Name: Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprenda a isolar glicanos O-ligados de glicoproteínas usando eliminação beta redutiva em gel e permetilação, seguidos de espectrometria de massa. Este método avançado permite a análise completa de estruturas glicânicas neutras e carregadas.

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Este trabalho foi apoiado pelo P01HL107151 de bolsas do NHLBI/NIH. Os autores também agradecem o apoio e o acesso à instrumentação fornecidos por meio de P41GM103490 de subsídios do NIGMS / NIH.

NOTA: Preocupações de segurança de laboratório Em consonância com as melhores práticas de laboratório padrão, observe o seguinte. Guarde todos os solventes orgânicos em locais apropriados. Mantenha todos os materiais de resíduos em contentores de resíduos químicos com uma rotulagem clara de composições químicas. Como vários reagentes utilizados nestes protocolos são potenciais agentes cancerígenos ou gerar gases combustíveis voláteis, lidar com todos os reagentes em um exaustor com ventilação. Use equipamento de proteção individual, como luvas, jaleco e proteção para os olhos quando se trabalha com solventes orgânicos. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px"> Figura 1. Processo para O-glycomics em gel. (A) As proteínas de interesse são resolvidos por SDS-PAGE, detectada por procedimentos de coloração apropriados (Coomassie ou prata), e excisadas. Pedaços de gel são excisadas fatiasem pequenos cubos, descorados, e lavou-se com acetato de etilo, para reduzir os contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS. Uma porção da porção de gel pode ser reservada para em gel de digestão tríptica e subsequente caracterização proteómica por LC-MS / MS. (B) glicanos ligados a O são libertados a partir de glicoproteínas resolvidos por eliminação redutiva β-em-gel. Passos essenciais incluem dessalinização e remoção de borato de azeótropo com metanol. (C) glicanos libertados pela eliminação redutiva β-O-ligada são permetilado e posteriormente repartiu-se em fases aquosa e orgânica. Sulfoglycans são quantitativamente recuperado na fase superior (aquosa) enquanto partição glicanos neutros e sialilados no (DCM) camada inferior. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px"> Figura 2. Detalhe fluxograma para glycomics em-gel. Cada experimenTal passo mostrado na Figura 1 é ilustrado individualmente. (A) descoloração gel e extração AcOEt, (B) dirigir redutora β-eliminação em gel para liberação glycan O-ligados, e (C) permetilação e fase de partição. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.</a> 1. Gel excisão e remoção de contaminantes Gel derivadas <ol><li> Antes de iniciar o procedimento, preparar produtos químicos e reagentes listados na Lista de Materiais. </li><li> Resolver proteína em gel de SDS-PAGE utilizando sistemas de tampão de Tris-Glicina padrão. Stain proteínas com ou Coomassie Brilliant Blue ou prata Stain resolvido. Em geral, a recuperação de glicanos ligados em O a partir de géis corados com prata é aproximadamente 80-90% da recuperação conseguida a partir de géis corados com Coomassie. </li><li> Após a electroforese, colocar o gel sobre uma placa de vidro e t especial de consumoEle região de interesse utilizando um bisturi limpo ou lâmina de barbear. </li><li> Para aumentar o rendimento de O-glicanos, transferir a banda gel de interesse para outra placa de vidro e cortar o pedaço gel extirpado em aproximadamente dois milímetros cubos. Evitar fazer pedaços de gel menor do que 1 milímetro porque os cubos de recuperação de glicano é reduzida. Transferir os pequenos pedaços do gel para um tubo de vidro de tampa de rosca (13 x 100 mm) com um microspatula aço inoxidável. </li><li> Adicione 1 ml de 25 mM de bicarbonato de amônio (Ambic, NH 4 HCO 3) para o tubo de amostra, tampar o tubo de vidro com um parafuso de topo revestido de teflon, e misture delicadamente sacudindo o tubo antes de deixar repousar por 10 min. Não se empregar agitação vigorosa, a fim de evitar rasgar os pedaços de gel. </li><li> Remova cuidadosamente Ambic do tubo de vidro usando uma pipeta de vidro Pasteur ou pipeta equipado com