Name: Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a combinar microstereolitografia e eletrofiação para criar membranas PLGA com microbolsos que imitam nichos de células-tronco. Esta técnica avançada possibilita estudos sobre regeneração de córnea e comportamento celular em engenharia de tecidos.

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Reconhecemos com gratidão o financiamento do Wellcome Trust Affordable Healthcare for India e uma EPSRC Landscape Fellowship para Ilida Ortega, bem como contribuições da The Electrospinning Company Ltd.

Declaração de Ética: Os olhos utilizados neste estudo foram utilizados de acordo com a Declaração sobre a abertura em Pesquisa Animal: 1 Fabricação de PLGA biodegradáveis ​​Membranas Equipado com microbolsas <ol><li> As estruturas de anel foram criadas por uma combinação de técnicas de electrospinning microstereolithography e 31. Em essência, o processo pode ser resumido em duas partes (i) a criação de modelos PEGDA por microstereolithography e (ii) para os modelos de electrospinning para a reprodução da estrutura subjacente PEGDA (neste caso um anel microfabricado). Estes dois passos são descritos em detalhe abaixo (Figuras 1 e 2). <ol><li> A fabricação de moldes PEGDA por microstereolithography (microSL) <ol><li> Fabricar os anéis utilizando um modelo de duas camadas, com a primeira camada (L1), sendo a base da estrutura e a segunda camada (L2) apresentando 6 microbolsas com Morphologi ferraduraes em uma gama de tamanhos de 300-500 uM. O fabrico dos anéis PEGDA foi recentemente descrito por este grupo de 22. <ol><li> Criar L1, desenhando um círculo de 1,2 centímetros preto usando um programa de desenho adequado. </li><li> Criar L2, da mesma forma, mas incluem 8 estruturas em forma de ferradura branco 0,5 x 0,35 milímetros. Distribua as pequenas formas de ferradura brancos dentro da estrutura de círculo. </li><li> Salvar L1 e L2 em formato JPEG. </li></ol></li><li> Em um frasco de vidro escuro, mistura de polietileno glicol diacrilato (PEGDA, Mn = 250 g / mol), com 1% w / w canforquinona, um fotoiniciador, em um agitador magnético durante 20 min. </li><li> Expandir o feixe de laser do microstereolithography set-up usando um arranjo de lentes telescópicas e depois projetá-la em um computador programável dispositivo multimirror digitais (starter kit DMD permitiu-UV). NOTA: A DMD reflecte a imagem (neste caso, um anel) para um espelho através de um tubo de lente de comprimento focal 10 cm. A imagem é, então, dirigido pela prata-coated espelho para um frasco contendo o polímero fotoendurecível (PEGDA). </li><li> Ajuste e limpe cuidadosamente a ótica da microstereolithography configurar. </li><li> Colocar 300 mL da mistura PEGDA em um poço de uma placa de 12 poços de cultura de tecidos. Certifique-se os poços são pré-revestidos com Teflon ou outro material anti-aderente para facilitar a remoção da estrutura depois do endurecimento. </li><li> Ligue o laser azul (MBL-III 473 nm e 150 mW) e fazer o upload L1 no software ALP3-base anteriormente instalado no PC. Irradiar a primeira camada de 60 seg. NOTA: ALP3-básico é uma interface USB que permite a ligação entre o PC eo dispositivo micromirror Digital. </li><li> Adicionar ao poço 250 ul mais do PEGDA, carregar L2, tal como descrito acima e irradiar L2 durante 60 seg. </li><li> Remover o polímero não curado e lava-se com isopropanol o anel de O / N. </li></ol></li><li> Fabricação de membranas biodegradáveis ​​PLGA usando electrospinning NOTA: Os anéis PEGDA foram utilizados como moldes sobre o qual PLGA foi electrospun com o PLGA reproduzir a topografia subjacente, uma vez que é girada sobre estes modelos. Depois de girar, a folha de polímero PLGA foi descascada do coletor. A membrana última PLGA não continha os anéis PEGDA que ficaram ligados ao coletor metálico. <ol><li> Distribua os anéis PEGDA sobre uma folha de alumínio galvanizado (12 cm x 20 cm) para a criação de um colecionador electrospinning estática. </li><li> Conecte os anéis com fita condutora de carbono. NOTA: Estes anéis, uma vez formados podem ser re-utilizados como modelos para electrospinning. </li><li> Preparar a solução de polímero para a fiação. Dissolve-se o PLGA (50/50 DL-lactido (52 mol%): glicolido (48 mol%), 44 kg / mol) em diclorometano (DCM), a 20% w / w de concentração. </li><li> Mexa O / N antes do uso. </li><li> Seringas Place 4 de insulina (sem corte, agulhas 0,8 centímetros de diâmetro interno ended) em uma bomba de seringa. NOTA: Quatro seringas assegurada electrospinning mais rápido do que trabalhar com uma seringa. </li><li> Carregar 2,5 ml de uma solução de PLGA em cada seringa. </li><li> Electrospin usando uma taxa de fluxo de 30 mL / min e tensões que variam de 12 a 15 kV. Deixe uma distância entre as agulhas e o coletor de 15 cm. </li><li> Electrospin por 1 hora e 30 minutos e, finalmente, retire com cuidado a folha electrospun PLGA do coletor apoiar os anéis PEGDA. </li><li> Corte os andaimes electrospun em 22 círculos mm de diâmetro usando um furador circular e deixando a estrutura do anel posicionado no centro. </li></ol></li></ol></li></ol> Armazenamento 2. longo prazo de PLGA microfabricados Membranas Nota: Os anéis de PLGA foram fabricados e esterilizados por empresas externas credenciadas; As amostras foram irradiadas a uma gama de dose de 25-40 kGy externo. <ol><li> Monte a membrana em um pequeno recipiente (de plástico placa de Petri) e coloque-o dentro de um saco de grau médico. </li><li> Use papel de filtro para criar pequenos sacos de filtro para os dessecantes. To criar as malas, dobre o papel de filtro (125 