Name: Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a preparar culturas de fatia de cérebro e cerebelo de camundongos transgênicos para estudar a proliferação e diferenciação de células da linhagem oligodendrocitária. Este método preserva a arquitetura tecidual.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por doações da National Multiple Sclerosis Society (RG4179 para A.N.), dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH R01NS073425 e R01NS074870 para A.N.) e da National Science Foundation (A.N.). Agradecemos ao Dr. Frank Kirchhoff (Universidade de Saarland, Homburg, Alemanha) por fornecer camundongos transgênicos PLPDsRed. Agradecemos a Youfen Sun por sua ajuda na manutenção da colônia de camundongos transgênicos.

NOTA: Todos os procedimentos com animais está seguindo as diretrizes e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Connecticut. NOTA: Para estas experiências constitutivas NG2cre 18 (JAX # 008533) e induzível NG2creER 16 (JAX # 008538) camundongos transgênicos cruzou para Z / EG 19 (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP repórter 20 (JAX # 006148) linhas, respectivamente, foram utilizados a imagem células NG2 e seus descendentes. Para imagem oligodendrócitos maduros, foram utilizados PLPDsRed camundongos transgênicos 21. Para a sobrevivência consistente, as fatias pode ser isolado a partir de murganhos de até 10 dias pós-natal de ambos o cérebro anterior e do cerebelo. 1 fatia Preparação <ol><li> Em uma capa de cultura, colocar inserções de cultura de tecidos em seis poços e adicionar 1 ml fatia meio de cultura (receita na seção de reagentes). Colocar as placas na incubadora de cultura de células a 37 ° C com 5% de CO 2, pelo menos, 2 horas antes da dissecação. </li><li> Esterilizar todas as ferramentas e cortador de tecidos com 70% de etanol. </li><li> Tampão bolha dissecção (receita na secção reagentes) com 95% de O2, 5% de CO 2 em gelo durante pelo menos 15 minutos antes do início da dissecção. </li><li> Anestesiar filhotes de rato, colocando-se em gelo durante 5-10 minutos de acordo com os protocolos aprovados animais. Determinar a profundidade adequada de anestesia, confirmando que os ratos não respondem a cauda e pés beliscar. </li><li> Decapitar os animais utilizando uma tesoura afiada seguintes protocolos animais. Remover rapidamente o crânio sobre o cérebro anterior e do cerebelo fazendo primeiro um corte sagital seguido de incisão lateral, usando ferramentas esterilizados. Cortar nervos cranianos a partir da superfície ventral do cérebro e cerebelo com cuidado rolando o tecido para o lado. </li><li> Colocar o tecido de uma estéril prato de 35 mM contendo tampão de dissecção oxigenado gelado. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar o cerebelo eo cérebro anterior. Em seguida, faça um corte médio-sagital throurg o cérebro anterior e do cerebelo, separando os hemisférios. </li><li> Corte 300 m de espessura secções coronal e sagital do cérebro anterior e cerebelo com um cortador de tecidos manual. NOTA: Um cortador de tecidos manual permite o processamento rápido de dissecção de incubação da cultura, sem a necessidade de incorporação de agarose. Um vibratome também pode ser utilizado como descrito anteriormente 9. </li><li> Transferir fatias separadas em tampão de dissecção frio recém borbulhar em gelo. </li><li> Use pequena dissecação ou pesando espátulas para separar seções individuais e transferi-los para pré-incubados seis pratos bem com inserções de cultura. </li><li> Remover qualquer excesso de tampão de dissecção a partir da superfície da lâmina de cultura, utilizando uma pipeta de transferência descartável ou uma ponta de pipeta P 200. Dois a três prosencéfalo ou três fatias de cerebelo podem ser colocados em uma inserção de cultura. NOTA: Para obter resultados consistentes com as culturas do cérebro anterior, é ideal para tomar fatias que mede o anterior de um terço do corpo caloso(Figura 1A), a fim de estudar as duas regiões de substância cinzenta e branca na mesma fatia. Cada animal geralmente produz seis fatias do cérebro anterior e seis fatias do cerebelo. </li><li> Coloque as placas de seis poços na incubadora e substituir o meio fatia com 1 ml de meio de fatia 1 dia após a preparação fatia e, em seguida, a cada dois dias até que a fixação fatia. </li><li> Dependendo da experiência, utilizam fatias após 5-7 dias em cultura. Use somente as fatias que se tornam transparentes após os primeiros dias e descartar aqueles que possuem regiões opacas irregulares. NOTA: regiões opacas dentro fatias são visíveis a olho nu e aparecer como um aglomerado de células escuras sob contraste de fase. Após a técnica foi dominada, fatias opacos mortas