In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens da remodelação específica dos neurônios sensoriais na elegância do mar. Isso é feito primeiro extraindo feromônio bruto e severo da cultura líquida. O segundo passo é medir a potência do feromônio bruto.

Em seguida, o feromônio é usado para induzir a formação de severidade no animal expressando GFP nos dois neurônios IL. A etapa final é montar o animal na lâmina do microscópio durante o estágio DMT e realizar imagens ao vivo para mostrar a arborização dendrítica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroplasticidade, como a forma como os neurônios se remodelam em resposta às condições ambientais.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a remodelação de IL dois, ele também pode ser aplicado a outros eventos específicos do daer, como remodelação faríngea. Para iniciar este procedimento, cultive o OP 50 e coli de uma única colônia durante a noite a 37 graus Celsius enquanto agita em 100 mililitros de lb de caldo a 200 RPM. Em seguida, cultive a elegância N two C em placas de Petri de 15 a 26 centímetros com ágar NGM assentado com 50 microlitros de e coli até que as bactérias estejam quase esgotadas.

Em seguida, cultive uma cultura de e coli em quatro litros de caldo LB inoculando um mililitro de Coli e agitando a 37 graus Celsius por 16 horas. Depois disso, lave os nematóides das placas com um mililitro de solução de manjericão S. Transferir quatro a cinco placas de nemátodes para um erlenmeyer de um litro de meio S, centrifugar a e coli a 650 gs durante 10 minutos e remover o resus sobrenadante, suspender cada pellet bacteriano em 10 mililitros de solução de S manjericão.

Depois disso, transfira quantidades iguais de bactérias ressuspensas para cada frasco de nematóides. Colocar o balão num agitador orbital à temperatura ambiente entre 100 e 150 RPM durante quatro dias até que a solução comece a clarear, o que indica uma depleção dos alimentos. Quando a comida estiver esgotada, cultive a e coli em quatro culturas de um litro de caldo durante a noite.

Em seguida, centrifugue as bactérias a 650 Gs por 10 minutos. Adicione os pellets bacterianos aos frascos de mídia S com nematóides e devolva todos os frascos de mídia S à câmara orbital por mais três a quatro dias até que o alimento se esgote novamente. Depois, transfira uma alíquota de um mililitro de solução para uma placa de Petri e conte o número de nematóides sob um microscópio de dissecação.

Em seguida, centrifugar os nematóides a 4.000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius, descartar o pellet do nematóide e reter o sobrenadante. Em seguida, filtre o sobrenadante com papel de filtro watman número um. Filtre ainda mais o sobrenadante através de unidades de filtração a vácuo estéreis de ponto 45 micrômetros.

Em seguida, adicione o filtrado a um copo de dois litros com a barra de agitação. Coloque-o em uma placa de agitação de aquecimento em uma capela de exaustão, leve para ferver enquanto agita e evapora até cerca de 200 mililitros. Em seguida, transferir a solução para um copo de 500 ml e continuar a ferver até restarem cerca de 50 ml.

Deixe esfriar e centrifugue por cinco minutos a 1000 Gs.Em seguida, despeje o snat em um copo de 100 mililitros e descarte o pellet. Em seguida, ferva o snat até obter uma crosta marrom. Retire do fogo e quebre a crosta com a espátula Depois.

Adicione etanol 200 prova suficiente para cobrir a crosta. Cubra o copo com paraform e deixe-o descansar durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, despeje o etanol em um béquer limpo e coloque-o de lado.

Adicione etanol fresco para cobrir a crosta e repita as extrações durante a noite três vezes, seguidas de agrupamento dos extratos. Depois disso, use uma bomba de vácuo para secar os extratos de etanol. Se não estiver disponível uma bomba de vácuo, adicionar o extracto etanólico a um copo limpo e aquecê-lo a 50 graus Celsius, mexendo num exaustor.

Em seguida, dissolva o resíduo em 10 mililitros de água destilada estéril. Esterilizar esta solução com uma seringa de 22 micrómetros, filtrar e conservar a 20 graus Celsius negativos num mililitro. Um watts.

Neste procedimento, pesar um tubo de microcentrífuga. Adicionar um mililitro de cultura de equali durante a noite ao tubo e centrifugar a 17 000 Gs.Em seguida, retirar todo o snat. Pesar novamente o tubo e determinar o peso do sedimento bacteriano.

Em seguida, ressuspenda o pellet com tampão M nine para uma concentração final de 4% de peso por volume. Alíquota de 10 microlitros da suspensão bacteriana no centro de cada placa de feromônio e armazene as placas durante a noite. À temperatura ambiente.

Transfira de 10 a 15 gravitos em hermafroditas do tipo selvagem para as placas de feromônio um dia após a idade adulta da muda. Armazene as placas a 25 graus Celsius por três a quatro horas. Em seguida, pegue todos os hermafroditas adultos.

Registre o número de ovos postos para cada prato. Sele as placas com paraforme e retorne a 25 graus Celsius por três dias antes de contar a porcentagem de executores. Agora prepare as placas de feromônio do executor usando o valor EC 90 e induza os executores com uma cepa carregando um transgene repórter IL dois integrado após a postura dos ovos.

Remova os hermafroditas adultos. Sele as placas com perfil e incube por 34 horas a 25 graus Celsius no dia anterior à imagem. Fazer uma solução de 10% em peso por volume de agros em tampão M nove com feromônio na alíquota de concentração EC 90.

Aproximadamente 100 microlitros de agros em uma lâmina de microscópio e, de forma rápida, mas suave, coloque outra lâmina em cima para criar uma superfície plana de agro Depois que o agros solidificar, separe as lâminas. Embrulhe-os em filme plástico e guarde em uma câmara de umidade. Após o período de incubação de 34 horas, examine as placas de feromônio em busca de nematóides que pararam de bombear faríngeo.

Separe os slides de forma que apenas uma superfície do slide tenha aros. Transfira um ou mais nematóides para uma almofada de 10% de agros com um microlitro de esferas de poliestireno de 0,1 mícron e determine a orientação do nematóide. Capture imagens Zack de um dendrito IL dois Q com ampliação de 100 x com a menor intensidade de fluorescência possível a cada 15 minutos ou conforme necessário para o experimento específico.

Esta figura mostra as micrografias da vista lateral direita DIC da elegância C durante diferentes estágios do molde severo. Este é um animal L dois com um bulbo faríngeo terminal arredondado típico. Aproximadamente três horas após a muda para o dote, o bulbo terminal está encolhendo e a cutícula L 2D está começando a se desprender da cutícula do dote recém-formada.

Aproximadamente 10 horas após o início da muda do fazedor, o animal sofreu extenso encolhimento radial e descolamento da cutícula L 2D. Ocasionalmente, o ducto excretor revestido de cutícula do estágio L 2D ainda pode ser visto preso ao dote em desenvolvimento. Aqui é mostrada a micrografia epifluorescente de vista lateral de um único animal expressando o repórter IL dois.

Essas inserções mostram o dendrito IL dois Q em vários pontos de tempo após o início da muda do dote. Uma corredeira dos dois ramos Q de IL ocorre aproximadamente cinco horas após o início da muda do fazedor. Ao tentar purificar o feromônio do fazedor, é importante lembrar de usar a técnica estéril para evitar a contaminação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar e avaliar a potência do feromônio bruto de dote, bem como usar esse feromônio para imagens de remodelação específica de dote in vivo.