uma ponta de plástico extra-longa. Evite esmagamento e transferindo os pequenos pedaços de gel durante a remoção da solução Ambic. </li><li> Adicionar 1 ml de acetonitrilo (ACN) para otubo de vidro, tampa, e misture delicadamente sacudindo tubo antes de deixar descansar por 10 min. Certifique-se de que as peças de gel são completamente coberto com solvente. Se necessário, empurre pedaços de gel fora da parede do tubo e em solvente com ponteira. </li><li> Pipeta off ACN do tubo de vidro e repita os passos 1,5-1,7 até que a cor azul brilhante é eliminado. Repetir um mínimo de cinco lavagens seqüenciais Ambic / ACN, se necessário. Para prata manchada géis, use um kit destain. Vá para a próxima etapa, quando a peça se transforma em gel enquanto uniformemente branca em ACN. </li><li> Pipetar qualquer líquido do tubo de vidro, recapitular o tubo, adicionar 1 ml de Ambic e deixe descansar por 5 min. </li><li> Remover Ambic e adicionar 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) para o tubo de vidro. Recapitulando tubo com tampa forrada de Teflon e colocar a 4 ° C durante a noite com agitação ao longo de ponta a ponta ou, alternativamente, executar três lavagens de EtOAc à temperatura ambiente durante 30 min cada. Quanto maior for a lavagem de EtOAc, o mais eficiente a remoção de contaminantes. </li><li> RemoverEtOAc a última lavagem e executar três lavagens cada uma com 2 ml de H 2 O. A remoção completa de EtOAc irá assegurar uma reacção de eliminação redutiva β-robusta. </li><li> Pipetar fora H2O e desidratar o gel por lavagem uma vez com 1 mL de ACN. NOTA: Após a secagem, os géis são desidratados pronto para β-eliminação em gel. Pedaços de gel desidratados podem ser armazenados a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Parar o processo de lavagem em qualquer passo e armazenar os pedaços de gel a 4 ° C durante a noite, independentemente de qual tampão ou solução é aplicada ao gel (Ambic, ACN, H 2 O). Reinicie a preparação da amostra a qualquer momento dentro dos próximos dois dias. </li><li> Usar uma porção dos pedaços de gel descorado e desidratados para identificação de proteínas por abordagens proteomic padrão. </li></ol> 2. Em gel de-O-glicano A libertação por redutiva β-Eliminação <ol><li> Prepara-se uma solução stock de 1 M de hidróxido de sódio (NaOH), utilizando NaOH a 50% ou NaOH sólido e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. <ol> Tirar 5,2 ml de NaOH a 50% (ou 4 g de NaOH sólido) e ajustar o volume para 100 ml para fazer uma solução M de NaOH. Dilui-se a solução stock de NaOH a 1 M NaOH a 100 mM, que podem ser armazenadas a 4 ° C, até 6 meses, sem perda de eficiência em reacções β-eliminação redutiva. </ol></li></ol><li> Adicione 2 M de boro-hidreto de sódio (NaBH4) em NaOH 100 mM. Dissolve-se 38 mg de NaBH4 em 0,5 ml de NaOH 100 mM. Geralmente, usam 0,5-1,0 ml da solução de boro-hidreto para cada amostra. Variar o volume da solução de reacção sobre a quantidade de pedaços de gel seco preparado no passo 1. Esperar para utilizar 0,5 ml de solução de boro-hidreto por 1-2 pedaços excisados ​​do gel (passo 1.3). </li><li> Adicionar 500 mL de NaOH 100 mM para os pedaços de gel desidratados e deixar repousar durante 3-5 min em gelo, a fim de equilibrar o gel às condições básicas que melhoram a recuperação de glicano. </li><li> Adicionar 500 ul de 2 M NaBH4 em NaOH 100 mM, resultando em concentrações finais de 1 M NaBH <li> Durante a primeira hora de incubação, misturam suavemente o tubo a cada 15 min. Evitar agitação forte, uma vez que pode fragmentar os pedaços de gel. Realizar a reacção num incubador / forno bem equilibrada ou num bloco de aquecimento. Assegure-se que os pedaços de gel são cobertos com uma solução de reacção. </li></li><li> Parar a reacção por remoção do tubo de amostra a partir da incubadora ou do bloco de aquecimento e colocando-a em gelo. NOTA: Depois de se deixar a reacção β-eliminação prosseguir durante 18 h, o processo de dessalinização deve ser realizada no mesmo dia. </li> 3. Cromatografia em Dessalinização permutadora de catiões <ol><li> Enquanto se mantém o tubo de amostra em gelo para evitar a formação de calor