Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste procedimento é colher glicanos Olink. Isso é feito resolvendo primeiro as glicoproteínas pela página SDS. O segundo passo é lavar as peças de gel contendo a glicoproteína de interesse.

Em seguida, os glicanos olink são liberados por eliminação beta redutiva. A etapa final é o glicano por metilação com partição de fase. Em última análise, os glicanos metilados permanentes são analisados por espectrometria de massa em tandem para detectar estruturas e quantificar abundâncias.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a cromatografia líquida de alto desempenho, é que nosso método separa os glicanos neutros e carregados por metilados em uma partição rápida de fase. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ciência da glicociência, permitindo uma caracterização abrangente ou glicanos ligados liberados de glicoproteínas resolvidas. Antes de iniciar este procedimento, resolva as glicoproteínas usando eletroforese em gel.

Após a eletroforese, coloque o gel em uma placa de vidro e excise a região de interesse usando um bisturi limpo para aumentar o rendimento de glicanos OG. Transfira a banda de gel de interesse para outra placa de vidro e corte a peça em cubos de aproximadamente dois milímetros. Transfira os pequenos pedaços de gel para um tubo de vidro com tampa de rosca de 13 por 100 milímetros com uma espátula micros de aço inoxidável.

Em seguida, adicionar um mililitro de bicarbonato de amónio 25 milimolares ou ambi ao tubo de amostra. Depois de tampar o tubo com uma tampa de rosca de linha de Teflon, misture suavemente o conteúdo sacudindo o tubo antes de deixá-lo repousar por 10 minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o ambit do tubo de vidro.

Usando uma pipeta de pasto ou vidro, adicione um mililitro de aceto nitrilo ao tubo de vidro para cobrir completamente os pedaços de gel. Depois de tampar o tubo, misture delicadamente o conteúdo sacudindo o tubo antes de deixá-lo repousar por 10 minutos. Quando terminar, remova o aceto nitrilo do tubo de vidro.

Depois de repetir os passos anteriores até que a cor azul brilhante seja eliminada, adicione dois mililitros de acetato de etila e tampe novamente o tubo. Coloque o tubo a quatro graus Celsius durante a noite com agitação de ponta a ponta. Uma vez removida a lavagem com acetato de etila, execute três lavagens com dois mililitros de água deionizada.

Depois que os pedaços de gel estiverem secos, adicione 500 microlitros de uma solução de hidróxido de sódio a 100 milimolares. E vamos ficar de três a cinco minutos no gelo para equilibrar o gel com as condições básicas que aumentam a recuperação de glicanos. Em seguida, adicione 500 microlitros de dois borohidreto de sódio molar em hidróxido de sódio 100 milimolar, resultando em concentrações finais de um borohidreto molar de sódio em hidróxido de sódio 100 milimolar.

Depois de misturar suavemente o tubo, incube a amostra a 45 graus Celsius por 18 horas. Durante a primeira hora de incubação, misture suavemente o tubo a cada 15 minutos. Depois que a reação de eliminação beta estiver completa e o tubo tiver sido colocado no gelo, adicione lentamente 10% de ácido acético gota a gota.

Para neutralizar a base, agite suavemente o tubo de amostra entre as adições de ácido acético, centrifugue o tubo para eliminar bolhas e evitar derramamento, se necessário. Para fazer uma pequena coluna de vidro, arranhe e quebre a ponta de uma pipeta de pasto ou vidro usando um cortador de cerâmica para que o cone da ponta da pipeta tenha aproximadamente um centímetro de comprimento. Depois de separar um tampão de lã de vidro, empurre-o em direção à ponta, formando um suporte para o leito de resina.

Prenda a coluna da pipeta com um alfinete e coloque sobre um tubo de ensaio de vidro. Em seguida, lave a pipeta vazia contendo lã de vidro com um mililitro de metanol e três mililitros de ácido acético a 5%. Após o giro da pasta de resina de troca catiônica de hidrogênio Dow X em ácido 5% acético.

Transfira o suficiente para produzir um volume de leito de um mililitro na coluna de pipeta de pastagem, enxágue a coluna usando cinco volumes de ácido acético a 5%, verificando o fluxo para o aparecimento de partículas de resina. Depois de colocar a coluna sobre um novo tubo de vidro com tampa de rosca de 16 por 125 milímetros, carregue a amostra na coluna. Uma vez coletado o fluxo, eluir glicanos com pelo menos três volumes de ácido acético a 5% no mesmo tubo.

Após a liofilização, adicione 300 microlitros de ácido acético a 10% em metanol ao tubo de amostra seco. Após o vórtice, remover o trimetilbato resultante por evaporação sob uma corrente de azoto a 37 graus Celsius. Depois de repetir as etapas de ressuspensão e secagem pelo menos quatro vezes, reconstitua a amostra em ácido acético a 5%.

