Name: Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a obter perfis metabólicos de alta resolução de extratos cerebrais de ratos usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Este método permite analisar concentrações de metabólitos para estudos de neuroquímica.

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O apoio do Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 e 7339) é gratamente reconhecido.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Espectroscopia de RMN é um método eficiente para a medição de concentrações de compostos químicos em solução de um modo muito preciso e reprodutível. No entanto, a obtenção de dados de alta qualidade, é necessário obedecer a certas regras respeitantes à preparação e análise de amostras. Na determinação das concentrações do metabolito por espectroscopia de RMN, nem a geração ou a recepção do sinal de RMN domina o erro de quantificação, a menos que a intensidade de um sinal observado se aproxima do limite de detecção (sin...

Modelos murinos têm sido utilizados extensivamente em pesquisas sobre o cérebro 1. Correlações genótipo-fenótipo foram investigados em ratinhos e ratos cérebros por estudar a expressão do gene no RNA e / ou os níveis de proteína em, por um lado, e os fenótipos morfológicos, funcionais, electrofisiológicos e / ou comportamentais no outro 2-6. No entanto, para compreender completamente os mecanismos que ligam fenótipo com o genótipo, é imperativo para investigar os eventos moleculares jusante da expressão da proteína, ie. o metabolismo dos substratos bioquímicos sobre o qual as enzimas actuam 7. Esta exigência levou, ao longo dos últimos 10 a 15 anos, a um renascimento da pesquisa metabólica em muitos ramos da biologia 8,9. Enquanto estudos metabólicos clássicos têm sido muitas vezes focado em detalhes de caminhos específicos, a nova abordagem metabolômica é voltada para uma investigação abrangente do perfil metabólico global do tecido em questão.Uma conseqüência desse conceito é uma necessidade óbvia de ferramentas analíticas que minimizem viés para as vias e / ou classes de compostos metabólicos específicos. No entanto, um ensaio bioquímico clássica baseia-se numa reacção química específica de um analito específico que precisa de ser especificado antes de o ensaio é realizado. Por outro lado, as técnicas espectroscópicas de ressonância magnética (RMN) nuclear e espectrometria de massa (MS) (i) são determinadas com base em propriedades moleculares (físicas) de compostos bioquímicos, cada um dos quais dá origem a um ou vários sinais distintos num espectro detectado no decurso de uma experiência; e (ii) detectar um grande número de compostos diferentes por experiência. Assim, cada espectro contém a informação combinada de toda uma gama de metabolitos. Por esta razão, métodos espectroscópicos são ferramentas adequadas para metabolômica, já que nenhuma seleção prévia precisa ser feita em relação à natureza da substância a medir 8 </sup&gt;. Como consequência, estas técnicas adequam-se naturalmente para estudos exploratórios porque facilitam grandemente a detecção de alterações metabólicas inesperados. Embora espectroscopia de RMN e MS pode ser utilizada indiferentemente para a análise de vários metabolitos, cada método possui vantagens e desvantagens que foram recentemente revisto 10 específicas. Resumidamente, a espectroscopia de RMN pode geralmente ser realizada a partir de extractos em bruto e não necessita de separação cromatográfica de compostos de amostra antes da análise. Por outro lado, MS trabalha com gás ou cromatografia líquida (GC ou LC) separação, exceto para os recentes desenvolvimentos específicos, tais como imagens de espectrometria de massa. Em alguns casos especiais, tais como a análise de açúcares, LC separação pode tornar-se uma necessidade para a espectroscopia de RMN, como bem, porque as linhas de ressonância de diferentes açúcares sobrepõem-se significativamente em protão (1H) Os espectros de RMN. No entanto, uma espectroscopia de RMN sem chrseparação omatographic continua a ser o método de RMN mais popular, quase universalmente aplicada metabolômica. Geralmente, a preparação da amostra é mais demorada e complexa para MS do que para espectroscopia de RMN. Sérios problemas devido a efeitos de matriz são muito menos comuns em espectroscopia de RMN que em MS, onde eles podem levar a sinais consideravelmente atenuados. Metabolito quantificação pode ser conseguida com um ou outro método. No entanto, vários compostos padrão são necessários para a MS, devido às variações nos efeitos de matriz e as eficiências de ionização entre os metabolitos. Pelo contrário, apenas um padrão por exemplo é necessário para uma análise de espectroscopia de RMN, porque sob as condições de medição adequadas, o último método é intrinsecamente graças quantitativos para a resposta RMN estritamente linear pelos núcleos observados. Uma grande desvantagem de RMN é a sua sensibilidade relativamente baixa. MS, em particular, LC-MS, é mais sensível do que a RMN de várias ordens de grandeza; por esta razão, MS é para ser preferido sobre RMN para oanálise de compostos que ocorrem em concentrações muito baixas. Por outro lado, a natureza não destrutiva