélio não modelado ainda estava pseudoestratificado.

Após dois dias em cultura VII são visíveis, embora estejam ligeiramente atrasados em comparação com vii. Em E 16, aqui está a reconstrução tridimensional das seções ópticas da vasculatura corada com pcam no duodeno E 14, e esta figura mostra as reconstruções tridimensionais de imagens confocais de intestinos seccionados por vioma E 15.5 que foram corados com imunofluorescência de anticorpos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar o tecido embrionário, preparar os intestinos para a cultura de órgãos inteiros e preparar o tecido para imagens tridimensionais de alta qualidade.