excessivo, adiciona-se lentamente 10% de ácido acético (AcOH) gota a gota a neutralizar a base. Gentilmente vortex o tubo de amostra entre as adições de AcOH. Tenha o cuidado de adicionar ácido lentamente e gota a gota, como o additino de ácido irá produzir um "vulcão" das bolhas. Centrifuga-se o tubo para eliminar as bolhas e evitar transbordamento, se necessário. <ol><li> A fim de remover a grande quantidade de sódio na mistura de reacção, passar a mistura de reacção através de uma coluna de permuta catiónica pequena (ou resina Dowex AG-50W-X8, na forma H +). </li><li> Lava-se a resina de permuta catiónica com NaOH e 1 M de HCl 1 M, antes da utilização, a fim de remover os contaminantes que interferem com a análise por MS, mesmo se a resina é de grau analítico. </li><li> Soak a resina em NaOH 1 M e remover a solução por decantação. Adicionar água deionizada, remover a água, em seguida, adicione 1 M HCl. </li></ol></li><li> Repita essas etapas até que a solução acima da resina é incolor. Lava-se a resina limpas com água deionizada e armazenar em 5% de AcOH a 4 ° C. </li><li> Para fazer com que uma pequena coluna de vidro, zero e quebrar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro usando um cortador de cerâmica, de modo que a inclinação da ponta da pipeta é cerca de 1 cm de comprimento. Provocar uma separação de um tampão de lã de vidro e empurrar no sentido da ponta formando um suporte para o leito de resina. Fixe a coluna pipeta com uma pinça ou prendedor de roupa e coloque sobre um tubo de ensaio de vidro. </li><li> Lava-se a pipeta de vazio com 1 ml de metanol (MeOH) e 3 ml de 5% de AcOH. Redemoinho H + Dowex ou pasta de resina de permuta catiónica AG50 armazenado em 5% de AcOH e transferir suficiente da lama para produzir um volume de leito de 1 ml na coluna pipeta de Pasteur. </li><li> Lavar a coluna com cinco volumes de 5% de AcOH. Verifique fluir através do aparecimento de partículas de resina e não use a coluna de resina se for detectado. </li><li> Coloque coluna sobre um novo tubo de tampa de rosca de vidro (16 x 125 mm) e amostra de carga. Recolhe-se o fluxo através de glicanos e eluir com, pelo menos, 3 volumes de 5% de AcOH no mesmo tubo. </li><li> Cobrir o tubo com Parafilm e fazer pequenos furos com uma agulha. Colocar o tubo de amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Uma vez congelado, secar a amostra por liofilização. Armazenar o material seco a -20 °C até à sua utilização. </li></ol> 4. Remoção Borato <ol><li> Prepare a 10% de AcOH em MeOH. Tomar 10 ml de ácido acético glacial e ajustar o volume a 100 ml com metanol. Guarde este reagente em um frasco de vidro com tampa forrada de Teflon para até 6 meses. </li><li> Adicionar 300 ul de AcOH a 10% em MeOH à, liofilizada tubo de amostra seca e vortex. Remover o borato de trimetilo resultante por evaporação sob uma corrente de N 2. NOTA: Mistura de sais borato com metanol sob condições ácidas produz borato de trimetilo, que é um composto volátil. </li><li> Seca-se sob fluxo de N2, a 37 ° C. Após a secagem, adiciona outra aliquota de AcOH em MeOH como se descreveu na etapa 4.2. Seca-se o líquido durante 5 min sob atmosfera de azoto (N 2) fluxo a 37 ° C. <ol><li> Repetir a ressuspensão e secagem, pelo menos, 3 vezes. Armazenar o material seco a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 5. C18 Clean-up <ol><li> Equilibrar a coluna de cartucho C18(Tamanho 1 ml, 100 mg de resina), utilizando três volumes de ACN e cinco volumes de 5% AcOH. Acelerar a passagem das soluções equilibrantes através da aplicação de pressão positiva de ar suave. </li><li> Adicionar 500 ul de 5% de AcOH para o tubo de amostra dessalinizada e livre de borato dissolver e por vórtice. </li><li> Carga da amostra ressuspensa numa coluna C18, equilibrada e recolher o fluxo através de um tubo em vidro com tampa de rosca (13 x 100 mm). Eluir O-glicanos com 3 ml de 5% de AcOH para o mesmo tubo. </li><li> Parafilme o tubo, fazer pequenos buracos com uma agulha pequena ou use a tampa forrada de PTFE frouxamente fechada para cobrir o tubo, e congelar a amostra a -80 ° C ou em gelo seco. Remover o solvente por liofilização. Armazenar a amostra seca a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 6. Preparação Base para permetilação NOTA: A fim de alcançar permetilação robusto, preparar NaOH pasta fresca. Toda a vidraria utilizado para reacções de permetilação deve ser extensivamente limpo. <ol><li> Para preparar o reagente de base para permetilação, adicionar 400 ul de NaOH a 50% para um tubo de tampa de rosca de vidro limpas (13 x 100 mm). Adicionar 800 mL de MeOH anidro e vortex. </li><li> Adicionar 4 ml de dimetil sulfóxido anidro (DMSO) e vortex para gerar um precipitado branco. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 1 min para sedimentar o precipitado. Pipeta off sobrenadante e descartar. Adicionar um adicional de 4 mL de DMSO anidro para o sedimento. Vortex. </li><li> Repita o passo 6.2 e 6.3, no mínimo, mais três vezes, ou até que forme um precipitado branco. </li><li> Dissolva a base peletizada em 3 ml de DMSO anidro e misture delicadamente por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur limpa. </li><li> Utilize a base imediatamente para a reacção seguinte como a permetilação não pode ser armazenado. </li></ol> 7. permetilação de glicanos libertados <ol><li> Adicionar 200 ul de DMSO anidro para a amostra C18-purificado e vortex ou sonicado para ressuspender. </li><li> Adicionar 300 ul da resusppasta base de ended para a amostra e imediatamente adicionar 100 ml de iodometano (MEI). Selar tubo com tampa forrada de Teflon e vigorosamente para misturar 5 min por vórtice. </li><li> Para parar a reacção permetilação, adicionar 2 ml de 5% de AcOH em gelo e vortex. Pipeta solução cima e para baixo cinco vezes para reduzir o volume restante de MeI por evaporação. NOTA: O AcOH neutraliza a solução de MeI e remoção aumenta a eficiência da extracção de glicanos sulfatados para a fase aquosa durante a-partição de fase. </li><li> Adicionar 2 ml de diclorometano (DCM) e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min à temperatura ambiente para separar as fases aquosa e orgânica. </li><li> Transferir a camada superior (fase aquosa que contém a maioria dos glicanos sulfatados permetilado) para um novo tubo de vidro (13 x 100 mm). </li><li> Adicionar 2 ml de H 2 O para a fase orgânica e vortex. Centrifugar a 600 xg durante 1 min para separar as fases aquosa e orgânica e combinar esta segunda fase aquosa com o abetofase aquosa st (passo 7.5). </li><li> Repetir o passo 7.6 e 7.5 mais três vezes, mas não há necessidade de guardar as fases aquosas resultantes das partições subsequentes. </li><li> Retirar a camada final de topo (fase aquosa), tanto quanto possível a partir da camada inferior (fase orgânica) e transferir a camada inferior (fase orgânica) para um tubo de vidro de novo separada usando uma pipeta de Pasteur limpa. </li><li> Seca-se a fase orgânica sob fluxo de N2 a 42 ° C. </li><li> Cobrir o tubo com parafilme e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 8. C18 Clean-up de permetilado Sulfatado O-glicanos da fase aquosa <ol><li> Equilibrar a coluna de cartucho C18 com três volumes de ACN e cinco volumes de 5% de AcOH. </li><li> Carregar as fases aquosas recolhidas e combinadas a partir dos passos 7.5 e 7.6 na coluna. </li><li> Lava-se a coluna com 10 ml de H 2 O para dessalinização. </li><li> Eluir a permetilado sulfatado O-glicanos para um novo tubo de vidro com 2 mlde 50% de ACN. Use uma eluição adicional com 85% de ACN para melhorar a recuperação de permetilado sulfatados O-glicanos em oligossacarídeos maiores. </li><li> Eluatos secos sob corrente de azoto a 42 ° C. </li><li> Armazenar o material seco a -20 ° C até 6 meses antes da análise por MS. </li></ol> 9. Espectrometria de Massa de permetilado O-glicanos <ol><li> Analise permetilado O-glicanos por infusão directa para um espectrómetro de massa adequado usando uma fonte de nanoelectrospray a um caudal de 0,40-0,60 seringa ul / min a 210 ° C de temperatura de capilar. Para fragmentação por CID em MS / MS e MS n de um instrumento ion trap, aplicar 30-40% da energia de colisão. </li><li> Para o modo de ião negativo, reconstituir permetilado sulfatado O-glicanos em 50 mL de metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM de acetato de amónio aquoso (16: 3: 3: 2 em volume). Para o modo de ião positivo, reconstituir permetilado neutros / O-glicanos sialilados em 50 ul de 1 mM de sódio hidrohidróxido O em metanol / água (1: 1). </li><li> Use o mapeamento de íons (TIM) e varredura de perda neutra (varredura NL) funcionalidade do pacote de software Xcalibur versão 2.0 para análise MSN para caracterizar estruturas O-glicano individuais 13,19. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