mm de diâmetro) e cortar o semicírculo resultando em metade; em seguida, selar as pontas com fita adesiva. <ol><li> Encha três sacos de papel de filtro com 1 g de sílica de laranja, de cobalto (II), cloreto de cobre e (II), sulfato, respectivamente. </li><li> Coloque as três bolsas do dessecante no interior do saco de grau médico, juntamente com a membrana electrospun. </li></ol></li><li> Adicionar ao saco de seis ponto cartão indicador de umidade disponível no mercado para detectar qualquer acúmulo de umidade durante o período de armazenamento. </li><li> Use uma máquina de vedação de calor de vácuo para aspirar e feche o saco. </li><li> Envie as membranas anel para uma empresa externa para γ-irradiação. </li><li> Armazenar γ irradiados membranas de PLGA em uma ampla gama de temperaturas de -20 ° C a 37 ° C num ambiente húmido dentro de uma incubadora com 5% de CO 2. </li><li> Armazenamento Post, examinar o indicador de umidade para confirmar que o nível de umidade está abaixo de 30%. </li><li> Use Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para avaliar a integridade da fibra. </li></ol> 3 Isolamento de explantes de limbo Coelho explantes limbo foram isoladas de olhos de coelhos (obtidos a partir de uma fazenda onde os coelhos são criados para o consumo). <ol><li> Desinfetar os olhos de coelhos utilizando solução anti-séptica (3%). </li><li> Limpe os olhos, removendo qualquer excesso de tecido ao redor da córnea. </li><li> Separa-se a região do limbo (identificado como uma fina área circular entre a córnea (transparente) e a esclerótica (o branco)) a partir do restante da córnea utilizando um microscópio de dissecção. </li><li> Corte em segmentos (cerca de 1,5 cm de comprimento) sob o microscópio de dissecação. </li><li> Desinfectar os segmentos do limbo em solução de anti-séptico 1,5% durante 1 min. </li><li> Corte os segmentos do limbo em pedaços pequenos (100-500 um) com uma lâmina de bisturi. </li><li> Armazenar os pequenos pedaços de tecido em meio de cultura (DMEM + Glutamax: Ham&#39;s F12 (1: 1), 10% de soro fetal bovino, 1 U / ml de penicillin, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina, 10 ng / ml de EGF, e 5 ug / ml de insulina), a 37 ° C e 5% de CO 2 até à sua utilização (não mais do que 60 min). </li></ol> 4. crescimento de células do limbo explantes Coelho explantes límbicas foram colocadas em ambas as membranas e membranas microfabricados recentemente fiadas e que foram armazenados durante 6 meses a -20 ° C e embalada no vácuo. <ol><li> Revestir as estruturas de anel com 15 ul de cola de fibrina (1: 1 mistura de fibrinogénio a partir de plasma humano a uma concentração de 18,75 mg / ml e trombina a partir de plasma humano a uma concentração de 2,5 U / ml) usando um raspador de células para a distribuição de fibrina uniformemente. </li><li> Colocar os explantes de tecido directamente nas microbolsas PLGA utilizando uma agulha 25 G e um microscópio de dissecação. </li><li> Adicionar meios de cultura de células muito cuidado para não separar os explantes. <ol><li> Mudança de mídia a cada 3 dias (receita media descrito na seção 3.7) e keep em cultura durante 2 semanas a numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Corrigir as amostras com 3,7% de formol tamponado por 10 min, seguido por 3 lavagens com PBS. </li><li> Contracoloração por incubação em 1 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ou iodeto de propídio (PI), durante 10 min à TA. </li><li> Lavar 3 vezes em PBS e armazenar as amostras cobertas com folha de alumínio. </li><li> Imagem das amostras utilizando um microscópio de fluorescência em comprimentos de onda de 543 nm e 800 nm (dois fótons). </li></ol> 5.-setting up Coelho Ferido Models Córnea 3D <ol><li> Limpar e desinfectar os olhos de coelhos, como descrito acima. </li><li> Wound os olhos do coelho por imersão em hidróxido de amónio a 0,14% durante 5 min. </li><li> Lave os olhos em PBS e raspar o epitélio com uma faca sclerotome. </li><li> Cortar e isolar o botão córnea-escleral remover qualquer tecido remanescente. </li><li> Coloque as córneas lado epitelial para baixo emum copo estéril e enchem com 0,5% de agar em meio DMEM. </li><li> Uma vez definido, colocar as córneas lado epitelial para cima, em pequenas placas de Petri e adicionar meios de cultura (receita descrita acima) até a área do limbo. NOTA: Não cubra toda a córnea; manter a cultura de órgãos na interface ar-líquido. </li></ol> 6 Isolamento de limbo explantes e Inclusão de Anel Andaimes em Coelho Modelos Córnea 3D <ol><li> Revestir as membranas de anel com 15 ul de cola de fibrina (1: 1 mistura de fibrinogénio a uma concentração de 18,75 mg / ml e a trombina a uma concentração de 2,5 U / ml) .use um raspador de células, tal como descrito acima. </li><li> Colocar os explantes de tecido directamente nas microbolsas PLGA utilizando uma agulha 25 G e um microscópio de dissecação. </li><li> Colocar os anéis com os explantes de tecido sobre as córneas desnudadas com os explantes virados para cima e em condições de interface ar-líquido. (Estas condições foram anteriormente descritos 22). </li><li> Manter os modelos de cultura de órgão para4 semanas em um incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2, mudando os meios de comunicação a cada 2 dias. </li></ol> 7 Avaliação da córnea Regeneration and Stem Manutenção celular <ol><li> Após 4 semanas, corrigir as córneas usando 3,7% de formaldeído. </li><li> Processar as córneas para histologia convencional para produzir 6 um parafina. </li><li> Mancha com hematoxilina e eosina (H &amp; E). </li><li> Para imunocitoquímica, dewax