Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir a complexidade espacial 3D em andaimes de engenharia de tecidos, combinando o uso de técnicas de manufatura aditiva e eletrofiação. Isso é conseguido criando um modelo não degradável feito de polietilenoglicol, D acrl ou PEG DA, usando uma técnica de fotopolimerização camada por camada chamada micro estereolitografia. Como um segundo passo.

Os modelos são fixados a um substrato metálico e uma eletrofiação é usada para produzir uma membrana biodegradável que imita a morfologia subjacente. Em seguida, são estudados os procedimentos de embalagem e degradação das membranas eletrofiadas. A degradação prematura das membranas armazenadas é evitada controlando a temperatura e a umidade.

A etapa final consiste em colocar as membranas biodegradáveis em um modelo 3D de córnea ferida para estudar seu uso potencial como dispositivos de regeneração da córnea. Os resultados mostram a versatilidade do uso de técnicas de manufatura aditiva e eletrofiação para a criação de membranas complexas contendo microbolsas que imitam até certo ponto o nicho natural de células-tronco. A principal vantagem desta técnica é a sua versatilidade.

Uma vez que os moldes não biodegradáveis podem ser criados novos, usando uma ampla gama de técnicas de fabricação, esse método seria de interesse nos campos de fabricação e regeneração de tecidos, e ajudaria a responder a questões-chave relacionadas ao comportamento das células-tronco e ao nicho das células-tronco. Este método de fabricação de andaimes microfabricados pode fornecer informações sobre a regeneração da córnea. Também pode ser aplicado a outros tecidos epiteliais com nichos de células-tronco, como pele e mucosa oral, ou para fornecer outros recursos 3D e andaimes para engenharia de uma ampla gama de tecidos.

Tanto o líder Ortega quanto Thomas Patterson demonstrarão o procedimento. Comece este procedimento criando L one, a primeira camada. Isso se tornará a base da estrutura usando qualquer programa de desenho adequado para um círculo preto de 1,2 centímetro.

Em seguida, crie L dois. A segunda camada, desenhe outro círculo preto de 1,2 centímetro, mas inclua de seis a oito estruturas brancas em forma de ferradura de 0,5 por 0,35 milímetros. Distribua as pequenas formas de ferradura branca dentro da estrutura do círculo preto.

Salve L um e L dois no formato JPEG para configurar para micro estereolitografia. Primeiro, ajuste e limpe cuidadosamente a ótica do sistema. Coloque 300 microlitros de polietilenoglicol di acrl, ou mistura de PEG D em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.

O poço deve ser pré-revestido com Teflon ou outro material antiaderente ou fácil remoção da estrutura. Após a cura, ligue o laser azul e carregue L um no software básico ALP três. Este software é uma interface USP que fornece o link entre o PC e o dispositivo micro espelho digital.

Irradie a primeira camada por 60 segundos. Adicione ao poço mais 250 microlitros do pino. Carregue L dois e irradie L dois por 60 segundos.

Remova o polímero não curado e lave os anéis com isopropanol durante a noite No dia anterior à eletrofiação, crie um coletor de eletrofiação estático distribuindo os anéis PEG DA em uma chapa de alumínio galvanizada de 12 centímetros por 20 centímetros. Prenda os anéis usando fita de carbono condutora. Prepare a solução de polilactídeo co glico ou PLGA e mexa durante a noite antes de usar no dia seguinte.

Coloque quatro seringas de cinco mililitros com agulhas rombas de 0,8 centímetro de diâmetro interno em uma bomba de seringa. São utilizadas quatro seringas em vez de uma única seringa. Para garantir uma eletrofiação mais rápida, carregue 2,5 mililitros da solução de PLGA em cada seringa.

Para o sucesso deste procedimento, é importante tentar manter as variáveis laro-pininas o mais constantes possível. Deixe uma distância entre as agulhas e o coletor de 15 centímetros. Defina uma vazão de 30 microlitros por minuto e tensões variando de 12 a 15 quilovolts para a eletrofiação eletrogiratória por uma hora e 30 minutos.

Quando a eletrofiação estiver concluída, retire cuidadosamente a folha de esponja elétrica PLGA do coletor que suporta os anéis PEG da. Os anéis PEG DA podem ser reutilizados como modelos para fiação elétrica. Use um furador circular para cortar os andaimes eletro spon em círculos de 22 milímetros de diâmetro.

