Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

O objetivo geral deste procedimento é investigar a proliferação e diferenciação de células de linhagem de oligodendrócitos em um ambiente que se assemelha muito ao encontrado in vivo. Isso é feito preparando primeiro culturas de fatias de quatro cérebros e cerebelo de camundongos transgênicos pós-natais precoces. As células individuais nas fatias são então visualizadas por períodos de horas a dias para visualizar a dinâmica celular de sua proliferação e diferenciação.

Após a imagem, a imuno-histoquímica post hoc das células é usada para determinar várias características celulares. Em última análise, os resultados podem mostrar a dinâmica da proliferação e diferenciação celular em condições normais e após manipulação farmacológica ou genética. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como carvão dissociado, culturas de neurônios e células de linhagem de incitos de liga, é que as culturas de fatias permitem a manipulação do ambiente acelular, mantendo a arquitetura do citogênio do tecido.

Todos os procedimentos com animais estão seguindo as diretrizes e foram aprovados pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Connecticut pelo menos duas horas antes da dissecação. Prepare as inserções de cultura de tecidos em seis placas de poços para cada uma. Bem, adicione um mililitro de meio de cultura de fatias e, em seguida, transfira as placas para a incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono pelo menos 15 minutos antes da dissecação.

Coloque o tampão de dissecação no gelo e comece a borbulhá-lo com 95% de oxigênio e 5% de gás dióxido de carbono. Certifique-se também de que todas as ferramentas e o picador de tecidos sejam esterilizados com etanol a 70%. Transfira o tecido para um prato estéril de 35 milímetros contendo tampão de dissecção oxigenado gelado.

Em seguida, usando uma lâmina de barbear, corte o cerebelo e o prosencéfalo com um corte sagital no prosencéfalo e no cerebelo separando os hemisférios. Agora, usando o helicóptero manual, faça seções coronais e sagitais de 300 mícrons de espessura dos quatro cérebros e cerebelo. Cada animal geralmente produz seis fatias de quatro cérebros e seis fatias de cerebelo.

Idealmente, leva fatias abrangendo o terço anterior do corpo caloso para estudar as regiões da substância cinzenta e branca na mesma fatia. Transfira as fatias separadas para um tampão de dissecação a frio recém-borbulhado no gelo no tampão, usando uma pequena espátula de dissecação ou pesagem. Separe as seções individuais e transfira-as para pré-incubadas.

Seis pratos de poço contendo inserções de cultura. Duas a três fatias podem ser colocadas em uma cultura. Insira a pipeta de qualquer excesso de tampão de dissecção da superfície da cultura.

Insira e transfira as placas para a incubadora até que estejam fixadas. O meio de corte deve ser substituído um dia após o preparo do corte e, em seguida, em dias alternados até a fixação do corte, conforme indicado no protocolo. Dependendo do experimento, use as fatias após cinco a sete dias.

Na cultura. Use apenas as fatias que se tornam transparentes após os primeiros dias e descarte aquelas que têm regiões opacas irregulares visíveis a olho nu. Sob contraste facial, essas regiões opacas aparecem como um aglomerado de células escuras.

Se executado corretamente, regiões opacas mortas ocorrem em não mais do que um a 5% das fatias. Para realizar imagens de lapso de tempo da proliferação e diferenciação de células NG dois, use fatias de três a cinco dias de camundongos que expressam EGFP em células NG dois. Não deixe os slides ficarem abaixo de 37 graus Celsius por mais de 15 minutos.

Por sessão de imagem, mantendo a placa fechada, use a objetiva de 10 x de um microscópio de fluorescência invertida para capturar imagens na primeira vez. Ponto da cultura. Crie imagens de quatro a oito locais em cada fatia das áreas de substância cinzenta e branca da fatia.

Além disso, crie imagens de pontos de referência úteis, como as bordas das fatias, células específicas ou orientação de tratos de substância branca para fins de realocação. A imagem do ponto de tempo anterior pode ser usada como uma imagem de referência durante a realocação para NG duas divisões celulares e diferenciação de oligodendrócitos. Capture imagens a cada quatro a seis horas por idealmente de cinco a sete dias.

Se o marcador induzível NG dois cre, ER YFP for usado, induza a expressão do repórter usando meio de cultura com 100 nano molar. Quatro hidroxitamoxifeno dissolvidos na atividade repórter de etanol devem aparecer dentro de um a dois dias. Para fixação, adicione um mililitro de fixador na parte inferior da cultura.

Insira e adicione outro mililitro por cima das fatias. Não esguiche o fixador diretamente nas fatias ou elas podem se soltar. Fixe o tecido por 30 minutos a quatro graus Celsius e depois usando um bisturi.

Corte as membranas com as fatias presas. Usando uma pinça, transfira cuidadosamente as fatias para poços individuais de uma placa de 24 poços carregada com PBS. Em seguida, transfira as fatias para uma segunda placa de 24 poços carregada com solução de bloqueio contendo 5% de soro de cabra normal e 0,1% de tritton X 100 em PBS.

Deixe-os incubar na solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Uma vez bloqueados, mova as fatias para uma placa carregada com anticorpo primário em PBS com 5% NGS. Deixe-os incubar durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Lave as fatias em PBS. Em seguida, incube as fatias com anticorpos secundários em PBS com 5% de NGS. Deixe a incubação agir por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, faça mais três lavagens em PBS como antes e monte as fatias com a membrana voltada para a lâmina de forma que não fique entre a objetiva e o tecido. Para analisar a dinâmica temporal da diferenciação de oligodendrócitos, imagens da divisão celular NG dois foram obtidas de culturas de fatias do prosencéfalo de camundongos transgênicos P oito NG dois creeg durante vários dias, sequências de lapso de tempo foram tiradas ao longo de 122 horas. O fenótipo das células divididas foi determinado com anticorpos NG dois e CC um.

A proliferação celular também foi avaliada por meio de coloração imuno-histoquímica para o marcador de proliferação celular. O mapeamento de isca KI 67 de duas células NG foi realizado após a indução da recombinação de CRE em fatias de camundongos NG dois CRE YFP. Dois dias após a adição de quatro hidroxitamoxifeno.

Repórter YFP expressando NG duas células positivas foram encontradas nas culturas. Quatro dias depois, uma proporção dessas células se diferenciou em citos de oligodendrócitos positivos para CC um. Oligodendrócitos maduros foram visualizados em culturas de fatias de cerebelo de P-L-P-D-S.

Neurônios Perkin mielinizados de camundongos vermelhos estavam presentes nessas culturas. Imagens repetidas mostraram que a adição de microquímica de oligodendrócitos com expressão de vermelho DS mielinizante nessas fatias mostrou expressão substancial da proteína básica da mielina. Finalmente, imagens de maior resolução temporal revelaram corpos celulares de oligodendrócitos estáveis com alguns movimentos menores nos processos distais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar culturas de fatias dos quatro cérebros e do cerebelo repetidamente ao longo de dias a horas e analisar o destino das células de imagem usando imuno-histoquímica pós-ho. Além da imagem, essas fatias também permitem a manipulação do ambiente celular ao usar técnicas de mapeamento de destino, como recombinação de creme induzível em uma fatia preparada.