A combinação da eliminação de β redutora em gel com a extração orgânico-aquosa aumenta a sensibilidade e a profundidade dos dados estruturais que podem ser adquiridos para caracterizar glicanos ligados a O sulfatados e não sulfatados colhidos de pequenas quantidades de glicoproteínas do tipo mucina resolvidas de outras proteínas por SDS-PAGE. Os avanços essenciais das abordagens técnicas apresentadas neste estudo são: (a) remoção fácil de contaminantes derivados de gel por etapas simples de lavagem; b) Recuperação quanti...

A glicosilação é uma modificação essencial de proteínas pós-tradução, contribuindo para a fisiologia do organismo, a patologia do tecido, e reconhecimento celular 1-3. Apesar dos grandes avanços na glycoscience analítica, caracterizando a diversidade completa de glicanos em uma proteína específica continua a ser uma tarefa extremamente desafiadora, especialmente em proteínas isoladas de fontes biológicas primárias. No entanto, o microheterogeneidade de glicanos glicoproteína freqüentemente afeta as interações funcionais com outras proteínas. Portanto, a caracterização da diversidade de glicano é essencial para compreender o significado fisiológico de 4,5 glicosilação celular e tecidual. A fim de compreender a contribuição de glicoproteína de glicosilação para a fisiologia e patofisiologia tecido, robusto, sensível e técnicas analíticas glycomic abrangentes tornaram-se cada vez mais importante. Na análise proteômica, identificações de proteína são geralmente alcançado por LC-MS/ MS de péptidos trípticos 6. Digestão de proteínas pode ser realizada utilizando uma proteína ou proteínas purificadas resolvidas por SDS-PAGE após digestão em gel com proteases tais como tripsina 7-9. Pré-enriquecimento da mistura de proteína por SDS-PAGE aumenta a profundidade e precisão de identificação de proteínas. O desenvolvimento de estratégias análogas para análise glycomic de glicoproteína glicosilação se encontra na vanguarda da glycoscience. As duas principais classes de glicanos estão ligados a espinha dorsal de proteínas, quer através de ligação ou N-O-ligação. Glicanos ligados a N estão ligados a asparagina (Asn) resíduos encontrados como parte de um sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X é qualquer aminoácido excepto prolina), e pode ser libertado por digestão enzimática com N pï¿½tido -glycanase (PNGaseF ou A), quer em solução, em gel, ou sobre-blot 10-12. Glicanos ligados a O estão ligados principalmente a serina (Ser) ou treonina (Thr) resíduos. No entanto, apenas uma enzima foi idenficada que é capaz de libertar os glicanos ligados em O de glicoproteína e tem uma especificidade de glicano extremamente limitada, libertando apenas os glicanos ligados em O mais simples. Estratégias de liberação química continuam sendo o método de escolha para a liberação completa de glicanos ligados em O de glicoproteínas. Β-eliminação redutiva ou não-redutora, ou hidrazinólise são técnicas de liberação química bem caracterizados e são atualmente as abordagens mais comumente usadas para a liberação glicanos ligados em O de glicoproteínas 13,14. Embora β-eliminação redutiva foi usado para libertar os glicanos ligados em O a partir de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, as abordagens anteriores necessária separação por HPLC para análise subsequente 15-17. Análise multidimensional MS (MS n) fornece atualmente a mais rica fonte de dados estruturais para a caracterização de glicanos libertados de glicoproteínas isoladas nos valores esperados da maioria das fontes biológicas. A profundidade da EMcaracterização estrutural baseado é muito facilitada