ocorrem raramente, em menos de 1-5% de fatias. </li></ol> 2 Time-Lapse Imagem de NG2 divisão celular e diferenciação Oligodendrocyte NOTA: Para executar time lapse imagem da proliferação das células NG2 e diferenciação usamos NG2cre: ZEG camundongos 16que expressam GFP em células NG2 e seus descendentes (Figura 1C-E). Expressão Reporter nesta linha é suficientemente robusto para obter imagens ao vivo de GFP + células em fatias imediatamente após o corte por um período de tempo de pelo menos quatro semanas. As imagens são obtidas mais claras após o período inicial de desbaste da fatia, o qual ocorre durante os primeiros 3-5 dias de cultura. <ol><li> Durante toda a experiência, manter as fatias numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e remover apenas por breves períodos de tempo (inferior a 15 min por fatia), mantendo-se a tampa sobre a seis poços enquanto a imagem. </li><li> Usando um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma câmera digital, capturar imagens no primeiro ponto de tempo usando uma objetiva de 10X. NOTA: Os pontos da primeira vez vai variar de acordo com experiência e pode ser o dia em que os cortes foram preparados ou qualquer ponto após o tempo. </li><li> Capturar imagens de várias regiões no ponto de um tempo em ambas as áreas de matéria cinzenta e branca da fatia. ª Notae região fotografada por marcos específicos dentro da fatia e mapeando a localização da imagem em um esquema que pode ser utilizado para sessões de imagem subseqüentes. Marcos úteis podem incluir bordas das fatias e / ou orientação de tratos de substância branca. Imagem 4-8 locais de cada fatia em cada ponto de tempo. </li><li> Capturar imagens subseqüentes com um intervalo de 4-6 horas se examinar a divisão celular NG2 e diferenciação de oligodendrócitos, idealmente mais de 5-7 dias. </li><li> Capturar uma imagem final de todas as regiões e corrigir as fatias imediatamente. Adicionar 1 ml de fixador (4% PFA com 0,1 M L-lisina de meta-periodato de sódio 0,01 M) para a parte inferior da inserção de cultura e, em seguida adicionar mais 1 ml por cima das fatias. Tome cuidado para não esguichar o fixador diretamente na fatia como ela pode desprender da membrana. Fixe o tecido por 30 min e prosseguir com imuno-histoquímica utilizando marcadores específicos do estágio de desenvolvimento como descrito na seção 4. </li><li> Fatias de lavagem com tampão de fosfato de sódio 0,2 M 3 x 10 m. Se necessário, as fatias armazenar a 4 ° C em tampão fosfato de sódio 0,2 M durante 1-3 dias antes da coloração imunológica mas idealmente realização da coloração dentro de 24 horas. Prossiga com imuno-histoquímica, como descrito abaixo na seção 4 para determinar a proporção de células que diferenciam em oligodendrócitos (Figura 2D-F). </li></ol> 3. Destino Mapeamento de NG2 Progênie celular usando Inducible Reporter ratos transgênicos em culturas fatia NOTA: Para rastrear o destino das células NG2 de um momento em particular na cultura, NG2creER indutíveis: ratinhos transgénicos YFP pode ser utilizado. <ol><li> Induzir a recombinação Cre e expressão repórter pela adição de 100 nM 4OHT dissolvido em etanol ao meio de cultura. NOTA: As células positivas repórter deve aparecer dentro de 1-2 dias de indução com uma eficiência de 20-25% de células ~ YFP NG2 + + / NG2 + e neste ponto todo o tempo será células na fase de célula NG2 (Figura 2A-C) </li><li> Fix e lavar a fatias em diferentes pontos de tempo após várias manipulações (descrita nas secções 2.5 e 2.6). </li></ol> 4 Slice Imunohistoquímica <ol><li> Corte as membranas com as fatias ligados fora das inserções, utilizando um bisturi. </li><li> Transferir fatias para poços individuais de uma placa de 24 poços de solução salina contendo fosfato tamponada (PBS), utilizando um conjunto de pinças, tendo o cuidado de não perturbar a composição da fatia aquando do levantamento da membrana. </li><li> Transferir as fatias para uma placa de 24 poços com uma solução contendo 5% de soro de cabra normal (NGS) e 0,1% de Triton-X100 em PBS durante 1 hr a bloquear. </li><li> Incubar as fatias em anticorpo primário S / N em 5% de NGS em PBS a 4 ° C. Para identificação de células na fase de célula NG2, utilizar anticorpos para NG2 e PDGFRα. Para identificar os oligodendrócitos diferenciadas, utilizar um anticorpo para o antigénio da polipose adenomatosa coli (APC; clone CC1). </li><li> No segundo dia de fatias de lavagem em PBS 3 x 15 min, em seguida, incuba-se Antibo secundáriomorre em 5% de NGS em PBS durante 1 h à TA. Lave as fatias em PBS 3 x15 min e montagem em lâminas. Montar com fatias para cima e membrana de frente para o slide para que a membrana não será entre o objetivo eo tecido. </li></ol>