da experiência de RMN é uma clara vantagem sobre a esclerose múltipla; desta forma, pode ser realizada RMN repetidamente com a mesma amostra, por exemplo, para diferentes núcleos de RMN-activo, tal como um H, fósforo-31 (31 P), carbono-13 (13 C), flúor-19 (19 M) etc., como nenhum material é consumido por RMN em oposição às medições de MS. Tanto a RMN e MS pode ser utilizada em modos diferentes, cada um sendo óptima para a detecção de compostos com características químicas específicas. Por exemplo, 31 P RMN é muitas vezes mais adequados do que 1 H RMN para a análise de compostos fosforilados moderadamente concentrado, embora quase todos os metabólitos fosforilados também contêm protões. No entanto, os sinais de 1 H NMR pode ser obscurecido por sinais de 1 H RMN de outros compostos, não fosforilada, enquanto o segundoobviamente não causam sinais de fundo em 31 P espectros de RMN. Em uma situação análoga, 19 F NMR análise é para ser preferido para os compostos fluorados, por exemplo, drogas fluorados (não há sinais de fundo de metabolitos endógenos), enquanto que o caso especial, de 13 C RMN de interesse é, quase exclusivamente, se o destino do 13C precursores metabólicos marcados exógenos deve ser seguido, devido à extremamente baixa abundância natural dos isótopos de 13 C (cerca de 1%). Muitos espectrómetros de massa de funcionar no modo de iões negativos ou modo de ião positivo. Portanto, é importante saber em frente da análise se os iões a serem observados são negativamente ou positivamente carregada. Nós nos focamos em um protocolo para a análise do tecido cerebral metabolome por 1 H e 31 P espectroscopia de RMN, porque este método produz um grande número de concentrações metabólicas importantes, a baixo custo, em termos de (i) tempo necessário para a preparação de amostras dend (ii) esforço necessário para o metabolito quantificação. Todos os ensaios podem ser realizados utilizando o equipamento de laboratório padrão de química húmida e uma maior facilidade de resolução espectroscopia de RMN. Outros requisitos estão descritos na seção de protocolo a seguir.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Virbac</td><td>Vetflurano</td><td>Anestésico para animais</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Modelo mais recente disponível: Isotec 4</td></tr><tr><td>Bisturi, tesoura, fórceps, grampos</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>vários vários</td><td>Equipamento cirúrgico para animais</td></tr><tr><td>Ferramenta de fixação de congelamento</td><td>construída em casa</td><td>n/a</td><td>Pinça com placas de alumínio, a ser inserida em nitrogênio líquido para resfriamento</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gás nitrogênio</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador de nitrogênio</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Pode ser substituído por um dispositivo caseiro</td></tr><tr><td>Argamassa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>pilão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Com tubos de ensaio encaixando eixo homogeneizador</td></tr><tr><td>Balança eletrônica</td><td>Sartorius</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de vidro</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, tubo de 30 ml</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax tubo de 2 ml; deve substituir o tubo "Eppendorf" se compatível com rotor de centrífuga</td></tr><tr><td>Pipetas de poliestireno</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes Volumes de</td><td>5 e 10 ml</td></tr><tr><td>Deuteroclorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99,96% deuterado</td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99,96% deuterado</td></tr><tr><td>Cloreto de deutério</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% em óxido de deutério</td></tr><tr><td>Deuteróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% em óxido de deutério</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga fria</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de césio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de RMN</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>Inserção coaxial de haste de RMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>By Wilmad</td></tr><tr><td>Pipetas de RMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>Com ponteiras para volumes de 0,5 a 1.000 &mu; l</td></tr><tr><td>Espectrômetro de RMN</td><td></td><td></td> Pipet-Aid Drummond XP <td></td>Bruker AVANCE 400 incluindo sonda e outros acessórios</tr><tr><td>Software de RMN</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>versão mais recente disponível: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Compostos padrão solúveis em água</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> compostos padrão de fosfolipídios <td></td></tr><tr><td></td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>vários vários vários</td><td>Fonte para plasmalogênios, mas pode ser < 70 - 80% de pureza</td></tr><tr><td>metilenodifosfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolômica análise do cérebro de um rato de alta resolução espectroscopia de ressonância magnética nuclear de extratos de tecidos