as secções em xileno (3min) e re-hidratados em etanol a 100% (1 min), etanol a 70% (1 min), e água destilada (2 min). </li><li> Delinear as seções usando uma caneta Dako para delimitar áreas pequenas e evitar o uso excessivo de anticorpos. <ol><li> Tratar as áreas delimitadas com tripsina a 0,05% (100 mL) durante 20 min (37 ° C). </li></ol></li><li> Lavar cuidadosamente com PBS e adicionar 100 ul de soro de cabra a 10% (de bloqueio) durante 1 hora. </li><li> Incubar as amostras com 100 uL de anticorpo monoclonal de rato cytokera3 estanho (CK3) e 100 ul de p63 no soro O 1% de cabra / N, a 4 ° C. </li><li> Lavar com PBS e trata-se com 100 ul de anticorpo anti-ratinho secundário biotinilado (1: 1000 em 1% de soro de cabra) durante 1 h à TA. </li><li> Adicionam-se 100 ul de estreptavidina-FITC (1: 100 em 1% de soro de cabra), durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Tratar as amostras com DAPI como descrito acima. </li><li> Imagem das amostras utilizando um microscópio de fluorescência em comprimentos de onda de 800 nm (dois fótons) e 488 nm. </li></ol>

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<li>Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li>
<li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este estudo descreve (a) uma técnica para a fabricação de membranas electrospun contendo microestruturas dentro deles e (b) a preparação de tais membranas para utilização clínica de embalagem por vácuo, e, em seguida, a irradiação gama de armazenamento antes da sua utilização. Nesta aplicação particular temos desenvolvido membranas de PLGA contendo microbolsas que imitam as características físicas dos nichos de células-tronco do limbo. Os objetivos deste estudo são: (i) para descrever métodos para fornecer leitores com o conhecimento necessário para projetar e fabricar andaimes contendo microfeições para a investigação sobre a contribuição de nichos de células-tronco para regeneração de tecidos e (ii) para fornecer ao leitor uma melhor compreensão de forma a armazenar andaimes electrospun por longos períodos de tempo. Em termos de aplicação clínica, o armazenamento das membranas anel é de suma importância. Neste trabalho, a degradação do anel foi estudada ao longo de um período de 6 meses. Degradação domembranas é impulsionado por hidrólise tão simplesmente mantendo as membranas umidade sem o processo é interrompido. Blackwood et al. Relataram que através da variação da proporção de PLA em PGA, a degradação da membrana muda 32. Este estudo também demonstrou que, ao aumentar a quantidade de AGP, a taxa de degradação das membranas electrospun in vivo aumentada 22. Aqui demonstrou-se que, com a embalagem a vácuo das membranas, juntamente com alguns dessecante e irradiando-os e armazenando-os a temperaturas baixas durante 6 meses, não há nenhuma mudança na integridade das fibras e degradação. No momento, seis meses é o máximo que temos estudado com estas membranas contendo microbolsas mas os dados de armazenamento de um ano tem sido relatada em membranas electrospun simples a -20 ° C 22 e agora temos dados inéditos para o seu armazenamento a -20 ° C para 2 anos sem quaisquer sinais de degradação. Assim, para o armazenamento de longo prazo seria recomendável para armazená-los seco a -206; C, mas é possível armazená-las à temperatura ambiente, mesmo na Índia há pelo menos 6 meses (possivelmente muito mais tempo). A inclusão de um indicador de umidade dá uma forma fácil de verificar que a embalagem tem mantido membranas secas, caso em que será adequado para o efeito. Transferência de células desses anéis para modelos 3D de córnea foi mostrado ao colocar explantes limbo dentro dos microbolsas. Este grupo informou recentemente a transferência de células em um modelo de córnea de coelho in vitro, colocando explantes em membranas de PLGA simples (membranas sem estruturas de anéis) 24. Utilizando a presente andaimes microfabricados transferência de células foi dado mais um passo que podemos agora localizar especificamente explantes de tecido dentro das microestruturas. A capacidade de colocar os explantes directamente dentro dos nichos também permite que o cirurgião utilize as membranas directamente no teatro cirúrgico evitando a necessidade de uma sala de limpeza para a primeira expandir as células estaminais do limbo. Embora este pedaço de work tem sido focada no desenvolvimento de dispositivos para a doença da córnea, esta tecnologia microfabricação também pode ser aplicada para desenvolver dispositivos para diversas outras aplicações. Trabalho futuro explorar a fabricação de construções para a regeneração de outros tecidos, tais como pele e osso. Enquanto a concepção e fabrico inicial das microestruturas PEGDA pode ser demorado, uma vez fabricadas as estruturas pode ser reutilizado muitas vezes sem degradação. Portanto, a fabricação posterior de membranas biodegradáveis ​​PLGA microestruturada por eletrofiação pode ser realizada a uma taxa comparável à produção de (&#39;não estruturados&#39;) membranas planas após a montagem do coletor. Embora neste trabalho que temos utilizado microstereolithography para a fabricação dos moldes, outros métodos de fabricação, tais como 3D-impressão ou de moldagem por injeção pode ser usado também. Por conseguinte, o molde subjacente poderia ser feito de outros polímeros ou de metais em vez de PEGDA. Como tal, esta técnica é muito versátil e pesquisadores podem facilmente adaptar o método para combinar as suas próprias necessidades e instalações. A casa em microstereolithography-set-up utilizado neste estudo não irá permitir a preparação de construções