<ol><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).</li>
<li>Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+purkinje+cell+dendritic+morphology+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235(2007).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cell+transplantation+into+organotypic+cerebellar+shiverer+slices%3A+a+model+to+study+myelination+and+myelin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance.</a> PloS one. 7 (7), (2012).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).</li>
<li>Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+remyelination+after+antibody-mediated+demyelination+in+an+ex+model+for+immune+mediated+CNS+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage.</a> Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).</li>
<li>Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2+as+regulatory+and+therapeutic+target+in+newborn+brain+injury+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+fate+and+lineage+restriction+of+single+NG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells.</a> Development. 138 (4), 745-753 (2011).</li>
<li>Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Cells+in+White+Matter+But+Not+Gray+Matter+Proliferate+in+Response+to+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF.</a> Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z%2FEG%2C+a+double+reporter+mouse+line+that+expresses+enhanced+green+fluorescent+protein+upon+Cre-mediated+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision.</a> Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+reef+coral+fluorescent+proteins+in+the+central+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Rivers, L. E., Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRA%2FNG2+glia+generate+myelinating+oligodendrocytes+and+piriform+projection+neurons+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).</li>
<li>Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progeny+of+Olig2-expressing+progenitors+in+the+gray+and+white+matter+of+the+adult+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+the+dynamics+of+CNS+glial-axonal+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo.</a> PloS one. 7 (1), e30775(2012).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+increases+oligodendroglial+cell+proliferation+in+rat+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).</li>
<li>Azim, K., Butt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3%CE%B2+negatively+regulates+oligodendrocyte+differentiation+and+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo.</a> Glia. 59 (4), 540-553 (2011).</li>
<li>Hussain, R., El-Etr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Lubetzki, C., Demerens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+in+culture%2C+oligodendrocytes+myelinate+solely+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).</li>
<li>Demerens, C., Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelination+in+the+central+nervous+system+by+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myelination+by+specific+patterns+of+neural+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Control of myelination by specific patterns of neural impulses.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).</li>
<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros conflitantes

Mielinização no sistema nervoso central é essencial para a comunicação neuronal e sobrevivência eficiente axonal 22. Células NG2 gerar continuamente oligodendrócitos myelinating para a idade adulta, mantendo uma população residente na maioria das regiões do cérebro 16,23 - 25. Alguns mecanismos genéticos e moleculares que regulam a diferenciação destas células foram descritas, mas ainda há muito a ser descoberto. Culturas fatia organotï¿½icas são uma ferramenta conveniente para investigar estes mec...