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Estudos de expressão gênica nos níveis de RNA e proteína têm sido usados há muito tempo para explorar processos biológicos subjacentes a doenças. Mais recentemente, a genômica e a proteômica foram complementadas por uma análise quantitativa abrangente do pool de metabólitos presente nos sistemas biológicos. Essa estratégia, denominada metabolômica, se esforça para fornecer uma caracterização global do complemento de moléculas pequenas envolvido no metabolismo. Enquanto o genoma e o proteoma definem as tarefas que as células podem realizar, o metaboloma faz parte do fenótipo real. Dentre os métodos atualmente utilizados em metabolômica, as técnicas espectroscópicas são de especial interesse, pois permitem analisar simultaneamente um grande número de metabólitos sem seleção prévia para vias bioquímicas específicas, possibilitando assim uma abordagem ampla e imparcial. Aqui, é apresentado um protocolo experimental otimizado para análise metabolômica por espectroscopia de RMN de alta resolução, que é o método de escolha para quantificação eficiente de metabólitos teciduais. Os pontos fortes importantes deste método são i) a utilização de extractos brutos, sem necessidade de purificação da amostra e/ou metabolitos separados; ii) a natureza intrinsecamente quantitativa da RMN, permitindo a quantificação de todos os metabolitos representados por um espectro de RMN com apenas um composto de referência; e (iii) a natureza não destrutiva da RMN, permitindo o uso repetido da mesma amostra para múltiplas medições. A faixa dinâmica das concentrações de metabólitos que podem ser cobertas é considerável devido à resposta linear dos sinais de RMN, embora os metabólitos que ocorrem em concentrações extremamente baixas possam ser difíceis de detectar. Para os compostos menos abundantes, o método de espectrometria de massa altamente sensível pode ser vantajoso, embora essa técnica exija procedimentos mais complexos de preparação e quantificação de amostras do que a espectroscopia de RMN. Apresentamos aqui um protocolo de RMN ajustado para análise de cérebro de ratos; no entanto, o mesmo protocolo pode ser aplicado a outros tecidos com pequenas modificações.

Para obter melhor resolução em espectros de RMN metabólica do cérebro e outros extratos de tecidos, tem sido prática comum para remover ou íons máscara de metal (o mais importante: íons paramagnéticos) presentes em soluções de extractos. Isto foi conseguido através da adição de um agente quelante tal como o EDTA ou o extracto de CDTA 19, ou fazendo passar o extracto através de uma resina de troca iónica, tais como Chelex-100 20. Os resultados apresentados na Figura 1 demonstram que...

A neuroquímica do cérebro de mamíferos é alterada em muitas doenças neurológicas e sistêmicas. Perfis característicos de metabólitos cerebrais podem ser obtidos com eficiência com base em extratos brutos de tecido cerebral. Para isso, é empregada espectroscopia de RMN de alta resolução, permitindo uma análise quantitativa detalhada das concentrações de metabólitos (metabolômica).

Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

O objetivo geral deste procedimento é obter perfis de metabólitos de alta resolução a partir de extratos de cérebro de rato. Isso é feito primeiro colhendo cérebros de ratos e congelando-os em nitrogênio líquido. O segundo passo é extrair metabólitos cerebrais homogeneizando o tecido em água de metanol e clorofórmio, seguido pela remoção de proteínas desnaturadas e solventes orgânicos.Em seguida, as amostras aquosas são liofilizadas e todas as amostras são resolvidas em solventes bem definidos. Para uma análise espectroscópica de RMN ideal, a etapa final é configurar cuidadosamente e otimizar experimentos de RMN metabolômica. Em última análise, os espectros de RMN são necessários em condições experimentais bem definidas e avaliados usando protocolos de processamento de dados otimizados.Embora esse método possa fornecer informações sobre o metabolismo cerebral, ele também pode ser aplicado a outros tecidos moles, como tumores, fígado, rim e outros órgãos. Primeiro, remova uma amostra de tecido cerebral congelado previamente preparada do freezer de 80 graus Celsius negativos. Em seguida, transfira imediatamente a amostra de tecido para uma argamassa parcialmente preenchida com nitrog

metabolomic-analysis-rat-brain-high-resolution-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Um procedimento de colonização progressiva é descrito para melhor avaliar seu impacto sobre o metabolismo hepático host. Colonização é monitorado não invasiva através da avaliação da excreção urinária de microbiana co-metabólitos por RMN baseado em perfil metabólico, enquanto o metabolismo hepático é avaliado pela Alta Resolução Magia Angle Spinning (MAS HR) NMR perfil da biópsia intacta.

Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Fonte: Blanc, J., et al. Espectroscopia de ressonância magnética funcional a 7 t no córtex do barril de rato durante a ativação do bigode. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o método de análise de alterações metabólicas no córtex do barril de rato usando espectroscopia de ressonância magnética funcional durante a estimulação do bigode. Os espectros de metabólitos basais são comparados com os espectros estimulados para detectar o aumento do lactato no córtex do barril, confirmando a...

Espectroscopia de ressonância magnética funcional do córtex do barril de rato durante a estimulação do bigode

A tomografia por emissão de pósitrons de pequenos animais permite a avaliação dos dois principais substratos energéticos do cérebro: glicose e cetonas. No presente método, 11C-acetoacetato e 18F-fluorodesoxiglicose são injetados sequencialmente em cada animal, e sua captação é medida quantitativamente em regiões cerebrais específicas determinadas a partir das imagens de ressonância magnética.

A dupla Tracer PET-MRI Protocolo para a medida quantitativa da Regional cérebro substratos energéticos Captação no Rato

Após a verificação pelo sangue-oxigénio-dependente de nível funcional de ressonância magnética (fMRI bold (realce)) que a área correspondente do córtex campo barril somatossensorial (chamada S1BF) corretamente é ativado, o principal objetivo deste estudo é quantificar o teor de lactato flutuações nos cérebros rato ativado por espectroscopia de ressonância magnética de prótons localizados (1H-MRS) em 7 T.

Funcionais de ressonância magnética espectroscopia em 7 T no córtex de barril de rato durante a ativação dos whiskers

Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.

Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos

Este protocolo descreve um método para obter dados de ressonância magnética funcional de estado de repouso estável (rs-fMRI) de um rato usando isoflurane de baixa dose em combinação com dexmedetomidina de baixa dose.

Aquisição de dados de ressonância magnética funcional de estado de repouso no rato

Este artigo apresenta o uso de PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE no perfil metabólico de plantas e inclui procedimentos detalhados para preparação de amostras e registro ideal de espectros de RMN Pure Shift. Exemplos através dos quais o ganho de resolução alcançado pelo desacoplamento homonuclear permite uma compreensão mais abrangente do sistema são discutidos.

Ressonância magnética nuclear de deslocamento puro: uma nova ferramenta para metabolômica de plantas

A aquisição de dados dinâmicos de tomografia por emissão de pósitrons (PET) e a reconstrução em intervalos de tempo permitem a análise da conectividade metabólica do cérebro no nível de um único sujeito. Descrevemos um método para adquirir dados dinâmicos de PET [18F]FDG do cérebro de ratos e obter uma matriz de conectividade por meio da extração de curvas de tempo-atividade de volumes de interesse.

Estudando a conectividade metabólica do cérebro usando tomografia por emissão de pósitrons dinâmica de 2-desoxi-2-[18F]Fluoro-D-glicose no nível de sujeito único

Aprenda a obter perfis metabólicos de alta resolução de extratos cerebrais de ratos usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Este método permite analisar concentrações de metabólitos para estudos de neuroquímica.

Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal

Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos

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