com características menores de 30 um; isto não é uma limitação para a aplicação da córnea descrito aqui, mas pode ser crucial para a concepção de outros modelos. Nesse caso, os de outras técnicas, tais como 2 polimerização fóton (2PP) poderiam ser de interesse no entanto, a técnica de electrospinning poderão não permitir a reprodução das estruturas na escala sub-micron (este está a ser estudada pelo nosso grupo). As etapas críticas no processo de fabricação são: (i) Evitar o overcuring dos modelos PEGDA que podem ser controlados por tempo e quantidade de fotoiniciador de ajuste. (Ii) Controlar as condições de electrospinning, tais como temperatura e umidade. (Iii) Armazenar adequadamente o electrospumembranas n anel utilizando vácuo-embalagem e dessecantes. Em resumo, por colocação dentro de explantes de tecido do limbo das microestruturas da membrana mostrámos excrescência de células a partir dos explantes no nichos, a transferência de células para uma ferida da córnea de coelho e subsequente re-epitelização da córnea. A degradação das membranas armazenadas a diferentes temperaturas, também tem sido estudado e um protocolo de embalagem que permite o armazenamento a longo prazo das membranas tem sido desenvolvido, o último sendo essencial no desenvolvimento de membranas para utilização clínica.

A córnea, o tecido avascular mais exterior central do olho, é um dos tecidos mais importantes envolvidas na visão 1. Existem vários tipos de células que mantêm a função da córnea. A camada mais externa superior da córnea composta por células epiteliais que podem ser de cerca de 5-7 camadas de espessura 2. Essa camada impede a invasão bacteriana na córnea 3 e permite a entrada de oxigênio 4. Tem sido relatado que as células estaminais do epitélio da córnea em mentira nichos ou criptas (com tamanhos de 120-150 um) na região periférica da córnea conhecido como o limbo 5,6. Como as células estaminais se dividem, as células filhas também conhecidas como células amplificadoras transitórias viajar para fora dos nichos e divisão continua como as células se movem para dentro e para cima centripetamente resultando em células terminalmente diferenciadas na região central da córnea 7,8. Estas células são rotineiramente removido com o piscar de olhos exposing novas células por baixo 9. Além de ser o local das células estaminais epiteliais, o limbo também desempenha um papel em manter a conjuntiva vascularizado longe da região da córnea 10. Danos ao limbo pode ser causada por queimaduras térmicas / produtos químicos, radiação e também doenças genéticas 10. Quando isto acontece, a barreira de limbo é dividido permitindo que as células da conjuntiva para passar para a córnea, vascularização da região, causando dor e em alguns casos, a cegueira. A condição é conhecida como deficiência límbica (LSCD) 10. Diferentes substratos naturais têm sido descritos como transportadores de células-tronco possíveis para auxiliar na regeneração da córnea. Por exemplo, as membranas à base de colágeno foram usados ​​por Dravida et al. 11 e Rama e colaboradores 12 relataram o uso de fibrina em um estudo com 112 pacientes. No presente, porém o método mais comumente usado de tratamentoé a utilização de membrana amniótica humana a partir de um banco de tecidos e de cultura de células epiteliais do limbo na sua superfície 13,14. Uma vez que uma monocamada formou, a membrana amniótica é colado do lado de células para cima sobre a córnea danificada, que tem todas as células da conjuntiva e do tecido cicatricial cirurgicamente removido a partir dele, antes do transplante de células 14. A membrana amniótica degrada dentro de semanas a meses, deixando as células epiteliais associadas à área desnudada para regenerar o epitélio 15,16. Esta técnica tem sido bem sucedido em restaurar a visão no entanto ainda existem algumas questões práticas que restringem a sua aceitação generalizada clinicamente. À medida que a membrana amniótica é o tecido humano que precisa passar por uma triagem utilizando procedimentos bancários tecido bons antes de serem utilizados para o transplante de células em pacientes. Este rastreio só reduz o risco de transmissão de doenças, mas não pode eliminá-lo completamente 17. Além disso, há relatos de variabilidade no pESEMPENHO da membrana amniótica, devido à variação entre doador 18,19 e diferentes métodos de processamento 19,20. Juntamente com o pequeno risco de transmissão da doença, há a necessidade de centros cirúrgicos para ter acesso a bancos de tecidos bem administradas, que não estão disponíveis a todos. Embora a membrana amniótica é relativamente bem sucedida, existe uma necessidade para o desenvolvimento de novas alternativas de células portadoras biodegradáveis ​​sintéticos, para o tratamento de doenças da córnea. Transportadores sintéticos superaria a necessidade de bancário procedimentos, bem como eliminar o pequeno risco de transmissão da doença e variabilidade inter-doador. Neste sentido, os materiais tais como o polietileno-glicol e 21,22 23,24 PLGA têm sido estudados. No desenvolvimento de uma alternativa sintética para a membrana amniótica humana, há também a possibilidade de conceber nele características desejáveis ​​para ajudar a esperança de sobrevivência das células em cultura. O inclusion de microestruturas dentro de dispositivos de biomateriais para controle específico de comportamento das células é uma área emergente de interesse. Muitos autores relatam trabalho para o desenvolvimento de células-tronco artificiais nichos 25-30. Este grupo relatou recentemente a criação de um limbo PEGDA artificial microfabricado