Culturas fatia Organoytpic do sistema nervoso central têm provado ser extremamente útil para o estudo do neurônio e da biologia de células gliais em um sistema semiintact 1-4. Estas culturas são relativamente simples de adoptar e reter muitos benefícios de culturas dissociadas de células primárias, tal como a manipulação do ambiente extracelular e de fácil acesso para a imagem de células vivas repetida a longo prazo e registos electrofisiolicos 5-9. Além disso, as culturas de fatias manter citoarquitetura tecido 3-dimensional, conectividade neuronal regional, e a maioria dos tipos de células principais estão presentes no sistema. Estas propriedades fazem essas culturas um sistema único e conveniente para investigar o comportamento de uma única célula e fisiologia com interações celulares e ambientais. NG2 células são uma população de células da glia do sistema nervoso central dos mamíferos que continuam a proliferar e gerar myelinating oligodendrócitos durante embrionário e pós-natal de desenvolvimento 10. Eles têm sido extensivamente estudados em culturas de células primárias dissociadas, e o desenvolvimento recente de linhas de ratinhos transgénicos com expressão específica para células NG2 de proteínas fluorescentes em facilitou o mapeamento destino in vivo e registos electrofisiolicos em preparações de fatias agudas. Mesmo com esses estudos, pouco se sabe sobre a dinâmica da proliferação de células NG2 e diferenciação de oligodendrócitos. Embora a cultura de células dissociadas é amplamente utilizado para a relativa facilidade em manipulações farmacológicas e genéticas, que não é adequado para a interrogação diferenças funcionais destas células em diferentes regiões cerebrais particularmente quando é desejável manter o contexto do microambiente celular. Culturas de fatias proporcionar uma alternativa simples, que é passível de manipulações farmacológicas e têm sido utilizados para investigar a mielinização 11,12 oligodendrócitos, célulaular resposta após lisolecitina (LPC) ou anticorpo desmielinização 13,14, e indução de remielinização por meio do tratamento farmacológico 15. Um método para investigar e realizar imagem ao vivo e tecido fixo (ou postfixation) análise da proliferação celular e diferenciação NG2 oligodendrócitos em culturas organotípicas de fatias retiradas quer do cérebro anterior e do cerebelo é descrito. Este é um método poderoso que pode ser utilizado para estudar o destino da célula de células NG2 individuais após divisão 16 e para descobrir diferenças região-e dependente da idade, do factor de crescimento NG2 induzida a proliferação de células 17. Esta técnica relativamente simples é amplamente acessível para investigar celular intrínseca e / ou ambiental mecanismos que regulam a fisiologia destas células gliais e sua resposta à atividade neuronal ou danos mielina.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Slice Culture Medium</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg / L</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0,4mM</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Hyclone</td><td>SH30074,03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">Titule para pH 7,22 com NaOH, filtre com filtro superior de garrafa e armazene a 4 graus Celsius</td></tr><tr><td colspan="4">Dissection Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (anidro)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>ascórbicoSigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">Filtre com filtro superior de frasco e armazene a 4 graus Celsius, oxigenado com 95%O2 5%CO2 antes de usar</td></tr><tr><td colspan="4">Outros Reagentes e Suprimentos</td></tr><tr><td>4-hidroxi tamoxifeno (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr> <tr><td>L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0,1M</td></tr><tr><td>Metaperiodato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0,01M</td></tr><tr><td>Coelho anti NG2 anticorpo</td><td>Chemicon (Millipore)</td> <td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Camundongo anti CC1 anticorpo</td><td>Calbiochem (Millipore)</td> <td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti Ki67 do rato</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Anticorpo do rato anti NeuN</td><td>Chemicon (Millipore)</td> <td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários específicos da espécie</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro normal da cabra (NGS)</td><td></td><td></td> <td>5%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Meio de montagem com DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Millicell inserções de membrana de cultura 0.45&mu; m tamanho do poro</td><td>Fisher Scientific</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Filtros superiores de garrafa</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2 mistura</td><td></td><td></td><td></td>de gás</tr><tr><td>Fosfato tampolado com solução salina (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas estéreis de seis poços</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecar (hipocampo) ou pesar espátulas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picador</td><td></td><td></td><td></td>de tecidos manual ou automático</tr><tr><td>Lâminas de</td><td></td><td></td><td></td>barbear</tr><tr><td>Pipetas de transferência descartáveis Placas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de Petri estéreis de 35mm e 60mm</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fase Invertida Microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td>de Cultura de Tecidos</tr><tr><td>Microcopa</td><td></td><td></td><td></td> de Fluorescência Invertida</tr></tbody></table>