Uma vez que a amostra tenha sido carregada em uma coluna C 18 equilibrada, colete o fluxo em um tubo de tampa de rosca de vidro de 13 por 100 milímetros. Eluva os glicanos OOG com três mililitros de ácido acético a 5% no mesmo tubo. Em seguida, liofilize a amostra para preparar o reagente de base para metilação permanente.

Adicione 400 microlitros de hidróxido de sódio a 50% a um tubo de vidro limpo de 13 por 100 milímetros. Em seguida, adicione 800 microlitros de metanol anidro ao mesmo tubo. Adicione quatro mililitros de óxido de dimetilsulfa anidro e vórtice para gerar um precipitado branco.

Centrifugue a amostra a 600 vezes G por um minuto para granular o precipitado. Depois de descartar o sobrenadante e adicionar quatro mililitros de óxido de dimetilsulfa anidro ao vórtice de pellets, o reagente Repita mais quatro vezes até que a pasta de base se torne translúcida. Dissolva a base peletizada em três mililitros de óxido de dimetilsulf anidro e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de pastagem limpa.

Em seguida, adicione 200 microlitros de óxido de dimetilsulf anidro à amostra seca e ao vórtice. Para suspendê-lo novamente, adicione 300 microlitros da pasta de base ressuspensa à amostra e adicione imediatamente 100 microlitros de metano ITOM. Sele o tubo com uma tampa forrada de Teflon e misture vigorosamente por cinco minutos em vórtice.

Para interromper a reação de metilação permanente, coloque o tubo no gelo e adicione dois mililitros de ácido acético a 5%. Após o vórtice, pipetar a solução cinco vezes para cima e para baixo para reduzir o volume restante de metano ITOM por evaporação. Neste ponto, adicione dois mililitros de di clorometano à amostra após vórtice e centrifugação.

Transfira a camada aquosa superior para um novo tubo de vidro de 13 por 100 milímetros. Depois de repetir a lavagem aquosa da camada de di clorometano, combinar a segunda fase aquosa com a primeira camada aquosa. Uma vez repetida duas a três vezes a lavagem com água da fase diclorometano, transferir a fase di clorometano para um tubo de vidro limpo com uma pipeta de pastagem limpa.

Em seguida, seque a fase orgânica sob uma corrente de nitrogênio a 42 graus Celsius. Depois e equilibrando uma coluna C 18 e carregando a camada aquosa sobre ela. Lave a coluna C 18 com água e, em seguida, elua os glicanos de o sulfatados metilados permanentes em um novo tubo de vidro com dois mililitros de glicanos OG metilados a 50% de aceto por infusão direta em um espectrômetro de massa apropriado usando uma fonte de nano eletrospray a uma taxa de fluxo de seringa de 0,4 a 0,6 microlitros por minuto a 210 graus Celsius.

A temperatura capilar para fragmentação por dissociação induzida por colisão em MSM S e MS multidimensional de um instrumento de armadilha de íons aplica espectros de massa representativos de energia de colisão de 30 a 40% de amostras de glicano olink metilado permanentemente liberadas da mucina bovina usando eliminação beta redutora ingel são mostradas aqui no painel superior. Os espectros são dominados por um contaminante polidisperso derivado do gel de poliacrilamida. O painel inferior demonstra que a lavagem com acetato de etila das peças de gel antes da eliminação beta elimina esse problema.

Os glicanos oinked foram liberados da mucina submaxilar bovina pela eliminação beta redutora de Ingel usando pedaços de gel que foram cortados em fatias pequenas ou grandes. A recuperação de glicanos oinked de pequenos pedaços de gel foi quase dez vezes maior do que de grandes fatias de gel. Os glicanos metilados permanentes neutros são recuperados na fase di clorometano orgânico.

Enquanto os glicanos metilados permanentes onic são quantitativamente particionados na fase aquosa. A eficiência e a simplicidade do método de partição de fase facilitam muito o rendimento da amostra e as abordagens analíticas subsequentes. Os glicanos de O metilados permanentes não sulfatados foram recuperados da fase orgânica, e todos os sul-glicanos metilados de perm foram recuperados da fase aquosa, o que facilita a identificação e caracterização de glicanos sulfatados e não sulfatados quase isóbaros.

Esses glicanos diferem em apenas 0,1 unidades de massa e seriam difíceis de resolver sem separar fisicamente as duas espécies por partição de fase após seu desenvolvimento. Essa técnica permitiu uma exploração completa da diversidade de glicanos em amostras de tecido, células cultivadas, sistemas modelo e amostras de pacientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como palmar e particionar com sucesso todos os glicanos ligados liberados das proteínas gli.

Resolvido pela página SDS.