biofunctionalized-fibronectina para a entrega de células epiteliais do limbo 22 e um método para a fabricação de membranas biodegradáveis ​​contendo electrospun bolsos microfabricados para o suporte das células epiteliais do limbo 31. O objetivo deste trabalho é desenvolver uma nova tecnologia de fabricação para o desenvolvimento de dispositivos de biomateriais contendo microestruturas que imitam a uma extensão dos microambientes em que as células-tronco residir no corpo. Desenvolvemos uma técnica que combina microstereolithography electrospinning e que permite a fabricação de membranas microestruturadas biodegradáveis ​​que mostram greapotencial t para aplicações de regeneração de tecidos. É importante notar que, embora neste trabalho esta técnica foi aplicada para a fabricação de anéis para a regeneração da córnea, a tecnologia pode ser aplicada para a fabricação de dispositivos para a regeneração de uma ampla gama de tecidos epiteliais, por exemplo, da pele, oral epitélio mucosa, intestino, respiratórias e urinárias. Especificamente, no presente estudo, nós desenvolvemos uma membrana sintética biodegradável, que funciona de uma maneira semelhante à membrana amniótica para entregar células para a córnea. Esta membrana contém microbolsas de cerca de 300 um (maiores do que as criptas do limbo das Pallisades de Vogt (cerca de 150 um)). Por fim, temos estabelecido um protocolo de embalagem que permite que estas membranas a serem armazenados a -20 ° C durante mais de 6 meses sem mostrar quaisquer sinais de degradação.

<table><tbody><tr><td>Poli (ácido lático-co-glicólico)</td><td>Purac</td><td>PDLG5004</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich Ou Fisher</td><td>270997 ou D/1850/17</td><td>>99,8% contém 50-150 ppm estabilizador de amileno</td></tr><tr><td>Dispositivo Digital Micromirror (DMD) Discovery 1100 Placa Controladora & Kit Inicial</td><td>Texas Instruments</td><td>1076N732 (UV)</td><td></td></tr><tr><td>473 nm Laser</td><td>Laser 2000</td><td>MBL-III</td><td>150 mW</td></tr><tr><td>Poli (etilenoglicol) diacrilato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>475629</td><td>Mn = 250 g/mol, 500 ml</td></tr><tr><td>DEMEM + Glutamax</td><td>Fisher</td><td>12077549</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12</td><td>Labtech biosera</td><td>LMH1236/500</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Labtech biosera</td><td>FB-1090/50</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9326</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>p63</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3737</td><td></td></tr><tr><td>CK3</td><td>Merck Millipore</td><td>CLB218</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>SLS</td><td>HHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT110232-1L</td><td></td></tr><tr><td>Saco de grau médico (PET / Folha / LDPE) Bolsa destacável</td><td>Riverside Medical Ltd. Derby, Reino Unido</td><td>Laminado de folha PET/Folha/LDPE, (12,7,50)</td><td></td></tr><tr><td>Irradiação gama (Esterilização)</td><td>Tecnologias de esterilização aplicadas (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - faixa de dose externa de 25-40 KGy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sílica gel laranja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10087</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>232696</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1297</td><td></td></tr><tr><td>Cartão indicador de umidade de seis pontos</td><td>SCC, EUA</td><td>6HIC200</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de selagem a vácuo</td><td>Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td><td>VS518</td><td></td></tr><tr><td>Rolos de seladora a vácuo Andrew James 28 cm x rolos de 40 metros</td><td>Andrew James UK Ltd, Bowburn, Reino Unido</td><td>BR2805</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura (SEM)</td> <td>Philips / FEI Microscópio Confocal XL-20 SEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss LSM 510 META</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução Antisséptica Videne</td><td>Ecolab, Swindon, Reino Unido</td><td></td><td>3%</td></tr></tbody></table>

combinação de microstereolithography e electrospinning produzir membranas equipado com nichos para a regeneração da córnea

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Problemas da córnea afetam milhões de pessoas em todo o mundo, reduzindo a qualidade de vida de forma significativa. Doença da córnea pode ser causada por doenças como a aniridia ou Síndrome de Steven Johnson, bem como por fatores externos, como queimaduras químicas ou radiações. Os tratamentos atuais são (i) o uso de córneas e (ii) o uso de células-tronco expandidas em laboratório e entregue em suportes (por exemplo, membrana amniótica); estes tratamentos são relativamente bem sucedida, mas, infelizmente, eles podem falhar após 3-5 anos. Existe uma necessidade de conceber e fabricar novos dispositivos de biomateriais capazes de imitar a córnea em pormenor o meio fisiológico em que as células estaminais reside na córnea. As células estaminais do limbo estão localizados no limbo (área circular entre a córnea e esclera) em nichos específicos conhecidos como os Palisades de Vogt. Neste trabalho, desenvolvemos uma nova tecnologia de plataforma que combina duas técnicas de fabricação de ponta (microstereolithography e electrospinning) para a fabricação de membranas de córnea que imitam a um certo ponto do limbo. Nosso membranas contêm microbolsas artificiais que visam fornecer células com proteção como o Palisades de Vogt fazer no olho.