culturas organotípicas fatia para estudar oligodendrocyte dynamics e myelination

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

As células que expressam NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrócitos) são a quarta maior população de células da glia do sistema nervoso central. Durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal eles ativamente proliferar e gerar oligodendrócitos myelinating. Estas células têm sido vulgarmente estudada em culturas dissociadas de neurónios primárias, co-culturas, e em tecido fixado. Utilizando linhas de ratinhos transgénicos fatia recentemente disponíveis sistemas de cultura pode ser utilizado para investigar a proliferação e diferenciação de células da linhagem de oligodendrócitos em ambas as regiões de matéria cinzenta e branca do cérebro anterior e do cerebelo. Culturas de fatias são preparadas a partir de ratos pós-natais precoces e são mantidas em cultura durante 1 mês. Estas fatias podem ser fotografada várias vezes ao longo do período de cultura para investigar o comportamento celular e interações. Este método permite a visualização de divisão celular NG2 e os passos que levam à diferenciação de oligodendrócitos, enquanto permitindo uma análise detalhada da região, dependement células NG2 e oligodendrócitos heterogeneidade funcional. Esta é uma técnica poderosa que pode ser utilizada para investigar os sinais intrínsecas e extrínsecas que influenciam estas células ao longo do tempo em um ambiente celular que se assemelha ao que se encontra in vivo.

Exemplos de dados representativos são dadas abaixo que foram obtidos utilizando culturas fatia de ambos parte frontal do cérebro e cerebelo de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP e PLPDsRed linhas de camundongos transgênicos. Células NG2 pode ser trabalhada ao longo de dias em fatias do cérebro anterior e cerebelo (Figura 1B-D, Vídeo 1) e o fenótipo destas células pode ser determinado após fixação e coloração imunológica com anticorpos NG2 e CC1 (Figura 1E). Além de viver de imagem, a prolife...

Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita. Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a proliferação e diferenciação de células de linhagem de oligodendrócitos em um ambiente que se assemelha muito ao encontrado in vivo. Isso é feito preparando primeiro culturas de fatias de quatro cérebros e cerebelo de camundongos transgênicos pós-natais precoces. As células individuais nas fatias são então visualizadas por períodos de horas a dias para visualizar a dinâmica celular de sua proliferação e diferenciação.Após a imagem, a imuno-histoquímica post hoc das células é usada para determinar várias características celulares. Em última análise, os resultados podem mostrar a dinâmica da proliferação e diferenciação celular em condições normais e após manipulação farmacológica ou genética. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como carvão dissociado, culturas de neurônios e células de linhagem de incitos de liga, é que as culturas de fatias permitem a manipulação do ambiente acelular, mantendo a arquitetura do citogênio do tecido.Todos os procedimentos com animais estão seguindo as diretrizes e foram aprovados pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Connecticut pelo menos duas horas antes da dissecação. Prepare as inserções de cultura de tecidos em seis placas de poços para cada uma. Bem, adicione um mililitro de meio de cultura de fatias e, em seguida, transfira as placas para a incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono pelo menos 15 minutos antes da dissecação.Coloque o tampão de dissecação no gelo e comece a borbulhá-lo com 95% de oxigênio e 5% de gás dióxido de carbono. Certifique-se também de que todas as ferramentas e o picador de tecidos sejam esterilizados com etanol a 70%. Transfira o tecido para um prato estéril de 35 milímetros contendo tampão de dissecção oxigenado gelado.Em seguida, usando uma lâmina de barbear, corte o cerebelo e o prosencéfalo com um corte sagital no prosencéfalo e no cerebelo separando os hemisférios. Agora, usando o helicóptero manual, faça seções coronais e sagitais de 300 mícrons de espessura dos quatro cérebros e cerebelo. Cada animal geralmente produz seis fatias de quatro cérebros e seis fatias de cerebelo.Idealmente, leva fatias abrangendo o terço anterior do corpo caloso para estudar as regiões da substância cinzenta e branca na mesma fatia. Transfira as fatias separadas para um tampão de dissecação a frio recém-borbulhado no gelo no tampão, usando uma pequena espátula de dissecação ou pesagem. Separe as seções individuais e transfira-as para pré-incubadas.Seis pratos de poço contendo inserções de cultura. Duas a três fatias podem ser colocadas em uma cultura. Insira a pipeta de qualquer excesso de tampão de dissecção da superfície da cultura.Insira e transfira as placas para a incubadora até que estejam fixadas. O meio de corte deve ser substituído um dia após o preparo do corte e, em seguida, em dias alternados até a fixação do corte, conforme indicado no protocolo. Dependendo do experimento, use as fatias após cinco a sete dias.Na cultura. Use apenas as fatias que se tornam transparentes após os primeiros dias e descarte aquelas que têm regiões opacas irregulares visíveis a olho nu. Sob contraste facial, essas regiões opacas aparecem como um aglomerado de células escuras.Se executado corretamente, regiões opacas mortas ocorrem em não mais do que um a 5% das fatias. Para realizar imagens de lapso de tempo da proliferação e diferenciação de células NG dois, use fatias de três a cinco dias de camundongos que expressam EGFP em células NG dois. Não deixe os slides ficarem abaixo de 37 graus Celsius por mais de 15 minutos.Por sessão de imagem, mantendo a placa fechada, use a objetiva de 10 x de um microscópio de fluorescência invertida para capturar imagens na primeira vez. Ponto da cultura. Crie imagens de quatro a oito locais em cada fatia das áreas de substância cinzenta e branca da fatia.Além disso, crie imagens de pontos de referência úteis, como as bordas das fatias, células específicas ou orientação de tratos de substância branca para fins de realocação. A imagem do ponto de tempo anterior pode ser usada como uma imagem de referência durante a realocação para NG duas divisões celulares e diferenciação de oligodendrócitos. Capture imagens a cada quatro a seis horas por idealmente de cinco a sete dias.Se o marcador induzível NG dois cre, ER YFP for usado, induza a expressão do repórter usando meio de cultura com 100 nano molar. Quatro hidroxitamoxifeno dissolvidos na atividade repórter de etanol devem aparecer dentro de um a dois dias. Para fixação, adicione um mililitro de fixador na parte inferior da cultura.Insira e adicione outro mililitro por cima das fatias. Não esguiche o fixador diretamente nas fatias ou elas podem se soltar. Fixe o tecido por 30 minutos a quatro graus Celsius e depois usando um bisturi.Corte as membranas com as fatias presas. Usando uma pinça, transfira cuidadosamente as fatias para poços individuais de uma placa de 24 poços carregada com PBS. Em seguida, transfira as fatias para uma segunda placa de 24 poços carregada com solução de bloqueio contendo 5% de soro de cabra normal e 0,1% de tritton X 100 em PBS.Deixe-os incubar na solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Uma vez bloqueados, mova as fatias para uma placa carregada com anticorpo primário em PBS com 5% NGS. Deixe-os incubar durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.Lave as fatias em PBS. Em seguida, incube as fatias com anticorpos secundários em PBS com 5% de NGS. Deixe a incubação agir por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, faça mais três lavagens em PBS como antes e monte as fatias com a membrana voltada para a lâmina de forma que não fique entre a objetiva e o tecido. Para analisar a dinâmica temporal da diferenciação de oligodendrócitos, imagens da divisão celular NG dois foram obtidas de culturas de fatias do prosencéfalo de camundongos transgênicos P oito NG dois creeg durante vários dias, sequências de lapso de tempo foram tiradas ao longo de 122 horas. O fenótipo das células divididas foi determinado com anticorpos NG dois e CC um.A proliferação celular também foi avaliada por meio de coloração imuno-histoquímica para o marcador de proliferação celular. O mapeamento de isca KI 67 de duas células NG foi realizado após a indução da recombinação de CRE em fatias de camundongos NG dois CRE YFP. Dois dias após a adição de quatro hidroxitamoxifeno.Repórter YFP expressando NG duas células positivas foram encontradas nas culturas. Quatro dias depois, uma proporção dessas células se diferenciou em citos de oligodendrócitos positivos para CC um. Oligodendrócitos maduros foram visualizados em culturas de fatias de cerebelo de P-L-P-D-S.Neurônios Perkin mielinizados de camundongos vermelhos estavam presentes nessas culturas. Imagens repetidas mostraram que a adição de microquímica de oligodendrócitos com expressão de vermelho DS mielinizante nessas fatias mostrou expressão substancial da proteína básica da mielina. Finalmente, imagens de maior resolução temporal revelaram corpos celulares de oligodendrócitos estáveis com alguns movimentos menores nos processos distais.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar culturas de fatias dos quatro cérebros e do cerebelo repetidamente ao longo de dias a horas e analisar o destino das células de imagem usando imuno-histoquímica pós-ho. Além da imagem, essas fatias também permitem a manipulação do ambiente celular ao usar técnicas de mapeamento de destino, como recombinação de creme induzível em uma fatia preparada.