Deixando a estrutura do anel posicionada no centro para preparar as membranas de PLGA para armazenamento a longo prazo. Monte cada um em um pequeno recipiente, como uma placa de Petri de plástico, e coloque-o dentro de um saco de grau médico. Coloque três sacos de dessecante dentro do saco de grau médico.

Adicione ao saco um cartão indicador de umidade de seis pontos disponível comercialmente. Isso detectará qualquer acúmulo de umidade durante o período de armazenamento. Use uma máquina de selagem a vácuo para aspirar e selar o saco.

Posteriormente, as membranas de PLGA são enviadas para uma empresa externa, a gama ou radiação antes do armazenamento. Neste experimento, berinjelas límbicas de coelho são isoladas de olhos de coelho obtidos de uma fazenda onde os coelhos são criados para consumo. Primeiro desinfete os olhos do coelho usando uma solução anti-séptica a 3%.

Em seguida, limpe os olhos removendo qualquer excesso de tecido ao redor da córnea. A região límbica pode ser identificada como uma fina área circular entre a córnea transparente e a esclera branca. Separe a região límbica do resto da córnea.

Corte a região límbica em segmentos de cerca de 1,5 centímetros de comprimento, desinfete os segmentos límbicos em solução anti-séptica a 1,5% por um minuto. Após a desinfecção, use uma lâmina de bisturi para cortar os segmentos límbicos em pedaços pequenos. Armazene os pequenos pedaços de tecido em DMEM mais meio glut max a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono ou no máximo uma hora antes do uso.

Para iniciar este procedimento, use um raspador de células para revestir as membranas do anel com 15 microlitros de cola de fibrilina. Distribua a fibrilina uniformemente enquanto trabalha sob um microscópio de dissecação. Use uma agulha de calibre 25 para colocar os explantes límbicos diretamente nas microbolsas PLGA.

Coloque os anéis com a explicação do tecido nas córneas desnudas previamente preparadas. Com o explan voltado para cima e em condições de interface ar-líquido, o anel PLGA umedece rapidamente e adota a forma do modelo de córnea. Mantenha os modelos de cultura de órgãos por quatro semanas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, troque o meio a cada dois dias.

A microestereolitografia permite a fabricação de anéis PEG DA de diferentes tamanhos e a incorporação simultânea de micro recursos. Os anéis podem ser feitos e reutilizados de forma reprodutível e são facilmente fixados a uma folha de metal que pode ser usada como coletor de fiação elétrica. Neste exemplo, os anéis contêm micro recursos de ferradura.

A eletrofiação produz réplicas de PLGA, a embalagem a vácuo das membranas de PLGA melhora significativamente seu armazenamento a longo prazo, mesmo a 37 graus Celsius em condições deliberadamente úmidas. O tipo de bolsa utilizada também afeta a estabilidade da membrana, a microscopia eletrônica de varredura e o exame dos três descantes não mostram alterações na integridade da fibra ou na umidade das fibras intactas. Crescimento celular de implantes límbicos ou suportados por anéis e anéis de PLGA biodegradáveis recém-feitos após seis meses de armazenamento a menos 20 graus Celsius.

Ao colocar as membranas de PLGA em modelos de córnea ferida em 3D, a transferência de células foi alcançada após quatro semanas. As imagens H e e mostram o novo epitélio multicamadas formado pelas células que saem dos explantes colocados nos nichos. O controle negativo confirmou a falta de formação de um novo epitélio na ausência de células adicionadas.

Em comparação com um epitélio de córnea convencional observado em uma córnea de coelho fresca usada como controle positivo. A imunocitoquímica demonstrou que as células que cresciam dos implantes eram células epiteliais da córnea, uma vez que eram positivas para citoqueratina três, um marcador de diferenciação da córnea. Como os coletores eletrofiatórios contendo os modelos não biodegradáveis são reutilizáveis, a produção dos scaffolds pode ser feita em duas horas quando o protocolo é otimizado.

Essa técnica permite que pesquisadores nas áreas de engenharia de tecidos explorem uma nova maneira de fabricar membranas complexas de engenharia de tecidos contendo microcaracterísticas para estudar o comportamento celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um modelo microfabricado não degradável usando técnicas de manufatura aditiva ou abordagens semelhantes, como modelagem e como usar a eletrofiação para adicionar complexidade aos seus andaimes.