Electrospun microfabricados anéis foram fabricados com uma combinação de microstereolithography e electrospinning (Figuras 1 e 2). PEGDA anéis de tamanhos diferentes foram fabricadas usando microstereolithography (Figura 3); Esta técnica permite que as estruturas de fabricação na ordem dos centímetros e a incorporação simultânea de microestruturas. Neste caso, os anéis diâmetros variando de 1,2-1,6 cm contendo microbolsas de 350-500 um foram fabricados (Figura 4). Em termos de produção, embalagem e de esterilização de materiais para futura utilização clínica verificou-se que a embalagem em vácuo em sacos de grau médico melhorou significativamente a capacidade de atingir o armazenamento a longo prazo das membranas de PLGA (Figura 5); a utilização de um saco de grau médico (PET / folha / LDPE), com espessura de 0,12 milímetros permitiu alcançar uma vida útil mais longa. Isto foi investigado através do envio Membranes aos nossos colaboradores na Índia e as membranas foram armazenadas por um período de meses a -20 ° C, à temperatura ambiente e a 37 ° C em condições úmidas (deliberadamente uma incubadora úmida). Figura 5 mostra que, utilizando as condições deliberadamente provocativas de armazenamento a 37 ° C sob condições de humidade, as membranas eram estáveis ​​apenas durante cerca de 1 mês em condições de vácuo, não embalados, mas obteve 3 meses de armazenagem sob condições de vácuo embalado (Figura 5 e Tabela 1). A tabela 1 demonstra a melhoria das condições de armazenamento que podem ser alcançados, mesmo sob as condições selecionadas para ser propício para a absorção de água e fibra inchaço se presta atenção à escolha de saco utilizado. Os anéis apoiado conseqüência de células a partir de explantes limbo em diferentes condições (i) anéis feitos na hora e (ii) Anéis armazenadas por 6 meses (Figura 6). Transferência das células foi conseguida ao fim de 4 semanas, quando plrastreio das membranas de PLGA em modelos 3D feridos. As células cresceram para fora a partir de explantes de tecido colocadas sobre as membranas, criando um novo epitélio sobre as córneas previamente desnudadas (Figura 7). Positivos (córneas sem qualquer tratamento) e os controles negativos (córneas feridos) também foram mantidas em cultura durante os mesmos períodos de tempo. Os controlos negativos confirmou a falta de formação de um novo epitélio, na ausência de quaisquer células adicionadas. A imunocitoquímica demonstrou que as células que crescem para fora dos explantes foram as células epiteliais da córnea, uma vez que foram positivas para o marcador de diferenciação da córnea CK3 (Figura 7E). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 Esquema de microstereolithography criado para a criação de anéis PEGDA. her.within-page = "always"&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 Esquema do processo de eletrofiação utilizando anéis PEGDA microfabricados como um templates. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3 (A) mostra um exemplo de um (folha de alumínio galvanizado com anéis PEGDA) coletor de estática para a fiação de membranas de PLGA microfabricados. (B) e (E) mostram diferentes esteiras electrospun sendo desenrolada a partir de coletores estáticos. (C) mostra PEGDA modelos de diferentes tamanhos destacando a versatilidade de utilização microstereolithography para a fabricação da superfície de base (D). mostra um PLGA microfabricados réplica."target =" /files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg _blank "&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500"> Figura 4. imagem SEM de um anel com um PEGDA microfeature ferradura (A); alta ampliação da imagem SEM de um bolso microfabricado (B). Imagem de contraste de fase de um anel com um PLGA microfeature ferradura (C); imagem de alta ampliação de contraste de fase de um pocket microfabricated (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500"> Figura 5 Efeito da temperatura e do tempo de armazenamento de vácuo e não vácuo embalado PLGA (50/50) as membranas (44 kg / mol) com micro-fabricado anéis com mais de 6 meses. integridade da membrana foi pontuada como fibras completamente intactas (+++), algumas fibras inchaço (++), fibra de fusão (+) ou sem fibras intactas (-). MEV e três dessecantes (laranja sílica, cobalto (II) e de cobre (II) sulfato) não mostram alterações na integridade da fibra ou umidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500"> Figura 6 imagens de fluorescência mostrando conseqüência do LEC a partir de explantes limbo em anéis biodegradáveis ​​feitos na hora de PLGA (A, B) e em anéis após 6 meses de armazenamento a -20° C (C, D). Imagens (A) e (B) corresponde a células coradas com DAPI (azul) e iodeto de propídio (vermelho), respectivamente. Imagem b é uma vista ortogonal de um z-stack confocal de um explante colocado em um bolso microfabricated. Imagens (C) e (D) mostram coloração positiva para p63 (verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500"> Figura 7 (A) mostra um modelo de córnea de coelho ferido com um anel de andaime e explantes de tecidos localizados no andaime, que foi previamente revestida com cola de fibrina (B) e (C) são os controlos positivos e negativos.; o controle positivo é um novo rabino . t córnea e o controlo negativo de uma córnea em que o epitélio foi deliberadamente removidos (o controlo negativo