organotypic-slice-cultures-to-study-oligodendrocyte-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Este vídeo demonstra uma técnica ex vivo para induzir a morte de células cerebrais mediada por células T CD8+ citotóxicas. Após a obtenção de fatias de cérebro, as células T CD8+ direcionadas a oligodendrócitos ativados são transferidas para as fatias para atingir a bainha de mielina e os oligodendrócitos. Após a incubação, o dano à mielina e a morte neuronal podem ser avaliados histologicamente nas regiões de interesse.

Uma técnica ex vivo para induzir a morte neuronal por meio de células T CD8+ específicas de oligodendrócitos

Fonte: Kennedy, L. H., et. al. Visualização e imagem ao vivo de organelas de oligodendrócitos em fatias cerebrais organotípicas usando vírus adeno-associado e microscopia confocal. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a imagem de mitocôndrias de oligodendrócitos em fatias de cérebro de camundongos organotípicos. A fatia é colocada dentro de uma câmara de banho com circulação contínua de fluido e temperatura controlada. Depois de configurar vários parâmetros do microscópio confocal, imagens...

Imagem confocal do movimento mitocondrial dentro de oligodendrócitos em culturas organotípicas de fatias cerebrais

Para abordar mecanismos de desmielinização e apoptose neuronal em lesões corticais de distúrbios inflamatórios desmielinizantes, diferentes modelos animais são usados. Descrevemos aqui uma abordagem ex vivo usando células T CD8+ específicas de oligodendrócitos em fatias cerebrais, resultando em morte oligodendroglial e neuronal. Aplicações potenciais e limitações do modelo são discutidas.

Um Ex vivo Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Culturas de fatias hippocampal organotypic (OHSC) representam um modelo in vitro que simula a situação na vivo muito bem. Aqui descrevemos uma vibratome de base melhorada fatiar protocolo para obter fatias de alta qualidade para uso em avaliar o potencial neuroprotetor do romance substâncias ou o comportamento biológico das células tumorais.

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

Microambiental oligodendrócitos promovem a propagação do potencial de ação rápida e sobrevivência neuronal. Aqui descrito é um protocolo para oligodendrocyte específicas de expressão de proteínas fluorescentes em organotypic fatias de cérebro com imagens subsequentes de lapso de tempo. Além disso, apresenta-se um procedimento simples para a visualização de mielina imaculada.

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.

Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

Aprenda a preparar culturas de fatia de cérebro e cerebelo de camundongos transgênicos para estudar a proliferação e diferenciação de células da linhagem oligodendrocitária. Este método preserva a arquitetura tecidual.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Explorar mais vídeos