por permethylating os glicanos divulgados antes da sua análise. Permetilação aumenta ionização e tende a igualar as respostas sinal molares através de uma ampla gama de estruturas de glicano 18,19. Além disso, permetilação inequivocamente Tag metades monossacarídeos terminais e substituídos com massas distintas, aumentando assim elucidação estrutural 20-23. Por exemplo, glicanos ácidas são geralmente difíceis de detectar, como espécies não permetilado por MS. Embora glicanos ácidas pode ser detectado no modo de iões negativos por MS, é impossível detectar ambos os glicanos ácidas e neutras no mesmo modo de ião. Uma grande vantagem do permetilação glicano é que todos os grupos hidroxilo livres (OH) em substituintes de monossacárido de um glicano vai ser tapado com um grupo metilo (OCH3 ou OMe), assim taxas de sialilados de glicano são neutralizados, tornando-os como detectável como permetilado neutro (ásialo) glicanos. No entanto, os hidroxilos de metades de sulfato em sulfoglycans são resistentes a permetilação, resultando na retenção de carga aniónica, o qual suprime a ionização e diminui a sensibilidade. Esta supressão impede actualmente análise glycomic abrangente de glicoproteínas muito complexas tais como mucinas, que carregam uma alta abundância de glicanos sulfatados 24-26. As recentes notícias sobre purificação sulfatada glicanos usado cobrado, cromatografia de fase reversa para purificar e glicanos permetilado separados antes da análise MALDI. Este método baseia-se na separação completa de glicanos sulfatados e não sulfatados com diferentes fases móveis para a eluição, o que temos encontrado para ser menos rigorosas do particionamento fase orgânica. Portanto, as novas técnicas adequadas para a detecção e enriquecimento de sulfoglycans são apresentados aqui. Estas técnicas permitem a recuperação quantitativa de glicanos sulfatados na fase aquosa de água seguinte: DCM (diclorometano)de extracção, que é realizado rotineiramente no final de reacções de glicano 27 permetilação. É importante ressaltar que esta separação robusto de sulfoglycans permetilado partir de uma mistura de glicanos não-sulfatados permetilado enriquece concomitantemente para espécies carregadas ao mesmo tempo, simplificando MS dois padrões de fragmentação. Também é apresentado um protocolo global para melhorar a análise de glicanos ligados-O em-gel. O protocolo melhorado aumenta a recuperação de glicano, aumenta a informação estrutural obtida através de análise de MS n glicanos permetilado, e melhora a sensibilidade das análises sulfoglycomic aplicadas às glicoproteínas essenciais isolados a partir de fontes biológicas. Este protocolo destina-se a análise de glicano ligado em O de extractos de glicoproteínas integrais ou de uma glicoproteína específica de interesse resolvidas por SDS-PAGE e é composto por três procedimentos experimentais; A) gel de limpeza, B) redutora β-eliminação em gel, e C) permethy glycanlação. O objectivo é a obtenção de dados glycomic ligados a O abrangentes para glicoproteínas colhidas a partir de fontes primárias de interesse biológico (Figura 1). As glicoproteínas separadas por SDS-PAGE são visualizadas por coloração e as bandas de interesse são excisadas e a banda de gel resultante é cortado em pequenos pedaços. Os pedaços de gel são descorado e sujeito a lavagens de acetato de etilo para remover contaminantes de gel (Figura 2A). Libertação de glicano é conseguida por eliminação redutiva β-em-gel (Figura 2B) e os glicanos libertados são permetilado. Aquoso-orgânico de extracção seguinte permetilação quantitativamente particiona os aniónicos sulfatados glicanos longe de glicanos neutros não-sulfatados (Figura 2C). Em gel de redutiva-β-eliminação acoplado a extracção aquosa-orgânica permite a caracterização e de glicanos ligados em O sulfoglycans libertados a partir de pequenas quantidades de glicoproteína separadas por SDS-PAGE. A visão estratégica é summarized na Figura 1 e os detalhes estão apresentados na Figura 2. Além disso, uma porção dos pedaços de gel descorado e lavados pode ser utilizada para identificação da proteína por técnicas de proteómica LC-MS / MS padrão.