também foram cultivadas durante 4 semanas) (D) é uma imagem de uma córnea de engenharia de tecidos, após 4 semanas de cultivo em H &amp; E; a figura mostra o novo epitélio de múltiplas camadas constituído pelas células que saem a partir dos explantes colocados em nichos (E) é uma imagem que mostra a imunocitoquímica excrescência de células a partir de um explante de limbo.; núcleos são corados com DAPI (azul) e as células mostra coloração positiva para citoqueratina 3, um marcador de diferenciação da córnea (verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50/50) </td> x; "&gt; integridade da fibra por membranas armazenadas a 37 ° C húmido </tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Dia 0 </td><td style="width:64px;"> Mês 1 </td><td style="width:64px;"> Mês 2 </td><td style="width:64px;"> Mês 3 </td><td style="width:64px;"> Mês 4 </td><td style="width:64px;"> Mês 5 </td><td style="width:64px;"> Mês 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> Não Embalado a Vácuo </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> Aspirado (Bag A) (PE, PA Composite) Espessura: 0,14 milímetros </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px; "&gt; - <td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> Aspirado (Bag B) (PET / Folha / LDPE) Espessura: 0,75 milímetros </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Efeito de vácuo e de armazenamento diferente sacos na integridade de PLGA (50/50) as membranas (44 kg / mol) examinada mais de 6 meses de armazenamento. Integridade da membrana foi pontuada como fibras completamente intactas (+++), um inchaço da fibra (++), fusão de fibras (+) ou sem fibras intactas (-).

Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas.

Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir a complexidade espacial 3D em andaimes de engenharia de tecidos, combinando o uso de técnicas de manufatura aditiva e eletrofiação. Isso é conseguido criando um modelo não degradável feito de polietilenoglicol, D acrl ou PEG DA, usando uma técnica de fotopolimerização camada por camada chamada micro estereolitografia. Como um segundo passo.Os modelos são fixados a um substrato metálico e uma eletrofiação é usada para produzir uma membrana biodegradável que imita a morfologia subjacente. Em seguida, são estudados os procedimentos de embalagem e degradação das membranas eletrofiadas. A degradação prematura das membranas armazenadas é evitada controlando a temperatura e a umidade.A etapa final consiste em colocar as membranas biodegradáveis em um modelo 3D de córnea ferida para estudar seu uso potencial como dispositivos de regeneração da córnea. Os resultados mostram a versatilidade do uso de técnicas de manufatura aditiva e eletrofiação para a criação de membranas complexas contendo microbolsas que imitam até certo ponto o nicho natural de células-tronco. A principal vantagem desta técnica é a sua versatilidade.Uma vez que os moldes não biodegradáveis podem ser criados novos, usando uma ampla gama de técnicas de fabricação, esse método seria de interesse nos campos de fabricação e regeneração de tecidos, e ajudaria a responder a questões-chave relacionadas ao comportamento das células-tronco e ao nicho das células-tronco. Este método de fabricação de andaimes microfabricados pode fornecer informações sobre a regeneração da córnea. Também pode ser aplicado a outros tecidos epiteliais com nichos de células-tronco, como pele e mucosa oral, ou para fornecer outros recursos 3D e andaimes para engenharia de uma ampla gama de tecidos.Tanto o líder Ortega quanto Thomas Patterson demonstrarão o procedimento. Comece este procedimento criando L one, a primeira camada. Isso se tornará a base da estrutura usando qualquer programa de desenho adequado para um círculo preto de 1,2 centímetro.Em seguida, crie L dois. A segunda camada, desenhe outro círculo preto de 1,2 centímetro, mas inclua de seis a oito estruturas brancas em forma de ferradura de 0,5 por 0,35 milímetros. Distribua as pequenas formas de ferradura branca dentro da estrutura do círculo preto.Salve L um e L dois no formato JPEG para configurar para micro estereolitografia. Primeiro, ajuste e limpe cuidadosamente a ótica do sistema. Coloque 300 microlitros de polietilenoglicol di acrl, ou mistura de PEG D em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.O poço deve ser pré-revestido com Teflon ou outro material antiaderente ou fácil remoção da estrutura. Após a cura, ligue o laser azul e carregue L um no software básico ALP três. Este software é uma interface USP que fornece o link entre o PC e o dispositivo micro espelho digital.Irradie a primeira camada por 60 segundos. Adicione ao poço mais 250 microlitros do pino. Carregue L dois e irradie L dois por 60 segundos.Remova o polímero não curado e lave os anéis com isopropanol durante a noite No dia anterior à eletrofiação, crie um coletor de eletrofiação estático distribuindo os anéis PEG DA em uma chapa de alumínio galvanizada de 12 centímetros por 20 centímetros. Prenda os anéis usando fita de carbono condutora. Prepare a solução de polilactídeo co glico ou PLGA e mexa durante a noite antes de usar no dia seguinte.Coloque quatro seringas de cinco mililitros com agulhas rombas de 0,8 centímetro de diâmetro interno em uma bomba de seringa. São utilizadas quatro seringas em vez de uma única