<table><tbody><tr><td>Água, água deionizada</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>270733-4L</td><td>CHROMASOLV, para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido acético, Glacial</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td>Certificado ACS &ge; 99,7% p/p</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34860-4L-R</td><td>CHROMASOLV, para HPLC, &ge; 99,9%</td></tr> <tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Fluka</td><td>09830-500G</td><td>BioUltra, &ge; 99,5% (T), Etapa 1</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34998-4L</td><td>CHROMASOLV Plus, para HPLC, &ge; 99,9%, Etapa 1</td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>Fluka</td><td>34972-1L-R</td><td>LC-MS CHROMASOLV, Etapa 1</td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio</td><td>Aldrich</td><td>213462-25G</td><td>ReagentPlus, 99%, Etapa 2</td></tr><tr><td>Iodometano</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>289566-100G</td><td>ReagentPlus, 99,5%,&nbsp; Passo 6.&nbsp; Armazene a 4 &deg; C até o uso.&nbsp; Sente-se em temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio, 50% p/p</td><td>Certificado Fisher</td><td>SS254-1</td><td>, Etapa 6</td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido, anidro</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>276855-1L</td><td>Anidro, &ge; 99,9%, Etapa 6</td></tr><tr><td>Metanol, anidro</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>322415-100ML</td><td>Anidro, 99,8%, Etapa 6</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34856-4L</td><td>CHROMASOL&reg;, para HPLC, &ge; 99,8%, contém amileno como estabilizador, Etapa 7</td></tr><tr><td>Forma de hidrogênio Dowex 50WX8 forma de hidrogênio 100-200&nbsp; malha</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>217506-500G</td><td>Step 3</td></tr><tr><td>AG 50W-X8 Resina&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Passo 3</td></tr><tr><td>BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Coluna de Extração em Fase Sólida, PP, Octadecil (C18) Fase Reversa</td><td>JT Baker</td><td>JT-7020-01</td><td>Passo 5 e 8</td></tr><tr><td>7.5% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Passo 1</td></tr><tr><td>Bio-Safe Coomassie Stain&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td>G-250, Kit de</td></tr><tr><td>Coloração de Prata Passo 1 para Espectrometria de Massa</td><td>Pierce</td><td>24600</td><td>Kit</td></tr> de <tr><td>Oligossacarídeos Etapa 1 (Maltotriose, Dp3: R474140)</td><td>Supelco&nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Oligossacarídeos (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td><td>Supelco&nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur Descartáveis, Vidro, Ponta Curta</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Lavar antes de usar</td></tr><tr><td>PYREX 13 x 100 mm Tubos de Cultura Roscados de Fundo Redondo Descartáveis</td><td>Corning</td><td>99447-13</td><td>Lavar antes de usar</td></tr><tr><td>PYREX 16 x 125 mm Tubos de Cultura Roscados de Fundo Redondo Descartáveis</td><td>Corning</td><td>99447-16</td><td>Lavar antes</td></tr><tr><td>de usar Tampas/Fechos Fenólicos com Revestimento de Borracha Revestido com PTFE</td><td>Kimble</td><td>45066C-13</td><td>Lave antes de usar</td></tr><tr><td>Tampas/Fechos Fenólicos com Revestimento de Borracha Revestido com PTFE</td><td>Kimble</td><td>45066C-15</td><td>Lave antes de usar</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton HPLC</td><td>HAMILTON</td><td>81265</td><td>volume 500&nbsp; &mu; l, tamanho da agulha 22 G</td></tr><tr><td>Seringa HPLC Hamilton</td><td></td><td>HAMILTON 81165</td><td>volume 250&nbsp; &mu; l, tamanho da agulha 22 G</td></tr><tr><td>Seringa HPLC Hamilton</td><td></td><td>HAMILTON 81065</td><td>volume 100&nbsp; &mu; l, tamanho da agulha 22s G</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton HPLC</td><td>HAMILTON</td><td>80965</td><td>volume 50&nbsp; &mu; l, tamanho