seringa. Para garantir uma eletrofiação mais rápida, carregue 2,5 mililitros da solução de PLGA em cada seringa.Para o sucesso deste procedimento, é importante tentar manter as variáveis laro-pininas o mais constantes possível. Deixe uma distância entre as agulhas e o coletor de 15 centímetros. Defina uma vazão de 30 microlitros por minuto e tensões variando de 12 a 15 quilovolts para a eletrofiação eletrogiratória por uma hora e 30 minutos.Quando a eletrofiação estiver concluída, retire cuidadosamente a folha de esponja elétrica PLGA do coletor que suporta os anéis PEG da. Os anéis PEG DA podem ser reutilizados como modelos para fiação elétrica. Use um furador circular para cortar os andaimes eletro spon em círculos de 22 milímetros de diâmetro.Deixando a estrutura do anel posicionada no centro para preparar as membranas de PLGA para armazenamento a longo prazo. Monte cada um em um pequeno recipiente, como uma placa de Petri de plástico, e coloque-o dentro de um saco de grau médico. Coloque três sacos de dessecante dentro do saco de grau médico.Adicione ao saco um cartão indicador de umidade de seis pontos disponível comercialmente. Isso detectará qualquer acúmulo de umidade durante o período de armazenamento. Use uma máquina de selagem a vácuo para aspirar e selar o saco.Posteriormente, as membranas de PLGA são enviadas para uma empresa externa, a gama ou radiação antes do armazenamento. Neste experimento, berinjelas límbicas de coelho são isoladas de olhos de coelho obtidos de uma fazenda onde os coelhos são criados para consumo. Primeiro desinfete os olhos do coelho usando uma solução anti-séptica a 3%.Em seguida, limpe os olhos removendo qualquer excesso de tecido ao redor da córnea. A região límbica pode ser identificada como uma fina área circular entre a córnea transparente e a esclera branca. Separe a região límbica do resto da córnea.Corte a região límbica em segmentos de cerca de 1,5 centímetros de comprimento, desinfete os segmentos límbicos em solução anti-séptica a 1,5% por um minuto. Após a desinfecção, use uma lâmina de bisturi para cortar os segmentos límbicos em pedaços pequenos. Armazene os pequenos pedaços de tecido em DMEM mais meio glut max a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono ou no máximo uma hora antes do uso.Para iniciar este procedimento, use um raspador de células para revestir as membranas do anel com 15 microlitros de cola de fibrilina. Distribua a fibrilina uniformemente enquanto trabalha sob um microscópio de dissecação. Use uma agulha de calibre 25 para colocar os explantes límbicos diretamente nas microbolsas PLGA.Coloque os anéis com a explicação do tecido nas córneas desnudas previamente preparadas. Com o explan voltado para cima e em condições de interface ar-líquido, o anel PLGA umedece rapidamente e adota a forma do modelo de córnea. Mantenha os modelos de cultura de órgãos por quatro semanas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, troque o meio a cada dois dias.A microestereolitografia permite a fabricação de anéis PEG DA de diferentes tamanhos e a incorporação simultânea de micro recursos. Os anéis podem ser feitos e reutilizados de forma reprodutível e são facilmente fixados a uma folha de metal que pode ser usada como coletor de fiação elétrica. Neste exemplo, os anéis contêm micro recursos de ferradura.A eletrofiação produz réplicas de PLGA, a embalagem a vácuo das membranas de PLGA melhora significativamente seu armazenamento a longo prazo, mesmo a 37 graus Celsius em condições deliberadamente úmidas. O tipo de bolsa utilizada também afeta a estabilidade da membrana, a microscopia eletrônica de varredura e o exame dos três descantes não mostram alterações na integridade da fibra ou na umidade das fibras intactas. Crescimento celular de implantes límbicos ou suportados por anéis e anéis de PLGA biodegradáveis recém-feitos após seis meses de armazenamento a menos 20 graus Celsius.Ao colocar as membranas de PLGA em modelos de córnea ferida em 3D, a transferência de células foi alcançada após quatro semanas. As imagens H e e mostram o novo epitélio multicamadas formado pelas células que saem dos explantes colocados nos nichos. O controle negativo confirmou a falta de formação de um novo epitélio na ausência de células adicionadas.Em comparação com um epitélio de córnea convencional observado em uma córnea de coelho fresca usada como controle positivo. A imunocitoquímica demonstrou que as células que cresciam dos implantes eram células epiteliais da córnea, uma vez que eram positivas para citoqueratina três, um marcador de diferenciação da córnea. Como os coletores eletrofiatórios contendo os modelos não biodegradáveis são reutilizáveis, a produção dos scaffolds pode ser feita em duas horas quando o protocolo é otimizado.Essa técnica permite que pesquisadores nas áreas de engenharia de tecidos explorem uma nova maneira de fabricar membranas complexas de engenharia de tecidos contendo microcaracterísticas para estudar o comportamento celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um modelo microfabricado não degradável usando técnicas de manufatura aditiva ou abordagens semelhantes, como modelagem e como usar a eletrofiação para adicionar complexidade aos seus andaimes.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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