da agulha 22s G</td></tr><tr><td>Seringas Calibradas Hamilton</td><td>HAMILTON</td><td>80300</td><td>volume 10&nbsp; &mu; l, tamanho da agulha 26s G</td></tr><tr><td>Placa de Petri Vidro 100 mm x 15mm</td><td>GSC INTERNATIONAL INC</td><td>1500-4</td><td>Lave antes de usar, Etapa 1</td></tr><tr><td>Lâminas Cirúrgicas Bard-Parker</td><td>Fisher</td><td>371310</td><td>Etapa 1</td></tr><tr><td>Módulo de Aquecimento/Agitação Reacti-Therm</td><td>Pierce</td><td>18870</td><td>Etapa 1, 4 e 7</td></tr><tr><td>Blocos de Aquecimento</td><td>Fisher</td><td>125D</td><td>Etapa 2</td></tr><tr><td>Pyrex fibra de vidro borosilicato tamanho dos poros 8&nbsp; &mu; m</td><td>Aldrich</td><td>CLS3950</td><td>Step 3 Cortador</td></tr><tr><td>de Sílica FundidaCortador de tubos</td><td>alltech</td><td>3194</td><td>Step 3</td></tr><tr><td>Multi-tube vortexers&nbsp;</td><td>VWR</td><td>444-7063</td><td>Etapa 6</td></tr><tr><td>Liofilizador 25EL Freezemobile</td><td>Virtis</td><td>25EL</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>VWR</td><td>Clinical 50</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Discovery</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

melhorou em-gel redutivas β-eliminação para comprehensive o-ligados e sulfo-glycomics por espectrometria de massa

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

A separação de proteínas por SDS-PAGE seguida pela digestão proteolítica em gel de bandas de proteínas resolvidas produziu análise proteômica de alta resolução de amostras biológicas. Abordagens semelhantes, que permitiriam uma análise aprofundada dos glicanos transportados por glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE, requerem considerações especiais para maximizar a recuperação e a sensibilidade ao usar a espectrometria de massa (MS) como método de detecção. Um grande obstáculo a ser superado na obtenção de dados de alta qualidade é a remoção de contaminantes derivados de gel que interferem na análise de EM. O fluxo de trabalho da amostra apresentado aqui é robusto, eficiente e elimina a necessidade de limpeza de HPLC em linha antes da EM. Pedaços de gel contendo proteínas-alvo são lavados em acetonitrila, água e acetato de etila para remover contaminantes, incluindo fragmentos de acrilamida polimérica. Os glicanos ligados ao O são liberados das proteínas-alvo por eliminação de β redutora no gel e recuperados por meio de procedimentos de limpeza robustos e simples. Uma vantagem desse fluxo de trabalho é que ele melhora a sensibilidade para detectar e caracterizar glicanos sulfatados. Esses procedimentos produzem uma separação eficiente de glicanos permetilados sulfatados de glicanos permetilados não sulfatados (sialilados e neutros) por uma rápida partição de fase antes da análise de MS e, assim, aprimoram as análises glicômicas e sulfoglycomic de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE.

Efeito de acetato de etilo Tratamento Antes de Na-gel redutiva β-Eliminação Um espectro de massa representativo do permetilado amostras de glicano ligadas em O libertados de bovino usando mucina redutiva β-eliminação no-gel é mostrado na Figura 3. A lavagem de EtOAc dos pedaços de gel de SDS e remove eficazmente poliacrílicos contaminantes que interferem com a subsequente análise por MS 27. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

A fim de explorar de forma abrangente a diversidade de glicanos ligados a O, um novo procedimento para eliminação de β redutora em gel, combinado com permetilação e um método de partição rápida de fase, é aplicado à análise de glicanos ligados a O diretamente liberados de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE e passíveis de análise glicômica subsequente por espectrometria de massa.

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

improved-gel-reductive-elimination-for-comprehensive-o-linked-sulfo

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

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